Summary
ويمكن الاستدلال على فيروس نقص المناعة البشرية من المنطقة tropism V3 من المغلف الفيروسية. V3 هو تضخيم PCR من ثلاث نسخ باستخدام المتداخلة RT - PCR ، متسلسلة ، وتفسيرها باستخدام البرمجيات بيوينفورمتيك. وتصنف مع عينات مع تسلسل 1 أو أكثر (s) مع عشرات g2P منخفضة غير R5 الفيروس.
Abstract
خلفية : قبل حصوله على المخدرات من فئة CCR5 - المتناحرين في علاج فيروس نقص المناعة البشرية ، يجب على المريض الخضوع لاختبار فيروس نقص المناعة البشرية tropism للتأكد من أن له أو لها السكان الفيروسية يستخدم coreceptor CCR5 لدخول الخليوي ، وليس coreceptor البديلة. نهج واحد لاختبار tropism هو دراسة تسلسل المنطقة V3 من المغلف فيروس نقص المناعة البشرية ، والتي تتفاعل مع coreceptor.
يتم استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من بلازما الدم : الأساليب. يتم تضخيمه في المنطقة V3 في ثلاث نسخ مع متداخلة عكس المنتسخة - PCR. والتسلسل ثم التكبير وتحليلها باستخدام البرنامج ، RE_Call. ثم تقدم متواليات لخوارزمية بيوينفورمتيك مثل geno2pheno لاستنتاج tropism الفيروسية من المنطقة V3. ويستدل على أن يكون تسلسل غير R5 إذا بهم geno2pheno معدل ايجابية كاذبة ينخفض 5.75 ٪. إذا تم الاستدلال على أي واحد من ثلاثة من متواليات عينة غير قابلة للR5 ، والمريض من غير المرجح أن يستجيب لCCR5 - المتناحرين.
Protocol
الإجراء :
1. استخراج :
هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 500 ميكرولتر من بلازما الدم كمدخل العينة لهذا الاختبار الوراثي tropism فيروس نقص المناعة البشرية.
- استخراج الحمض النووي الريبي من فيروس نقص المناعة البشرية 500μL البلازما باستخدام (bioMérieux) مستخرج easyMAG الآلي ، أو الأسلوب المفضل لاستخراج المختبر الخاص بك.
أزل الحمض النووي الريبي المستخرج الفيروسية في قسامة 60 ميكرولتر. المحل في -20 درجة مئوية أو تبدأ عكس المنتسخة - PCR مباشرة بعد استخراج.
2. RT - PCR :
سوف تتضخم 4μL لاستخراج عينة من ثلاث نسخ باستخدام المتداخلة RT - PCR الأساليب. يجب تعيين تفاعل RT - PCR في غرفة PCR - نظيفة.
- حساب كمية كاشف اللازمة لعدد من العينات المراد توسيعها. اتبع الجدول أدناه يبين حجم الكاشف : 1 رد الفعل.
حجم الجدول الكاشف 1. المطلوبة : 1 تفاعل PCR RT خطوة واحدة.الكاشف الحجم (ميكرولتر)
(1X رد فعل)المياه المعالجة DEPC 10.56 2X رد فعل العازلة 20 50 ٪ سكروز و 0.04 ٪ مزيج الأزرق bromophenol 4 إلى الأمام التمهيدي التي تستهدف المنطقة V3 فيروس نقص المناعة البشرية 0.32 عكس التمهيدي 0.32 انزيم -- مرتفع الثالث من خطوة واحدة RT - PCR النظام مع البلاتين البلمرة DNA طق 0.8 مجموع 36
كل خطوة واحدة RT - PCR تفاعل يتطلب وصفة التالية :- 10.56 ميكرولتر DEPC المياه المعالجة
- 20 ميكرولتر من رد فعل العازلة 2X
- 4μL السكروز 50 ٪ و 0.04 ٪ مزيج الأزرق bromophenol
- 0.32 ميكرولتر من التمهيدي الى الامام التي تستهدف المنطقة V3 فيروس نقص المناعة البشرية
- 0.32 ميكرولتر من التمهيدي العكسي
- 0.8 ميكرولتر من أنزيم
- حتى خط أنابيب استخراج عينة في صف واحد بجانب فارغة ، المسمى كذلك لوحة 96 - PCR.
