Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

doi: 10.3791/2531 Published: December 27, 2010

Summary

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Abstract

Achtergrond: Voorafgaand aan het ontvangen van een geneesmiddel uit CCR5-antagonist klasse in HIV-therapie moet de patiënt worden onderworpen aan een HIV-test tropisme om te bevestigen dat zijn of haar viral de bevolking van de CCR5-coreceptor gebruikt voor cellulaire binnenkomst, en niet een alternatief coreceptor. Een benadering om tropisme testen is om te onderzoeken de volgorde van de V3 regio van de HIV-envelop, die samenwerkt met de coreceptor.

Methoden: Viraal RNA wordt gewonnen uit bloedplasma. De V3 regio wordt versterkt in drievoud met geneste reverse transcriptase-PCR. De amplificaties worden vervolgens sequentie bepaald en geanalyseerd met behulp van de software, RE_Call. Sequenties worden vervolgens voorgelegd aan een bio-algoritme, zoals geno2pheno van virale tropisme afleiden uit de V3 regio. Sequenties worden afgeleid dat ze niet-R5 als hun geno2pheno valse positieve daalt onder de 5,75%. Als een van de drie sequenties van een steekproef is afgeleid als niet-R5, de patiënt is het onwaarschijnlijk om te reageren op een CCR5-antagonist.

Protocol

Procedure:

1. Extractie:

Minstens 500 pi van bloedplasma is nodig als voorbeeld input voor deze genotypische HIV-tropismetest.

  1. Extract HIV RNA uit 500μL van plasma met behulp van een EASYMAG (bioMerieux) geautomatiseerde afzuigkap, of de voorkeur extractie methode van uw laboratorium.
    Elueer de uitgepakte viraal RNA in een 60 pi aliquot deel. Bewaren bij -20 graden Celsius of beginnen met reverse transcriptase-PCR onmiddellijk na uitpakken.

2. RT-PCR:

4μL van het monster zal worden versterkt in drievoud met geneste RT-PCR methoden. De RT-PCR-reactie moet worden ingesteld in een PCR-clean room.

  1. Bereken de hoeveelheid reagens die nodig is voor het aantal monsters te worden versterkt. Volg de onderstaande tabel geven reagens volumes voor een reactie.
    Reagens Volume (pi)
    (1X reactie)
    DEPC behandeld water 10,56
    2x reactiebuffer 20
    50% sucrose en 0,04% broomfenolblauw mix 4
    Voorwaartse primer gericht op de hiv-V3 regio 0.32
    Reverse primer 0.32
    Enzym - SuperScript III One-Step RT-PCR-systeem met Platinum Taq DNA-polymerase 0.8
    Totaal 36
    Tabel 1. Reagens volumes die nodig zijn voor een reactie van One-Step RT PCR.
    Elke stap een RT-PCR reactie vereist het volgende recept:
    • 10.56 pi DEPC behandeld water
    • 20 pi van 2x reactiebuffer
    • 4μL van 50% sucrose en 0,04% broomfenolblauw mix
    • 0,32 pi van de forward primer richten op de hiv-V3 regio
    • 0,32 pi van de reverse primer
    • 0,8 pi van het enzym
    Voor een totaal van 36μL per reactie.
  2. Line up monsterextract buizen in een rij naast een lege, het label 96-well PCR-plaat.
  3. Met behulp van een repeater pipet, voeg 36 ul monster mix aan elk putje van de PCR-plaat, zodanig dat er 3 putten Voor elk monsterextract.
    * Opmerking: Deze procedure moet worden uitgevoerd in drievoud op zijn minst, om een ​​adequate bemonstering van de virale bevolking te waarborgen.
  4. Met behulp van een 8-kanaals multichannel pipet, voeg 4μL van het monsterextract voor elk van zijn drie putten. Verandering tips tussen elke toevoeging.
  5. Bedek de putten met PCR strip caps.
  6. Nadat de overdracht comlete is, plaats de PCR-plaat in een thermocycler. Stel de thermocycler om met het volgende programma uitvoeren: 30 minuten bij 52 ° C 2 minuten bij 94 ° C 40 cycli van (15 seconden bij 94 ° C, 30 seconden bij 55 ° C en 1,5 minuten bij 68 ° C) 5 minuten bij 68 ° C
  7. Verwijder de PCR-plaat uit thermocycler. Plaat kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur.