- باستخدام ماصة مكرر ، إضافة 36 ميكرولتر من مزيج العينة إلى كل بئر من لوحة PCR ، مثل أن هناك 3 الآبار المعدة لاستخراج كل عينة.
* ملاحظة : يجب تنفيذ هذا الإجراء في ثلاث نسخ ، على الأقل ، لضمان أخذ عينات كافية من السكان الفيروسية. - باستخدام ماصة 8 قنوات متعددة ، إضافة لاستخراج عينة 4μL إلى كل من الآبار 3 الخمسين. نصائح تغيير بين كل إضافة.
- تغطية الآبار مع قبعات الشريط PCR.
- عندما يتم نقل comlete ، وضع لوحة في thermocycler PCR. تعيين thermocycler لتشغيل مع البرنامج التالي : 30 دقيقة عند 52 درجة مئوية في 2 دقيقة 94 درجة مئوية 40 دورات (15 ثانية في 94 درجة مئوية ، 30seconds عند درجة حرارة 55 مئوية و 1.5 دقيقة عند 68 درجة مئوية) 5 دقائق عند 68 درجة مئوية
- إزالة لوحة من thermocycler PCR. يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لوحة.
انتقل إلى الخطوة الثانية الجولة PCR
3. الجولة الثانية PCR :
- حساب كمية كاشف اللازمة لعدد من العينات المراد توسيعها. اتبع الجدول أدناه يبين حجم الكاشف : 1 رد الفعل.
الجدول 2. الكميات المطلوبة لالكاشف 1 من 2 تفاعل PCR الجولة الثانية.الكاشف الحجم (ميكرولتر)
(1X رد فعل)المياه المعالجة DEPC 13.45 60 ٪ سكروز ، 0.08 ٪ مزيج الأحمر كريسول 2 روش هاي فاي نظام الاحتياطي 2 2 MgCl 2 0.8 dNTP 0.16 إلى الأمام PCR التمهيدي 0.15 عكس PCR التمهيدي 0.15 توسيع فاي انزيم 0.29 مجموع 19
كل ثانية تفاعل PCR الدور يتطلب وصفة التالية :- 13.45 ميكرولتر DEPC المياه المعالجة
- 2 ميكرولتر السكروز 60 ٪ ، 0.08 ٪ مزيج الأحمر كريسول
- 2 ميكرولتر من الاحتياطي روش نظام هاي فاي 2
- 0.8 ميكرولتر من 25 ملم MgCl 2
- 0.16 ميكرولتر من dNTP 25 مم
- 0.15 ميكرولتر كل من الاشعال إلى الأمام وعكس PCR
- 0.29 ميكرولتر انزيم فاي توسيع
- في آخر الغرفة التضخيم ، وذلك باستخدام ماصة 8 قنوات متعددة ، ونقل 1 ميكرولتر من القالب RT - PCR PCR العازلة في الجولة الثانية. نصائح تغيير بين كل إضافة.
- تغطية الآبار مع القبعات ونقل الشريط PCR PCR لوحة الجولة الثانية لthermocycler.
- تعيين thermocycler لتشغيل مع البرنامج التالي : 2 دقيقة 94 درجة مئوية في دورات من 35 (15 ثانية في 94 درجة مئوية و 30 ثانية عند درجة حرارة 55 مئوية ، 1 دقيقة عند 72 درجة مئوية) 7 دقائق عند 72 درجة مئوية
- إزالة لوحة من thermocycler بعد درجة الحرارة قد عادت الى 25 درجة مئوية.
4. هلام إستشراد :
من أجل تأكيد أنه تم تضخيم V3 المنطقة بنجاح ، يتم تنفيذ خطوة هلام إستشراد.
- يعد agarose هلام مع 0.8 غرام من مسحوق agarose في 50 مل من الاحتياطي تاي 1X. اثارة وتذوب في الميكروويف لمدة دقيقة 1 ~ أو حتى يذوب تماما agarose.
- إضافة 6 ميكرولتر من هلام SYBR آمنة وصمة عار في دوامة المزيج.
- من أجل الحل في علبة هلام ، وإضافة ما يكفي من هلام أمشاط لاستيعاب عدد من الآبار PCR.
- بمجرد أن يجف الجل ، إزالة أمشاط ووضع جل جل في الجهاز ، والتأكد من الغارقة تماما في 1X TAE العازلة.