Ga verder naar de tweede ronde PCR-stap

3. Tweede-ronde-PCR:

  1. Bereken de hoeveelheid reagens die nodig is voor het aantal monsters te worden versterkt. Volg de onderstaande tabel geven reagens volumes voor een reactie.
    Reagens Volume (pi)
    (1X reactie)
    DEPC behandeld water 13,45
    60% sucrose, 0,08% cresol rood mix 2
    Roche HiFi-systeem Buffer 2 2
    MgCl 2 0.8
    dNTP 0.16
    Voorwaartse PCR primer 0.15
    Reverse PCR primer 0.15
    Uit te breiden HiFi enzym 0.29
    Totaal 19
    Tabel 2. Reagens volumes die nodig zijn voor een reactie van 2 e ronde PCR.
    Elke tweede ronde PCR-reactie moet het volgende recept:
    • 13.45 pi DEPC behandeld water
    • 2 pl 60% sucrose, 0,08% cresol rood mix
    • 2 pi van Roche Hifi systeem Buffer 2
    • 0,8 pi van 25 mM MgCl 2
    • 0,16 pi van 25 mM dNTP
    • 0,15 pi zowel van de forward en reverse PCR-primers
    • 0,29 pi Expand HiFi enzym
    Voor een totaal van 19 pi per reactie.
  2. In een post versterking kamer, met behulp van een 8-kanaals multichannel pipet een pi van de RT-PCR sjabloon in de tweede ronde PCR-buffer. Verandering tips tussen elke toevoeging.
  3. Bedek de putten met PCR strip caps en overdracht van de tweede-ronde-PCR-plaat om een ​​thermocycler.
  4. Stel de thermocycler om met het volgende programma uitvoeren: 2 minuten bij 94 ° C 35 cycli van (15 seconden bij 94 ° C, 30 seconden bij 55 ° C, 1 minuut bij 72 ° C) 7 minuten bij 72 ° C
  5. Verwijder de plaat uit thermocycler nadat de temperatuur is teruggekeerd naar 25 ° C.

4. Gel Elektroforese:

Om te bevestigen dat de V3 regio met succes is versterkt, is een gelelektroforese stap uitgevoerd.

  1. Bereid een agarose gel met 0,8 g agarose poeder in 50 ml 1X TAE buffer. Roer en smelten in de magnetron voor ~ 1 minuut of tot de agarose volledig is opgelost.
  2. Voeg 6 ul van SYBR veilige gel vlek en swirl te mengen.
  3. Giet oplossing in een gel lade, en voeg genoeg gel kammen om het aantal PCR-putten tegemoet te komen.
  4. Zodra de gel droog is, verwijder kammen en plaats de gel in de gel apparaat, zorg ervoor dat deze volledig ondergedompeld in 1X TAE buffer.
  5. Met behulp van een 10 pi meerkanaalspipet, voeg 8μL van elk PCR-monster zijn eigen goed in de gel. Dek de PCR-plaat na de amplificaties zijn toegevoegd aan de gel.
  6. Voeg 6 pi van de DNA-ladder om ten minste een goed per rij.
  7. Laat de gel apparaat op 100V ~ voor ~ 10 minuten, zorg ervoor dat de bands niet weglopen van de gel.
  8. Plaats de gel op een UV trans-verlichting en neem een ​​foto van de gel.
    Wells met PCR-geamplificeerd DNA zal verschijnen licht, wat wijst op een succesvolle versterking.
  9. Noteer alle monsters waar drie amplificaties zijn succes. Indien nodig, herhaal RT-PCR voor deze monsters met minder dan 3 amplificaties.

Ga verder naar de sequencing

5. Sequencing:

Nadat versterkt virale cDNA, kunnen monsters worden voorbereid voor het rangschikken. De sequencing reactie moet plaatsvinden in een post-versterking kamer.

  1. Verwijder BigDye uit de vriezer en sequencing primers uit de koelkast. Laat de BigDye bij kamertemperatuur ontdooien, niet langer dan 1 uur.
  2. Bereken de hoeveelheid reagens die nodig is voor het aantal monsters moet worden uitgevoerd. Volg de onderstaande tabel geven reagens volumes voor een reactie.
    Reagens Volume (pi)
    (1X reactie)
    BigDye 0.3
    BigDye Buffer 2.1
    Grondverf 2.6
    Totaal 5.0
    Tabel 3. Reagens volumes die nodig zijn voor een reactie van sequencing.
    * Opmerking: bereid een aparte mix voor elke primer.
    ** Opmerking: de BigDye buffer gebruikt in de volgorde reactie kan worden als volgt bereid: Mix 17.5 ml Trizma hydrochloride bufferoplossing (1 M) (pH9.0) en 0,125 ml Magnesium Chloride (1 M). Breng het uiteindelijke volume van 100 ml met reagens kwaliteit water. Dit moet worden bewaard bij 2-8 ° C.
  3. Met behulp van de berekeningen van 3,3, de voorbereiding van de sequencing reactie mixen voor elke primer en vortex niet langer dan 5 seconden. Aliquot in 0,2 ml strip buizen.
  4. Aliquot 5 pi van sequencing reactie mengen in de juiste putjes met behulp van een multichannel pipet. Bedek de plaat (s) met sequencing reactie mengen met een Kimwipe en zet apart.
  5. Bereid een 1:15 verdunning van geamplificeerde PCR-product door de toevoeging van 180 ul van Baxter steriel water om de resterende PCR-product.
  6. Pipetteer een pi van de verdunde monster aan de onderkant van de geschikte putjes, verandering pipetpunten.
  7. Wanneer u klaar bent de overdracht van monsters, sluit de plaat met strip caps en vortex gedurende 1 seconde
  8. Plaats de plaat in een centrifuge. Zet de snelheid op 145 g, wanneer het centrifugetoerental 145 g bereikt, stop de spin.
  9. Plaats de plaat in een thermocycler (s) ingesteld op het volgende programma: 25 cycli van (10 sec @ 96 ° C, 5 sec @ 50 ° C, 55 sec @ 60 ° C...) Het volume moet minimaal 6μL . De cyclus moet ongeveer 1,2 uur.

Ga verder met neerslag

6. Neerslag:

Om te "clean-up" van de virale cDNA na de sequencing reactie, uit te voeren ethanol precipitatie met behulp van 95% ethanol.

  1. Ophalen plaat uit de thermocycler en breng aan een post-versterkercatie kamer.
  2. Verwijder de strip caps en plaats ze in volgorde op een schone handdoek of papieren Kimwipe.
  3. Pipet 4μL Werken EDTA-natriumacetaatoplossing aan de zijkant van elk monster goed. Tik op de plaat voorzichtig, zodat de EDTA-Sodium-oplossing valt op de bodem van de put. Dezelfde tips kan zo lang worden gebruikt als ze het monster niet contact op de bodem van de put.
    * Opmerking: De werkende EDTA-natriumacetaatoplossing kan worden bereid als volgt:
    1. Bereid 3M Natriumacetaat door het oplossen van 246,1 g natriumacetaat in een L van het reagens kwaliteit water. Filtreer de oplossing door een 0,45 micro-filter en voor te bereiden 50 ml porties.
    2. Bereid Stock EDTA-natriumacetaatoplossing (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) door het mengen van gelijke volumes van natriumacetaat (3 M) en de oplossing van EDTA (500 mm) pH 8,0.
    3. Bereid te werken EDTA-natriumacetaatoplossing door het mengen van een deel voorraad EDTA-natriumacetaatoplossing met drie delen van het reagens kwaliteit water (10 ml + 30 ml).
  4. Pipet 40μL van gekoelde 95% ethanol op de tegenovergestelde zijde van het staal putten en vervang de strip caps.
  5. Sluit de caps en vortex de plaat gedurende 10 seconden. Tik op de plaat om het even welke bellen te verwijderen.
  6. Plaats de plaat in de vriezer bij -20 ° C voor een minimum van 30 minuten en een maximum van 2 uur.
    1. Zodra neerslag heeft plaatsgevonden, verwijder de plaat uit de vriezer en plaats in een centrifuge gedurende 20 minuten bij 3700 rpm.
    2. Verwijder de juiste hoeveelheid van Hi-Di Formamide (Applied Biosystems) uit de vriezer in staat te stellen ontdooien voor denaturatie.
    * Opmerking: Denaturatie van een volle 96-well plaat vereist 960μL van HIDI Formamide en dus is het voordelig om vooraf voor te bereiden ~ 1.1mL aliquots.
  7. Na het draaien van de plaat te verwijderen en gooi de strip caps. Omkeren van de plaat over het afval container (bijv. vuilnisbak) en decanteer het supernatant. Ontdoen van de resterende supernatant door blotting de omgekeerde platen op keukenpapier.
  8. Vouw 2 vellen keukenpapier en leg ze op het oppervlak van de plaat. Plaats de plaat naar beneden in de centrifuge en draaien op 145 g, het stoppen van de spin bij het bereiken van 145g.
  9. Haal de plaat uit de centrifuge en controleer of putten leeg zijn. Pipet 155μL van gekoelde 95% ethanol in de putten.
  10. Verwijder het supernatant in de afval container en smet op keukenpapier en herhaal het centrifugeren in 4.10.
  11. Bij het verwijderen van de plaat uit de centrifuge, gooi gebruikte papieren handdoek en laat plaat staan ​​open voor 2-5 minuten zodat alle resterende ethanol te laten verdampen.