- باستخدام ماصة الأقنية 10 ميكرولتر ، إضافة 8μL من كل عينة إلى جانب PCR الخاصة به في هلام. تغطية لوحة PCR بعد أن أضيفت الى التكبير هلام.
- إضافة 6 ميكرولتر من سلم ال DNA واحدة على الأقل بشكل جيد لكل صف.
- تشغيل الجهاز في هلام 100V ~ ~ لمدة 10 دقائق ، والتأكد من أن العصابات لا تعمل قبالة هلام.
- وضع الجل في الصعود إلى منار العابرة للأشعة فوق البنفسجية والتقاط صورة من هلام.
سوف الآبار مع PCR - تضخيم الحمض النووي تظهر الضوء ، مما يشير إلى نجاح التضخيم. - علما جعل جميع العينات فيها ثلاثة التكبير والنجاح. إذا لزم الأمر ، كرر RT - PCR لتلك العينات مع أقل من 3 التكبير.
انتقل إلى التسلسل
5. التسلسل :
بعد أن تضخمت الفيروسية [كدنا] ، يمكن أن تكون على استعداد لعينات التسلسل. ينبغي للتفاعل التسلسل تجري في غرفة ما بعد التضخيم.
- إزالة BigDye من الفريزر والاشعال التسلسل من الثلاجة. السماح للذوبان BigDye في درجة حرارة الغرفة ، لمدة لا تزيد 1 ساعة.
- حساب كمية كاشف اللازمة لعدد من العينات ليتم تشغيلها. اتبع الجدول أدناه يبين حجم الكاشف : 1 رد الفعل.
حجم الجدول الكاشف 3. المطلوبة : 1 تفاعل التسلسل.الكاشف الحجم (ميكرولتر)
(1X رد فعل)BigDye 0.3 BigDye العازلة 2.1 كتاب تمهيدي 2.6 مجموع 5.0
* ملاحظة : تحضير مزيج منفصلة لكل التمهيدي.
** ملاحظة : يمكن أن تكون على استعداد لاستخدام الاحتياطي BigDye في تفاعل التسلسل على النحو التالي : ميكس 17.5 مل من محلول هيدروكلوريد Trizma العازلة (1 م) (pH9.0) و 0.125 مل من كلوريد المغنيسيوم (1 M). جلب الحجم النهائي إلى 100 مليلتر من الماء الصف كاشف. يجب أن يتم تخزينها في هذا 2-8 درجة مئوية. - استخدام العمليات الحسابية من 3.3 ، وإعداد رد فعل التسلسل يمزج لكل التمهيدي ودوامة لمدة لا تتجاوز 5 ثوان. قسامة في أنابيب الشريط 0.2mL.
- قسامة 5 ميكرولتر من التسلسل مزيج التفاعل في الآبار لوحة المناسبة باستخدام ماصة الأقنية. تغطية لوحة (ق) التي تحتوي على مزيج تسلسل تفاعل مع Kimwipe وتوضع جانبا.
- يعد التخفيف من الناتج 01:15 تضخيم PCR وذلك بإضافة 180 ميكروليتر من الماء المعقم باكستر للمنتج PCR المتبقية.
- ماصة 1 ميكرولتر من العينة المخففة إلى قاع الآبار لوحة المناسبة ، وتغيير نصائح ماصة.
- عند الانتهاء من نقل العينات ، وختم لوحة مع الشريط القبعات ودوامة ل1 ثانية
- وضع لوحة في جهاز للطرد المركزي. ضبط السرعة ل145g ، عندما تصل سرعة الدوران 145g ، والتوقف عن الدوران.
- وضع لوحة في thermocycler (ق) لتعيين البرنامج التالي : 25 دورات (10 ثانية @ 96 درجة مئوية ، 5 ثوانى @ 50 درجة مئوية و 55 ثانية @ 60 درجة مئوية...) الحجم يجب ان تكون على الاقل 6μL . وينبغي أن تأخذ دورة حوالي 1.2 ساعات.
انتقل إلى هطول الأمطار
6. الأمطار :
ب "تنظيف" [كدنا] الفيروسية في أعقاب رد الفعل التسلسل ، نفذ الأمطار الإيثانول باستخدام الايثانول 95 ٪.
- استرداد لوحة من thermocycler وتقديمهم إلى ampli بالوظائفfication الغرفة.
- إزالة الشريط القبعات ووضعها في النظام على منشفة ورقية نظيفة أو Kimwipe.