Ga verder naar denatureren

7. Denatureren

  1. Haal de ontdooide HIDI Formamide en overgieten in een container groot genoeg is voor een multichannel pipet,
    * Opmerking: Bij gebruik van pre-gealiquoteerd maatregelen zoals vermeld in 6,7 B, een buis is vereist voor elke 96-well plaat te worden uitgevoerd.
  2. Met behulp van een multichannel pipet, te distribueren 10μL van HIDI Formamide in alle putten op de plaat, met inbegrip van die leeg zijn.
  3. Bedek de plaat met een septa mat om een ​​afdichting te vormen.
  4. Plaats de plaat in een thermocycler bij 90 ° C gedurende 2 minuten.
  5. Na denaturatie, de plaat en plaats in een plaat houder te laden in de sequencer. Upload een voorbereide sequencing lay-out. Platen kunnen worden bewaard bij -20 ° C tot een week voordat u de volgorde uit te voeren.

8. Het analyseren van de resulterende data met behulp van Base Calling Software.

  1. Met behulp van oproepen uit te voeren automatische basis te bellen, zonder menselijke tussenkomst, een primer dekking is aanvaardbaar. Recall is een aangepaste basis roeping software die gevonden kunnen worden op de volgende URL: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
    * Opmerking: Een account is vereist om in te loggen. Voor het instellen van een account, klik op de "Registreer" knop op de login pagina. Zodra een account is aangemaakt kunt u de upload pagina.
  2. Als je aangemeld bent, kunt u kiezen sample bestanden uploaden. Met behulp van de browse optie kunt u de locatie van uw ruwe sequencing data te uploaden met een maximale upload van 20Mb.
    * Let op:... Web Recall zal alleen gegevens bestanden als ABI en SCF bestanden te aanvaarden in een zip, tar of tar.gz bestand
  3. Als u bestanden voor het uploaden zijn geselecteerd, kiest u uw referentie volgorde. In dit geval dient u de referentie sequentie is ingesteld op 'V3'. U bent nu klaar om te klikken op "Process Data."
  4. Verwerkte gegevens verschijnen op de rechterkant van de pagina onder het kopje "Past Samples '. Elke verwerkte lopen of sample set zullen worden geplaatst in een map met de huidige datum. Deze kunnen opnieuw worden gelabeld door te klikken op de "Rename" knop.
  5. Te klikken op de map zal een lijst van de monsters. Degenen die zijn rood hebben gefaald; degenen die groen zijn verstreken. Door te klikken op een bepaald monster en de "View" knop kunt u de volgorde bekijken. Volg de instructies aan de rechterkant van de pagina om throu navigerengh de reeks.
    * Opmerking: Voor deze methode is het acceptabel om sequenties die herinneren passeren (aangegeven in groen) automatisch, zonder handmatige tussenkomst export.
  6. Als u tevreden bent met de resultaten die u kunt kiezen om de passerende sequenties downloaden door te klikken op "Download". Bestanden worden gedownload in een gecomprimeerde map.
    * Opmerking: onder "Instellingen" kunt u downloaden en e-mail opties, waaronder bestandstype.
  7. Monsters niet schoon te maken drievoud sequenties te produceren moet opnieuw geamplificeerd in drievoud uit extract. Als RePCR niet zorgen voor een schone volgorde, een minimum van twee sequenties aanvaardbaar is voor gebruik in tropisme gevolgtrekking.

9. Afleiden virale tropisme van Sequenties Gegenereerd door de bevolking op basis van Sequencing met behulp van de Geno2pheno Co-receptor algoritme.

  1. Sequenties kunnen worden uitgevoerd via de geno2pheno coreceptor-service op de volgende URL: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
  2. Monsters te uploaden kan bestempeld worden als gezien past. Uit het drop down menu van de betekenis instelling, selecteer dan de "geoptimaliseerde cutoffs gebaseerd op een analyse van klinische gegevens van MOTIVATE (2% en 5,75% FPR)"
  3. Kiezen om te uploaden of plak een reeks voor analyse, FASTA bestanden zijn toegestaan.
  4. De geno2pheno FPR kan als volgt worden geïnterpreteerd: G2P FPR> 5,75 is vertegenwoordiger van een R5-met behulp van virale populatie; kans om te reageren op CCR5-antagonisten G2P FPR <5,75 is vertegenwoordiger van een niet-R5 virale populatie; waarschijnlijk niet om te reageren op CCR5-antagonisten. G2P <2 is zeer waarschijnlijk geen antwoord op de CCR5-antagonisten. Als een van de drie sequenties van een steekproef is afgeleid als niet-R5, de patiënt is het niet waarschijnlijk te reageren op een CCR5-antagonist.

10. Representatieve resultaten

Wanneer het protocol correct wordt uitgevoerd moet men verwachten dat met succes reeks 2 of 3 herhalingen voor elk monster. Negatieven run samen met monsters moeten geen indicatie van RNA. De meerderheid van de sequenties zou moeten "pass" basecalling door Recall.

Op basis van de verdeling van de R5 en niet-R5 binnen de gemeenschap virale bevolking, zou de meerderheid van willekeurig geselecteerde patiënten monsters worden verwacht dat R5-virus gebruikt. Dus tenzij het project ontwerp anders zou suggereren, moet men verwachten dat meer dan niet-R5 R5 monsters.

Tabel 1. A) Het reagens volumes die nodig zijn voor een reactie van een stap RT-PCR en B) de thermocycler programma nodig is voor het uitvoeren van de RT-PCR-reactie.

A)


Reagens
Volume (pi)
(1X reactie)
DEPC behandeld water 10,56
2x reactiebuffer 20
50% sucrose en 0,04% broomfenolblauw mix 4
Voorwaartse primer SQV3F1 0.32
Reverse primer CO602 0.32
Enzym - SuperScript III One-Step RT-PCR-systeem met Platinum Taq DNA-polymerase 0.8
Totaal 36

* Opmerking:
SQV3F1 primer volgorde: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 primer volgorde: 5 'GCC CAT AGT GCT TGC TCC TGC TCC CAA GAA CC 3'

B)

Aantal Cycles Tijd Temperatuur
1 30 minuten 52 ° C
1 2 minuten 94 ° C
40 15 seconden 94 ° C
30 seconden 55 ° C
1,5 minuten 68 ° C
1 5 minuten 68 ° C

Tabel 2. A) Het reagens volumes die nodig zijn voor een reactie van de tweede ronde PCR en B) de thermocycler programma nodig zijn voor het uitvoeren van de tweede ronde PCR-reactie.

A)


Reagens
Volume (pi)
(1X reactie)
DEPC behandeld water 13,45
60% sucrose, 0,08% cresol rood mix 2
Roche HiFi-systeem Buffer 2 2
MgCl 0.8
dNTP 0.16
Voorwaartse primer SQV3F2 0.15
Reverse primer CD4R 0.15
Uit te breiden HiFi enzym 0.29
Totaal 19

* Opmerking:
SQV3F2 primer volgorde: 5 'TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG OP 3'
CD4R primer volgorde: 5 'TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'

B)


Aantal Cycles
Tijd Temperatuur
1 2 minuten 94 ° C
35 15 seconden 94 ° C
30 seconden 55 ° C
Een minuut 72 ° C
1 7 minuten 72 ° C

Tabel 3. A) Het reagens volumes die nodig zijn voor een reactie van sequencing en B) de thermocycler programma nodig is om het uitvoeren van de sequencing reactie.