- ماصة 4μL من محلول العامل خلات الصوديوم EDTA ، إلى جانب كل عينة بشكل جيد. اضغط على لوحة بلطف حتى أن الحل الصوديوم EDTA - يسقط إلى قاع البئر. ويمكن استخدام نفس نصائح طالما أنها لا تتصل عينة في قاع البئر.
* ملاحظة : يمكن تحضير المحلول يعمل خلات الصوديوم EDTA ، على النحو التالي :- إعداد 3M خلات الصوديوم عن طريق إذابة 246،1 غراما من خلات الصوديوم في 1 لتر من الماء الصف كاشف. تصفية الحل عن طريق التصفية الدقيقة 0.45 وتجهيز 50 aliquots مل.
- تحضير ألبوم الحل خلات الصوديوم EDTA - (1.5 M NaOAc ، 250 مم EDTA) عن طريق خلط كميات متساوية من خلات الصوديوم (3 م) وحل EDTA (500 ملم) 8.0 درجة الحموضة.
- إعداد العمل EDTA - الصوديوم محلول خلات عن طريق خلط المرء لسهم جزء EDTA - الصوديوم مع محلول خلات ثلاثة أجزاء من الماء الصف كاشف (10 مل + 30 مل).
- 40μL ماصة للمبردة الايثانول 95 ٪ على أن الجانب الآخر من عينة الآبار واستبدال القبعات القطاع.
- ختم والقبعات ودوامة لوحة لمدة 10 ثانية. اضغط على لوحة لطرد أي فقاعات.
- وضع لوحة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة ، وبحد أقصى 2 ساعة.
- مرة واحدة حدث هطول الأمطار ، وإزالة لوحة من الثلاجة وضعها في جهاز الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3700 دورة في الدقيقة.
- إزالة كمية مناسبة من دي مرحبا ، Formamide (النظم البيولوجية التطبيقية) من الفريزر لتمكينه من ذوبان الجليد قبل تمسخ.
- بعد إزالة لوحة الغزل وتجاهل القمم القطاع. عكس لوحة فوق حاوية النفايات (مثل صندوق للقمامة) وطاف على صب. التخلص من أي طاف المتبقية النشاف لوحات مقلوبة على منشفة ورقية.
- 2 أضعاف ورقة من منشفة ورقية ومكان على سطح اللوحة. ضع وجهها إلى أسفل لوحة في أجهزة الطرد المركزي وتدور في 145g ، ووقف تدور عندما يصل إلى 145g.
- إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي والتحقق للتأكد من الآبار الفارغة. 155μL ماصة للمبردة الايثانول 95 ٪ في الآبار.
- تجاهل طاف في حاوية النفايات وصمة عار على منشفة ورقية وكرر الطرد المركزي في 4.10.
- عند إزالة لوحة من أجهزة الطرد المركزي ، ونبذ استخدام منشفة ورقية ، والسماح لوحة تقف مواجهة لمدة 2-5 دقائق للسماح أي الإيثانول المتبقية لتتبخر.
انتقل إلى تغيير طبيعة
7. تغيير طبيعة
- استرداد Formamide HiDi المذوبة وصب في وعاء كبير بما فيه الكفاية لماصة الأقنية ،
* ملاحظة : إذا كنت تستخدم قبل aliquoted التدابير كما لوحظ في 6.7b ، مطلوب أنبوب واحد عن كل لوحة 96 - جيدا ليتم تشغيلها. - باستخدام ماصة الأقنية ، وتوزيع 10μL من Formamide HiDi في جميع الآبار على لوحة ، بما في ذلك تلك التي هي فارغة.
- تغطية صحن مع حصيرة الحاجز على شكل خاتم.
- وضع لوحة في thermocycler في 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- تمسخ التالية ، وضع لوحة في حامل لوحة ثم تحميل في التسلسل. إيداع تخطيط تسلسل المعدة. يمكن أن تبقى في لوحات -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل تنفيذ تشغيل التسلسل.
8. تحليل البيانات الناتجة باستخدام قاعدة برامج الاتصال.
- يذكر باستخدام قاعدة تنفيذ التلقائي الاتصال مع أي تدخل بشري واحد ، تغطية التمهيدي هو مقبول. ولنتذكر هو استدعاء قاعدة العرف البرمجيات التي يمكن العثور عليها على العنوان التالي : http://pssm.cfenet.ubc.ca/
* ملاحظة : مطلوب حساب للدخول. لإنشاء حساب ، انقر فوق "سجل" الموجود في صفحة تسجيل الدخول. بمجرد إنشاء حساب يمكنك الوصول إلى صفحة التحميل. - عند دخولك ، قد قمت بتحديد الملفات عينة للتحميل. تصفح باستخدام الخيار يمكنك تحديد تسلسل البيانات الخاصة بك الخام للتحميل بأقصى قدر من تحميل 20MB.
* ملاحظة : نذكر ويب لن تقبل سوى ملفات البيانات والملفات وABI SCF في البريدي ، والقطران أو tar.gz الملف. - مرة واحدة وقد تم اختيار الملفات للتحميل ، واختيار التسلسل المرجعي الخاص بك. في هذه الحالة ، تأكد من تعيين تسلسل الإشارة إلى "V3". أنت الآن على استعداد لانقر فوق "البيانات العملية".
- وتظهر البيانات التي تتم معالجتها على الجانب الأيمن من الصفحة تحت عنوان "نماذج الماضي". سيتم وضع كل مجموعة أو تشغيل نموذج معالجتها في المجلد المسمى مع التاريخ. ويمكن إعادة تسمية هذه بالنقر على "إعادة تسمية" الزر.
- وبالنقر على مجلد إحضار قائمة من العينات. وقد فشلت تلك حمراء ، وتلك التي مرت الخضراء. بالنقر على عينة محددة و"عرض" الزر ، كنت قادرا على النظر في التسلسل. اتبع التعليمات التي تظهر على الجانب الأيمن من الصفحة للانتقال throuغ التسلسل.
* ملاحظة : للحصول على هذا الأسلوب ، هو مقبول لتصدير متواليات التي تمر نذكر (كما هو موضح باللون الأخضر) تلقائيا ، دون تدخل يدوي. - إذا كنت راضيا عن النتائج التي يمكن أن تختار لتحميل سلاسل تمرير بالنقر على "حمل". سيتم تحميل الملفات الموجودة في مجلد مضغوط.
* ملاحظة : في إطار "إعدادات" يمكنك تحديد خيارات التحميل والبريد الإلكتروني ، بما في ذلك النوع من الملفات. - وينبغي عدم reamplified عينات لانتاج متواليات ثلاث نسخ نظيفة في ثلاث نسخ من استخراجها. إذا فشل RePCR لتوفير تسلسل نظيفة ، والحد الأدنى من 2 متواليات مقبولة للاستخدام في الاستدلال tropism.
9. استنتاج Tropism الفيروسية من متواليات التي تم إنشاؤها بواسطة تسلسل عدد السكان استنادا به الرئيسان مستقبلات Geno2pheno الخوارزمية.
- يمكن تشغيل الخدمة من خلال تسلسل coreceptor geno2pheno على العنوان التالي : http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
- يمكن أن يكون المسمى لإيداع العينات كما تناسب المشاهدة. من القائمة المنسدلة لتحديد أهمية ، حدد "بقطع الأمثل على أساس تحليل البيانات السريرية من تحفيز (2 ٪ و 5،75 ٪ FPR)"
- اختيار لتحميل أو لصق تسلسل للتحليل ، الملفات fasta مقبولة.
- ويمكن تفسير FPR geno2pheno على النحو التالي : G2P FPR> 5.75 ممثلة للسكان R5 التي تستخدم الفيروسية ؛ المرجح للرد على الخصوم CCR5 G2P FPR <5.75 تمثيلية من السكان غير R5 الفيروسية ؛ المرجح للرد على الخصوم CCR5. G2P <2 من المستبعد جدا أن يكون أي رد على الخصوم CCR5. إذا تم الاستدلال على أي واحد من ثلاثة من متواليات عينة غير قابلة للR5 ، والمريض ليس من المرجح أن يستجيب لCCR5 - المتناحرين.
10. ممثل النتائج
عندما يتم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح وينبغي للمرء أن يتوقع أن تسلسل بنجاح أو 2 أو 3 مكررات لكل عينة. وينبغي أن تعمل جنبا إلى جنب مع عينات من السلبيات لا يوجد مؤشر على الحمض النووي الريبي. ينبغي أن الغالبية العظمى من متواليات "تمرير" basecalling التي تذكر.
على أساس توزيع R5 وغير R5 داخل السكان المجتمع الفيروسية ، يتوقع أن غالبية عينات من المرضى تم اختيارها عشوائيا لR5 التي تستخدم الفيروس. ما لم يكن ذلك في تصميم المشروع من شأنه أن توحي بغير ذلك ، ينبغي للمرء أن يتوقع أن يكون أكثر من غير R5 R5 العينات.
الجدول 1 ألف) وحدات التخزين المطلوبة : 1 كاشف رد فعل خطوة واحدة RT - PCR وباء) برنامج thermocycler اللازمة لتنفيذ رد فعل RT - PCR.
أ)
الكاشف | الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل) |
| المياه المعالجة DEPC | 10.56 |
| 2X رد فعل العازلة | 20 |
| 50 ٪ سكروز و 0.04 ٪ مزيج الأزرق bromophenol | 4 |
| SQV3F1 التمهيدي إلى الأمام | 0.32 |
| عكس التمهيدي CO602 | 0.32 |
| انزيم -- مرتفع الثالث من خطوة واحدة RT - PCR النظام مع البلاتين البلمرة DNA طق | 0.8 |
| مجموع | 36 |
* ملاحظة :
SQV3F1 تسلسل التمهيدي : 5 'CCA ATT GAG CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 تسلسل التمهيدي : 5 'دول مجلس التعاون الخليجي لجنة مناهضة التعذيب AGT GCT TGC TGC TCC TCC CAA GAA CC 3'
ب)
| عدد دورات | مرة | درجة الحرارة |
| 1 | 30minutes | 52 درجة مئوية |
| 1 | 2minutes | 94 درجة مئوية |
| 40 | 15seconds | 94 درجة مئوية |
| 30seconds | 55 درجة مئوية | |
| 1.5minutes | 68 درجة مئوية | |
| 1 | 5minutes | 68 درجة مئوية |
الجدول 2 ألف) وحدات التخزين المطلوبة : 1 كاشف تفاعل PCR الجولة الثانية وباء) برنامج thermocycler اللازمة لتنفيذ ثاني رد فعل PCR الجولة.
أ)
الكاشف | الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل) |
| المياه المعالجة DEPC | 13.45 |
| 60 ٪ سكروز ، 0.08 ٪ مزيج الأحمر كريسول | 2 |
| روش هاي فاي نظام الاحتياطي 2 | 2 |
MgCl | 0.8 | |
| dNTP | 0.16 |
| SQV3F2 التمهيدي إلى الأمام | 0.15 |
| عكس التمهيدي CD4R | 0.15 |
| توسيع فاي انزيم | 0.29 |
| مجموع | 19 |
* ملاحظة :
SQV3F2 تسلسل التمهيدي : 5 'CCA TGT دول مجلس التعاون الخليجي GCT GGT TTT فريق التنسيق العالمي في 3'
CD4R تسلسل التمهيدي : 5 'TCA TAT AAT CTT TCC CTC TTG CAA 3'
ب)
عدد دورات | مرة | درجة الحرارة |
| 1 | 2minutes | 94 درجة مئوية |
| 35 | 15seconds | 94 درجة مئوية |
| 30seconds | 55 درجة مئوية | |
| 1minute | 72 ° C | |
| 1 | 7minutes | 72 ° C |
الجدول 3 ألف) وحدات التخزين المطلوبة : 1 كاشف تفاعل التسلسل وباء) برنامج thermocycler اللازمة لتنفيذ رد فعل التسلسل.
أ)
| الكاشف | الحجم (ميكرولتر) (1X رد فعل) |
| BigDye | 0.3 |
| BigDye العازلة | 2.1 |
| كتاب تمهيدي إلى الأمام V3FO2F عكس SQV3R1 | 2.6 |
| مجموع | 5.0 |
* ملاحظة : لا تجمع بين أجهزة الاشعال ، وينبغي إعداد مزيج منفصلة لكل التمهيدي
V3O2F تسلسل التمهيدي : 5 'AAT AGY GTC ACA GTA الجهاز المركزي للمحاسبات TGT ACA C 3'
SQV3R1 تسلسل التمهيدي : 5 'TTC AAA GAA TCC CCT ACA ATT AAA 3'
ب)
عدد دورات | مرة | درجة الحرارة |
| 25 | 10seconds | 96 درجة مئوية |
| 5seconds | 50 درجة مئوية | |
| 55seconds | 60 درجة مئوية |
Discussion
الطريقة المعروضة هنا هي طريقة التسلسل القياسية المطبقة على اختبار tropism. التطبيق السريري لفيروس نقص المناعة البشرية المغلف حلقة V3 تسلسل للتنبؤ tropism الفيروسية وحتى وقت متأخر كان محدودا. وقد تبين أن هذا الأسلوب ، في تحليلات بأثر رجعي للمحاكمات (فييف الرعاية الصحية) maraviroc السريرية ، لتكون قادرة على قدم المساواة في الحد الأدنى للتنبؤ الفيروسي في tropism بالمقارنة مع غيرها من فحوصات التحقق من صحة استخدامها سريريا.
هناك العديد من الفوائد لأداء تحليل الوراثي من الحلقة V3 للتنبؤ tropism. أولا وأخيرا ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي منشأة بمعدات تسلسل العمليات ، زيادة كبيرة في الوصول وتقليل الفترة الزمنية اللازمة لاختبار tropism. في المقارنة ، يتم تنفيذ المظهري Trofile الحساسية الفحص المعزز (ESTA) (حرف واحد فقط العلوم البيولوجية) ، والتي كانت بمثابة معيار الذهب لاختبار tropism ، في مركز واحد في جنوب كاليفورنيا. مزايا إضافية تشمل متطلبات أقل من المواد ابتداء والحد الأدنى المطلوب تحميل البلازما الفيروسية 500copies/mL. كذلك ، فإن التكاليف التشغيلية لتشغيل الفحص الوراثي منخفضة نسبيا بالمقارنة مع تلك التي لفحص المظهري. استخدام البرمجيات نتذكر بشكل خاص يلغي الحاجة إلى استعراض التسلسل اليدوي ، الذي يميل إلى أن يكون جزءا من العمل المكثف يحلل التركيب الوراثي.
الطريقة المعروضة هنا واضحة إلى حد ما ، مع عدم وجود خطوة معينة أخرى تفوق في أهميتها. نحن لا نقترح تشغيل PCR والتسلسل في ثلاث نسخ لزيادة احتمالات الأنواع التقاط أقلية بين السكان الفيروسية لعينة. لا يمكن أن يؤديها يعيد أكبر من ثلاثة ، إلا أننا وجدنا أن كلا triplicates كفاءة وموثوق بها. علينا أيضا أن توحي باستخدام خطوة واحدة عكس المنتسخة PCR كيت (Qiagen) الذي ينفذ على حد سواء RT - PCR PCR وأول جولة في نفس رد الفعل مع الحفاظ على خصوصية وحساسية عالية.
Disclosures
P. ريتشارد هاريجان وتضارب المصالح مع الرعاية الصحية فييف ، Virco ، ميرك ، ابوت ، والسعي. ويرعى هذا الفيديو المقال فييف الرعاية الصحية.
Acknowledgments
وأيد تطوير هذا الفحص من خلال الرعاية الصحية فييف والمعاهد الكندية للأبحاث الصحية (CIHR) ومن خلال رئيس شركة جلاكسو سميث كلاين / CIHR في علم الفيروسات السريرية لهاريجان د.
الدعم المقدم من قبل شركة فايزر والرعاية الصحية فييف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | |||
| NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) |
| NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | ||
| Class II A2 biological safety cabinet | |||
| One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | |||
| DEPC-treated water | Ambion | cat. # 9922 | |
| SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | cat. # 1 759 078 | Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
| dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Group | cat. # 11969064001 | (100 mM) |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | cat. # S0389-500G | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-Aldrich | cat.# B5525 | |
| Cresol Red | Sigma-Aldrich | cat.# 114472-5G | indicator grade |
| Thermocycler | |||
| Gel Electrophoresis | |||
| 50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | cat. # S33102 | |
| Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | |
| E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen | cat. # 12373-031 | |
| Reagent Grade Type II water | |||
| Gel apparatus | |||
| Sequencing | |||
| ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) |
| Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | cat. # S-2889 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 |
| TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma-Aldrich | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. # M-1028 | 1 M |
| 95% Ethanol | |||
| Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL |
| Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | |
| 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | |
| Thermocycler | |||
| Centrifuge with plate holders | |||
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |
References
- Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
- Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
- Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
- Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
- Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
- Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
- Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
- Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).
- Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).
- Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
- Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