A)

Reagens Volume (pi)
(1X reactie)
BigDye 0.3
BigDye Buffer 2.1
Grondverf
Naar voren V3FO2F
Reverse SQV3R1
2.6
Totaal 5.0

* Opmerking: Niet combineren primers, een aparte mix moet worden opgesteld voor elke primer
V3O2F primer volgorde: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 primer volgorde: 5 'GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'

B)


Aantal Cycles
Tijd Temperatuur
25 10 seconden 96 ° C
5 seconden 50 ° C
55 seconden 60 ° C

Discussion

De methode hier wordt gepresenteerd is een standaard-sequencing methode toegepast op tropisme testen. De klinische toepassing van HIV enveloppe V3 lus sequencing van virale tropisme voorspellen is tot in de late beperkt. Deze methode is aangetoond, in retrospectieve analyses van de maraviroc (ViiV Healthcare) klinisch onderzoek, worden minimaal gelijke mate in staat om virale tropisme voorspellen in vergelijking met andere gevalideerde tests klinisch gebruikt.

Er zijn veel voordelen aan het uitvoeren van genotypische analyse van de V3 lus voor tropisme voorspelling. Eerst en vooral, kan deze procedure worden uitgevoerd op elke faciliteit met operationele sequencing apparatuur, aanzienlijke verhoging van de toegankelijkheid en het verminderen van de doorlooptijd van tropisme testen. Ter vergelijking, is de fenotypische Enhanced Sensitivity Trofile Assay (ESTA) (Monogram Biosciences), die heeft gediend als de gouden standaard voor het tropisme testen, uitgevoerd in een centrum in Zuid-Californië. Bijkomende voordelen zijn onder andere de eis van minder uitgangsmateriaal en een minimaal vereist plasma viral load van 500copies/mL. Als goed, de operationele kosten van het uitvoeren van de genotypische test zijn relatief laag in vergelijking met die van een fenotypische test. Het gebruik van de Recall software in het bijzonder elimineert de noodzaak voor handmatige volgorde beoordeling, die meestal een arbeidsintensieve deel van genotype analyses.

De hier gepresenteerde methode is vrij eenvoudig, zonder bijzondere stap opwegen tegen een ander in belang. We suggereren lopen PCR en sequencing in drievoud om de kansen van het vastleggen minderheid soorten te verhogen binnen de virale populatie van een steekproef. Repliceert meer dan drie kan worden uitgevoerd, maar we hebben gevonden triplo om zowel efficiënt en betrouwbaar. We stellen ook voor het gebruik van de One-Step reverse transcriptaseremmers PCR kit (Qiagen) die zowel RT-PCR en de eerste ronde PCR presteert in de dezelfde reactie met behoud van een hoge gevoeligheid en specificiteit.

Disclosures

P. Richard Harrigan heeft tegenstrijdige belangen van ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, en Quest. Deze video-artikel wordt gesponsord door ViiV Healthcare.

Acknowledgments

De ontwikkeling van deze test werd ondersteund door Viiv Healthcare en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en door middel van een GlaxoSmithKline / CIHR leerstoel Klinische Virologie voor Dr Harrigan.

Ondersteuning door Pfizer en ViiV Healthcare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica bioMerieux cat. # 280133 (48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer bioMerieux cat. # 280134 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 bioMerieux cat. # 280130 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 bioMerieux cat. # 280131 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 bioMerieux cat. # 280132 (4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0 bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water Ambion cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty Invitrogen cat#12574-035 Kit components used:
- SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix
- 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System Roche Group cat. # 1 759 078 Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP Roche Group cat. # 11969064001 (100 mM)
Sucrose Sigma-Aldrich cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt Sigma-Aldrich cat.# B5525
Cresol Red Sigma-Aldrich cat.# 114472-5G indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer Invitrogen cat. # 24710030 (1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain Invitrogen cat. # S33102
Agarose (ultra pure) Invitrogen cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder Invitrogen cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosciences cat. # 4337458 (25000 reactions)
Hi-Di Formamide Applied Biosciences cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc) Sigma-Aldrich cat. # S-2889
EDTA Sigma-Aldrich Cat.# 03690-100ML 0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution Sigma-Aldrich cat. # T-2819 1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich cat. # M-1028 1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA Applied Biosystems cat. # 4335613 500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) Applied Biosystems cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit Applied Biosciences Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer Applied Biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
  2. Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
  3. Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
  4. Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
  5. Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
  6. Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
  7. Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
  8. Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, (2009).
  9. Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, (2009).
  10. Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, (2009).
  11. Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, (2009).
  12. Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
  13. Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McGovern, R. A., Harrigan, P. R., Swenson, L. C. Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3. J. Vis. Exp. (46), e2531, doi:10.3791/2531 (2010).More

McGovern, R. A., Harrigan, P. R., Swenson, L. C. Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3. J. Vis. Exp. (46), e2531, doi:10.3791/2531 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter