Summary
שלמה הר
Abstract
הר שלמים הכלאה באתרו (בכך) היא טכניקה נפוצה במעבדות הביולוגיה המולקולרית בשימוש ללמוד ביטוי גנים באמצעות לוקליזציה של תעתיקי mRNA ספציפי בתוך הדגימה הר שלם. טכניקה זו (עיבוד Albertson ו Yelick, 2005) שימש במפלס העליון השוואתי ראשון בכיתה חוליות מעבדה לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז. הראשונה שני שלישים של הקורס החולייתנים השוואתית במעבדה לביולוגיה נתן לסטודנטים הזדמנות ללמוד את אמבריולוגיה ואנטומיה ברוטו של אורגניזמים שונים המייצגים מינים שונים chordate בעיקר באמצעות חתכים המסורתית ושימוש במודלים. החלק הסופי של הקורס מעורב גישה חדשנית ללימוד אנטומיה באמצעות תצפית של התפתחות החולייתנים שימוש בטכניקות מולקולריות שבה מאחלים בוצעה על עוברי דג הזברה. פיברובלסטים הטרוזיגוטיים גורם הגדילה 8 קו (fgf8a) מוטציה, אס, היה בשימוש. בשל ירושה מנדל, אס intercrosses סוג בר הפיק, הטרוזיגוטיים, ו הומוזיגוטים מוטנטים ace/fgf8a ביחס 01:02:01. בדיקות RNA עם דפוסי הביטוי הידוע קו האמצע לבין בפיתוח מבנים אנטומיים כגון הלב, somites, tailbud, myotome, והמוח היו בשימוש. מאחלים בוצעה באמצעות דג הזברה ב somite 13 ו חסודה-6 שלבים, עם התלמידים מבצעים את התגובה מכתים בכיתה. המחקר של עוברי דג הזברה בשלבים שונים של פיתוח נתן לסטודנטים את היכולת לבחון כיצד אלה מבנים אנטומיים השתנה במשך ontogeny. בנוסף, חלק מוטנטים ace/fgf8a מוצג looping לב לא תקין, ועל פגמים somite והתפתחות המוח. הסטודנטים במעבדה זו צפו התפתחות תקינה של מערכות איברים שונים הן באמצעות האנטומיה חיצוניים, כמו גם דפוסי ביטוי גנים. הם זיהו גם ותיאר עוברים הצגת התפתחות אנטומית גן תקין הביטוי (כלומר, מוטציות המשוערת).
למדריכים במוסדות כי עדיין אין את הציוד הדרוש או שם כספים עבור המעבדה לחדשנות הלימודים מוגבלים, העלות הכספית של ריאגנטים המנגנון עשוי להיות גורם לשקול, כמו את הזמן והמאמץ הנדרש יהיה על החלק של מאמן ללא קשר להגדרה. עם זאת, אנו טוענים כי השימוש מאחלים זה סוג של הגדרה מעבדה בכיתה יכולים לספק חוליה חשובה בין גנטיקה התפתחותית ואנטומיה. עם התקדמות הטכנולוגיה ואת היכולת ללמוד התפתחות האורגניזם ברמה המולקולרית נעשה קל יותר, זול יותר ויותר פופולרי, ביולוגים אבולוציוניים רבים, אקולוגים, ו פיזיולוגים פונים אסטרטגיות ומחקר בתחום הביולוגיה המולקולרית. שימוש משאלה כיתה חוליות השוואתי ביולוגיה מעבדה היא דוגמה אחת כיצד מולקולות האנטומיה יכול להתכנס בתוך קורס בודד. זה נותן העליון סטודנטים ברמה הזדמנות לתרגל טכניקות מודרניות במחקר ביולוגי, המוביל השכלה מגוונת יותר וקידום המחקר המדעי בעתיד תחומית.
Protocol
1. טרנספורמציה של פלסמיד יעד cDNA
אני חלק: טרנספורמציה של פלסמיד
(זמן נדרש: 3 שעות + הדגירה לילה)
- מרק חם SOC מזין בתוך אמבט מים 42 מעלות צלזיוס (500 μL לכל תגובה)
- הפשירי תאים המוסמכת על הקרח
- הוסף 1 μL פלסמיד עד 25 תאים המוסמכת μL
- מניחים על קרח במשך 20 דקות
- הלם חום תאים באמבט מים 42 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות
- מיד המקום התאים על קרח במשך 2 דקות
- הוספת 500 μL של מרק 42 מעלות צלזיוס מזין את בקבוקון אחד מהתאים
- תלחצו על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ב 255 סיבובים לדקה (סל"ד)
- 75 פלייט לערבב μL טרנספורמציה על לוריא Bertani (LB) צלחות אגר
- צלחות דגירה הפוכה ב 37 ° C בין לילה
חלק שני: E. coli תרבות
(זמן נדרש: 15 דקות פלוס הדגירה לילה)
- עבור כל תגובה, 3 aliquot מ"ל מרק LB ו 3 μL של אמפיצילין 50 מ"ג / מ"ל לתוך צינור תרבות
- לגרד 1 מושבת חיידקים בצלחת אגר ולהוסיף צינור כל תרבות
- Shake צינורות תרבות ב 37 מעלות צלזיוס ב 255 סל"ד לילה
חלק שלישי: הכנה פלסמיד
(הזמן הנדרש: 1.5 שעות)
- לבודד פלסמיד מתרבויות לילה באמצעות 5 מיני ראש ערכת FastPlasmid (קטלוג # 2300000)
- כדי לבדוק נוכחות של פלסמיד שהוכן, הפעל את ה-DNA eluted מתוך הערכה על ג'ל 1% טריס-Acetate-EDTA (טה) מוכתם ברומיד ethidium
2. באתרו סינתזה DIG שכותרתו בדיקה RNA
אני חלק: לינאריזציה של פלסמיד
(הזמן הנדרש: 2.5 שעות)
- בתוך צינור מ"ל 1.5 microfuge, לשלב:
הוכן פלסמיד 20 מ"ל אנזים הגבלה * 2 מ"ל מאגר ** 10 מ"ל 10X אלבומין בסרום שור (BSA) 10 מ"ל Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) מים 58 מ"ל 100 מ"ל - לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות
* משתנה עם הפלסמיד
** משתנה עם אנזים ההגבלה
חלק שני: תמלול
(זמן נדרש: 3 שעות)
- בתוך צינור מ"ל 1.5 microfuge, לשלב:
פלסמיד לינארי 4 מ"ל תמלול הצפת 10X ** 4 מ"ל Digoxigenin מערבבים לייבל 4 מ"ל פולימראז * 2 מ"ל RNase אינהיביטור 2 מ"ל DEPC מים 24 מ"ל 40 מ"ל - לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1
- הוסף 2 μL של פולימראז *
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1
- הוסף 2 μL של DNase
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות
* משתנה עם הפלסמיד
** משתנה עם פולימראז
חלק שלישי: רטיבות
(זמן נדרש: 5 דקות בתוספת 2 שעה הדגירה לילה, 1 שעה צנטריפוגות מחדש להשעות)
- הוסף 4 μL של 0.2M EDTA
- הוסף 5 μL של ליתיום כלוריד 4M
- הוספת 150 μL של אתנול קרים 100%
- דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות הלילה
- צנטריפוגה 14,000 סל"ד במשך 30 דקות ב 4 ° C, למזוג supernatant משם
- יבש גלולה במשך 7 דקות
- Re-להשעות במים 20 DEPC μL
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות
חלק ד ': ההיפוך חלוקה - בצע בדיקה רק אם גודל גדול מ 0.6 kb
(זמן נדרש: משתנה בהתאם לגודל בדיקה, בדרך כלל לא יותר מ 20 דקות)
- בתוך צינור מ"ל 1.5 microfuge, לשלב:
RNA Probe 20 מ"ל DEPC מים 12 מ"ל סודיום ביקרבונט 4 מ"ל סודיום קרבונט 4 מ"ל 40 מ"ל - מדגירים את אמבט המים 60 מעלות צלזיוס. מאגר זמן הדגירה על המשוואה:
זמן (מינימום) = (החל kb - הרצוי kb) / (x 0.11 x הרצוי החל kb kb)
הגודל הרצוי ממוצע = 0.6 kb
חלק V: רטיבות סופי
(זמן נדרש: 5 דקותאוטי בתוספת 2 שעה הדגירה לילה, 1 שעה צנטריפוגות מחדש להשעות, 1 שעה על ג'ל אלקטרופורזה)
- מוסיפים מים 40 DEPC μL
- הוסף 8 נתרן אצטט μL
- הוסף 1.04 μL חומצה אצטית קרחונית
- הוספת 240 קרח μL קר אתנול 100%
- דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות הלילה
- צנטריפוגה 14,000 סל"ד במשך 30 דקות ב 4 ° C, למזוג supernatant משם
- יבש גלולה במשך 7 דקות
- Re-להשעות במים 20 DEPC μL
- וורטקס לערבב
- כדי לבדוק נוכחות של riboprobe, להפעיל את הפתרון מחדש מושעה על מוכתם טה 1% ג'ל עם ברומיד ethidium
3. הר שלם הכלאה באתרו
אני חלק: קיבוע של עוברים עיכול proteinase K
(זמן נדרש: שעות הלילה בתוספת 4 תקן למחרת לאחסון, 2.5 שעות אחסון חלק II)
- איסוף מבוים עוברי דג הזברה ולתקן paraformaldehyde ב 4% (PFA) לילה ב 4 ° C
- שטפו עוברי קבוע פוספט שנאגרו מלוחים המכיל 0.1% Tween-20 (PBSt) 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד
- כדי להבטיח חשיפה של עוברים אל ריאגנטים ניסיוני, עוברים dechorionate ידני (במידת הצורך) באמצעות קנס שקצהו מלקחיים
- מייבשים על ידי עוברי כביסה בסדרה ציון של 25% מתנול 50% PBSt למשך שעה אחת בכל לשטוף, אז חנות מתנול 100% ב -20 ° C
- כאשר מוכן לשימוש, רעננותם עוברים PBSt ידי שטיפה ב -50% (פי 2) ו -25% (1 שעה) מתנול ב PBSt במשך 10 דקות כל אחד. לבסוף לשטוף 2 פעמים במשך 10 דקות כל אחד PBSt 100%. התזמון המדויק אינו חשוב PBSt / מתנול שוטף
- Bleach עוברים פתרון 10% מי חמצן ב PBSt, במידת הצורך, כדי להסיר פיגמנטים כהים. עוברים צריך לדגור בפתרון חמצן במשך 10-20 דקות, בהתאם לגיל העובר, ואת כובע של הצינור microfuge צריכה להישאר פתוחה כדי למנוע הצטברות של לחץ אוויר
- עוברים Digest עם 50 מ"ג / מ"ל proteinase K בדילול 1:5000 ב PBSt במשך 3-15 דקות, בהתאם לגיל העובר
- Re-לתקן עוברים PFA 4% למשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים PBSt במשך 5 דקות כל אחד
חלק שני: הכלאה של Riboprobes
(זמן נדרש: 3 שעות + לילה על הכלאה, 1.5 שעות למחרת חלק III)
- Prehybridize עוברים עם פתרון prehybridization (PHS) ב 70 ° C שחומם מראש אמבט מים במשך 2-3 שעות
- הסר PHS, להוסיף 0.5 מ"ל הכלאה פתרון 1.5 μL riboprobes מסונתז בעבר שכותרתו Digoxigenin, דגירה על 70 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הטמפרטורה עשויה להשתנות בתוך כמה מעלות, בהתאם ליעד riboprobe
- למחרת, לשטוף עוברים על 70 מעלות צלזיוס בפתרונות ציון של 75%, 50% ו -25% ב PHS ציטרט הנתרן מלוחים 2X (SSC) במשך 10 דקות כל אחד, ולאחר מכן לשטוף ב 0.2X SSC במשך 30 דקות על 68 ° ג
- שטפי ב הצפת חומצה Maleic (MAB) 2 פעמים במשך 10 דקות כל בטמפרטורת החדר
חלק שלישי: אנטי Digoxigenin (α-DIG) דגירה נוגדן
(זמן נדרש: 3 שעות + לילה לחסום, 2.5 שעות למחרת חלק IV)
- העברת עוברים לצלחת 12 היטב
- טרום לחסום עוברים פתרון מ"ל 1-2 חסימת לפחות 3 שעות בטמפרטורת החדר
- במקביל, מראש לחסום את הנוגדן ידי הכנת הכרך השני של פתרון חסימת דילול אנטי digoxigenin נוגדן 1:2000 בפתרון זה
- הסר טרום לחסום להוסיף 1-2 מ"ל מראש חסם α-DIG פתרון, דגירה לילה ב 4 ° C
- למחרת, לשטוף עוברים MAB. אפשר העוברים כדי לדגור על MAB במשך 5 הדקות הראשונות, ולאחר מכן לבצע שינויים חיץ דגירה דקה 10 שתיים, אחת 30 דקות ואף אחד מרווח 60 דקות. התזמון המדויק אינו הכרחי
- שטפו עוברי 3 פעמים במשך 5 דקות כל חיץ אלקליין (AP) phosphatase
חלק ד ': מכתים עיבוד סופי
(זמן נדרש: 1 שעה עבור לילה מכתים, בהתאם riboprobe השתמשו, 4 שעות תחילת שוטף גליצרול, 60-10 שעות לשטוף גליצרול, ניתן לאחסן גליצרול)
- הוסף 1-2 מ"ל פתרון מכתים את העוברים, לעטוף בנייר כסף את הצלחת, ולבדוק מכתים במרווחי זמן קבועים (בערך כל 20 דקות) עד מכתים מספיקה
- לשטוף עוברים עם 2 פעמים PBSt במשך 5 דקות כל לעצור את התגובה מכתים
- מייבשים עוברים באמצעות 10 רוחץ דקה 25% (פעם 1) ו - 50% (2 פעמים) מתנול ב PBSt, אז מתנול 100%, כדי להסיר כתמים רקע
- אפשר בעוברים כדי לדגור על מתנול 100% לפחות 2 שעות בטמפרטורת החדר
- רעננותם ב PBSt שימוש שוטף 10 דקות ב -50% (פי 2) ו -25% (1 שעה) מתנול ב PBSt, ולאחר מכן לשטוף ב 100% PBSt 2 פעמים
- העברת דואר מוכתםmbryos לפתרון גליצרול 80% PBSt, באמצעות סדרה של ציון שוטף, ולאחסן ב 4 ° C.
מתכונים:
- צלחות אגר LB-10 גרם אגר LB + 250 מ"ל מים מזוקקים, החיטוי, כאשר קריר למגע להוסיף 250 אמפיצילין μL, לשפוך 15-20 מ"ל פתרון חם לתוך צלחת פטרי כל, לאפשר אגר לבסס
- מרק, מרק ג'12.5 LB LB + 200 מ"ל מים מזוקקים, החיטוי, להתקרר לפני השימוש
- 1% טה ג'ל 0.4 גרם agarose, 40 מ"ל 1X טה, 2 ברומיד ethidium μL; לטעון 7 (טרנספורמציה של פלסמיד יעד cDNA) μL פלסמיד או 3 ו - 4 riboprobe μL מים DEPC μL (באתרו סינתזה DIG שכותרתו בדיקה RNA) + 1 טעינה צבע μL, 5 בסולם הדנ"א μL
- פתרון-50% לפוראמיד Prehybridization, SSC 5X, חומצה ציטרית 9.2mM, 1% Tween-20
- פתרון prehybridization הכלאה פתרון בתוספת 500 מיקרוגרם / מ"ל tRNA ו - 50 מיקרוגרם / מ"ל הפרין
- MAB-100mm חומצה Maleic, 150mm NaCl, NaOH 0.2M, 0.1% Tween-20, ה-pH ל 7.5
- חסימת פתרון MAB-3 חלקים, חלק 1 10% מגיב Boehringer חסימת MAB, 1 חום חלק מנוטרל כבש בסרום
- AP חיץ-60mm טריס-HCl pH 9.5 ל, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0.1% Tween-20
- פתרון-5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl מכתים פוספט (BCIP) ו Nitro כחול tetrazolium (NBT) ב AP חיץ
4. נציג תוצאות
כאשר ביצעו כראוי, התגובה בין NBT, BCIP ו phosphatase אלקליין יהוו לזרז סגול שאמור להופיע על העובר דג הזברה כמו כתם סגול. Riboprobes צריך להיות מסונתז בעבר מן המקבילה cDNA של הגן של עניין. לכן, ניתן להסיק שום כתם דמיינו מייצג תחומי דג הזברה בו את הגן של עניין כבר בשלב זה עיבד התפתחותי מסוים. לענין זה, כמובן, riboprobes היו מסונתז מ aldh1a2 (בעבר raldh2; Begemann et al, 2001;. איור 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. איור 2); deltaC (אוטס et al, 2005.); myod1 (ויינברג et al, 1996.); shha (. קראוס et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. איור 3) ו myl7 (בעבר cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. מכתים היה צפוי קו האמצע ועל מבנים אנטומיים כולל somites, tailbud, myotome, המוח והלב. מוטנטים Ace/fgf8a ציפו יש פגמים רבים של מבנים אלה. מכתים היה בקלות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטנדרטי. מקורות נוספים מכילים מידע נוסף על פתרון בעיות מאחלים טכניקות דומות לאלה שתוארו כאן (Clark, 2003;. ד 'קוסטה et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009).
1. איור העובר דג הזברה 24 שעות שלאחר ההפריה, אשר כבר הכלאה עם riboprobes ספציפיות aldh1a2. מכתים ספציפיים ניתן לראות בעיניים, למוח האחורי, החזה סנפיר ניצן primordia ו somites. Anterior היא למעלה, אחורי הוא למטה.
איור 2. העובר דג הזברה בשלב 13 somite של פיתוח כי כבר הכלאה עם בדיקה ספציפית עבור fgf8a. מכתים ספציפיות נתפסת telencephalon, diencephalon הגבי, המוח התיכון, למוח האחורי הגבול, somites ו tailbud. הגחון היא השמאלית, הגב נמצאת מימין.
איור 3. 22 שעות שלאחר ההפריה העובר דג הזברה כי כבר הכלאה עם ספציפיים riboprobe עבור pax2a, סמן חזקים שימושי לדמיין את מערכת העצבים. מכתים ספציפיים ניתן לראות הסדק דמית העין, המוח התיכון, למוח האחורי הגבול, שלפוחית otic, ועל נוירונים בחוט השדרה. הגב עם נוף הקדמי בצד שמאל.
Discussion
מאחלים שימש קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה מעבדה כדי לסייע לתלמידים להבין את התפקידים של הגנטיקה בפיתוח אנטומי באמצעות ויזואליזציה של דפוסי ביטוי גנים ידועים. בחלק הראשון של הקורס, התלמידים ביצעו והניתוחים על אורגניזמים המייצגים chordate כמה מינים שונים, ומאפשר להם מספיק זמן ללמוד, להבין, להשוות, ו - חוליות האנטומיה הניגוד.
כהקדמה לחלק השני של הקורס, הסטודנטים קיבלו הרצאה רשמי המתאר פיתוח דג הזברה אנטומיה. השיטות ואת התוצאות הצפויות של הניסוי מאחלים נדונו גם. הסטודנטים קיבלו אז דג הזברה לחיות somitogenesis ודקדקן-6 שלבים של התפתחות, ועל הפריה ימים 2 ו - 5 לתגובה (DPF) לבדוק תחת מיקרוסקופ לנתח. זה היה כדי לתת לתלמידים הבנה טובה יותר של מה עוברי דג הזברה נראית כמו וסוגי שינויים מורפולוגיים המתרחשות על פני ontogeny.
בפגישה הבאה מעבדה, סטודנטים קיבלו עוברי דג הזברה שבה מאחלים נעשו בעבר. הם התבקשו ללמוד לתאר את דפוסי ביטוי גנים עבור כל גן של עניין (riboprobe בשימוש). עוברים המשמש מאחלים נגזרו הזדווגויות בין חברי קו ace/fgf8a הטרוזיגוטיים. על סמך ירושה מנדל, 25% עוברים מן ההזדווגויות ace/fgf8a היו אמורים להיות מוטנטים הומוזיגוטים ו להציג פגמים רבים של מבנים אנטומיים התמקדה בקורס זה. על פי דיווחים שפורסמו ותצפיות פורסם במעבדה Albertson, מומים במוח looping לב לא תקין היו צפויים, כמו גם ליקויים somites (Brand et al, 1996;. Albertson ו Yelick, 2005; תצפיות אישי).
הסטודנטים התבקשו לבדוק את כל דגימות, סוג בר (בעלי חיים הטרוזיגוטיים הם נבדלים אחים סוג בר בשלבים המוקדמים של הפיתוח) לבין מוטציות הומוזיגוטים, עבור כל תבנית ביטוי הגן הציגו. לאחר מכן הם התבקשו לכתוב דוחות מעבדה לתאר את התוצאות שלהם, ועל סמך הידע שלהם באנטומיה גנטיקה, ביטוי גנים פגומים איך ייתכן זירז מומים אנטומיים.
סטודנטים נראה לקבל את התרגיל מעבדה בהתרגשות ובסקרנות. רובם לא השתמשו מאחלים לפני התעניינו מאוד בחלק הזה של הקורס. הסטודנטים מצאו את דפוסים שונים של ביטוי גנים העוברים דג הזברה מסקרן, חלקם אף תיארו את דפוסי מכתים דמיינו ידי שיוך אותם עם הידוע עיצובים וסמלים, כמו פרצוף מחייך. דוחות מעבדה וכתוצאה מכך הראו התלמידים היו הבנה כללית של פרוטוקול מאחלים ואת הביטוי של גנים במבנים אנטומיים ספציפיים. התלמידים נדרשו גם להבין את פונקציות ספציפיות של גנים שנבדקו באמצעות מאחלים במהלך (Stickney et al, 2000 במעבדה;. Huelsken et al, 2002;. קומאראסינגות-Loganathan et al, 2008a,.. קומאראסינגות-Loganathan et al, 2008b ). היה ברור עם זאת, כי תלמידים מסוימים היה ידע מוגבל רקע של מסלולי איתות וגנים של עניין. מידע נוסף על מושגים אלה, מאחלים הרצאת מבוא עשוי להיות תוספת ברוכה השימוש מאחלים בעתיד קורסים ביולוגיה השוואתי החולייתנים.
מאז פרוטוקול בדרך כלל לוקח ארבעה ימים רצופים, תלוי בלוח הזמנים של הקורס, התלמידים יכולים רק להיות מסוגל להשלים חלק בניסוי בכיתה המורה חייב להיות אחראי על שאר. בשיעור ביולוגיה חוליות השוואתי שלנו, התלמידים סיימו את התגובות מכתים במעבדה, ואילו עוזר הוראה לבצע את כל השלבים הקודמים. אם הוא מעדיף את התלמידים לבצע מאחלים בכיתה, פרוטוקול ניתן לחלק את יחידות משנה שניתן לבצע על מפגשי מעבדה מספר, תלוי במסגרת הזמן של הכיתה. אם זה לא ריאלי עבור התלמידים לבצע את הפרוטוקול כולו, כפי שהיה כאן בגלל הפגישה במעבדה רק פעם בשבוע, סטודנטים יכולים להוסיף את הפתרון מכתים בתחילת בכיתה, בהתאם riboprobe בשימוש, יש מכתים המלא בתוך שעה. הזמן שלוקח את הכתם לפתח משתנה מאוד עם כל riboprobe ועוד מגוון של תנאי הניסוי, ויש קבוע מראש לפני השיעור. יש לציין, אם התלמידים יהיה רק לפתח את הכתם במעבדה, מדריכים יהיה אחראי על כל השלבים הקודמים, וזה ידרוש זמן ומאמץ משמעותיים מחוץ לכיתה. אם תרצה, חלופה קצרה לאחל יכול להיות אימונוהיסטוכימיה, באמצעות תוויות נוגדן לדמיין לוקליזציה חלבון, אולם בשלב זה, דג הזברה נוגדנים ספציפיים עבור גנים התפתחותיים אינם זמינים. אפשרות נוספת תהיה לבצע מאחל בעלי החוליות השונותnd יש לתלמידים להשוות את דפוסי הביטוי של אותם גנים באורגניזמים שונים (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. אורגניזמים דגם מתעוררים, 2008; אורגניזמים דגם מתעוררים, 2010).
מטרת העל של שימוש משאלה קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה היה כדי להדגים לתלמידים איך בשיטות ביולוגיות מולקולריות משמשים במחקר ופיתוח אנטומי. היא גם סיפקה הזדמנות לתלמידים לשער, כיצד שינו ביטוי גנים עשויה להוביל לא רק מומים התפתחותיים, אלא גם שינוי אבולוציוני. פורמלית כמו בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית (המכונה לעתים קרובות "Evo-Devo"), שדה זה הולך וגדל במהירות של המחקר נועד לקשר גנוטיפ לבין פנוטיפ באמצעות פיתוח, וכדי להבהיר בסיסים מכניסטית פוטנציאל של שינוי אבולוציוני. עם עלייתו של תחום זה, אקולוגים יותר, ביולוגים האורגניזם, ו פיזיולוגים הם שימוש בטכניקות מולקולריות במחקר שלהם. אנו טוענים כי השימוש משאלה קורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה יעזור לשמור על תוכנית הלימודים מעודכן עם ההתקדמות הטכנולוגית והמושגית הנוכחית המחקר, כדי להקל על היישור האופקי יותר קורסים בביולוגיה ברמה העליונה על ידי שילוב של תת תחומים ביולוגיים. יתר על כן, גישה אינטגרטיבית זו תספק לסטודנטים הזדמנות ללמוד מגוון של טכניקות מחקר ביולוגי במהלך אחד, המוביל השכלה מגוונת יותר וקידום המחקר המדעי בעתיד תחומית.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את החוג לביולוגיה באוניברסיטת סירקיוז, ד"ר מרילין קר עבור תפקידם בממשל של הקורס החולייתנים השוואתי ביולוגיה. המעבדה Albertson נתמך על ידי מענק R21DE019223 מן המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial, וכן מענק R01AG031922 מן המכון הלאומי לבריאות / המכון הלאומי להזדקנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher Scientific | 2300000 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Isopropanol | Acros Organics | 42383-0010 | |
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | |
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher Scientific | 1495911B | |
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Biolabs | varies | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma-Aldrich | D5758-25mL | |
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher Scientific | s608500 | |
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher Scientific | bp13321 | |
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma-Aldrich | 45-E1510 | |
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher Scientific | BP655-1 | |
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher Scientific | BP2582200 | |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Group | 11277073910 | |
| T3 RNA Polymerase | Roche Group | 1031163 | |
| T7 RNA Polymerase | Roche Group | 10881767001 | |
| SP6 RNA Polymerase | Roche Group | 810274 | |
| Protector Rnase Inhibitor | Roche Group | 3335399001 | |
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche Group | 4716728001 | |
| EDTA molecular biology reagent | Sigma-Aldrich | e5134-500G | |
| Lithium Chloride 100 g | Fisher Scientific | L121100 | |
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher Scientific | BP357-1 | |
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher Scientific | a38500 | |
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher Scientific | o4042500 | |
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher Scientific | bp3991 | |
| Tween 20 500 ml | Fisher Scientific | bp337500 | |
| Methanol 5 L | Fisher Scientific | A4124 | |
| Proteinase K 50 mg | Fisher Scientific | bp170050 | |
| Formamide 1 L | Fisher Scientific | F841 | |
| 20x SSC 1 L | Fisher Scientific | bp13251 | |
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher Scientific | a940500 | |
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma-Aldrich | r7876-2.5KU | |
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher Scientific | bp252450 | |
| Maleic acid R 500 g | Fisher Scientific | o3417500 | |
| Sodium Chloride 500 g | Fisher Scientific | s271500 | |
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher Scientific | s318500 | |
| Blocking Reagent | Roche Group | 11096176001 | |
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | |
| Anti DIG AP fragments | Roche Group | 11093274910 | |
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher Scientific | bp1759500 | |
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher Scientific | m33500 | |
| BCIP 3 ml | Roche Group | 11383221001 | |
| NBT 3 ml | Roche Group | 11383213001 | |
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher Scientific | AC158920025 | |
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR international | 62406-165 | |
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | |
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | |
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | |
| 2 Parafilm 2" x 250 ft | Fisher Scientific | s37441 | |
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific, Inc. | 1020-2520 | |
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-3000 | |
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-0006 | |
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific, Inc. | 1111-2021 | |
| Aluminum Foil | Grocery Store | ||
|
|||
References
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
- Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).
- Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 128, 3081-3094 (2001).
- Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., Nüsslein-Volhard, C. Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain. Development. 123, 179-190 (1996).
- Clark, M. In situ Hybridization: Laboratory Companion. , Wiley-VCH. (2003).
- D'Costa, A., Shepherd, I. T. Zebrafish development and genetics: Introducing undergraduates to developmental biology and genetics in a large introductory laboratory class. Zebrafish. 6, 169-177 (2009).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 1. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2008).
- Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M. Wnt signaling in limb organogenesis. Organogenesis. 4, 109-115 Forthcoming.
- Geetha-Loganathan, P., Nimmagadda, S., Scaal, M., Huang, R., Christ, B. Wnt signaling in somite development. Ann Anat. 190, 208-222 Forthcoming.
- Huelsken, J., Behrens, J. The Wnt signaling pathway. J Cell Sci. 15, 3977-3978 (2002).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Oates, A. C., Mueller, C., Ho, R. K. Cooperative function of deltaC and her7 in anterior segment formation. Dev. Biol. 280, 133-149 (2005).
- Pizard, A., Haramis, A., Carrasco, A. E., Franco, P., López, S., Paganelli, A. Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 14, (2004).
- Reifers, F., Bohli, H., Walsh, E. C., Crossley, P. H., Stainier, D. Y., Brand, M. Fgf8 is mutated in zebrafish acerebellar (ace) mutants and is required for maintenance of midbrain-hindbrain boundary development and somitogenesis. Development. 125, 2381-2395 (1998).
- Schmoldt, A., Forecki, J., Hammond, D. R., Udvadia, A. J. Exploring differential gene expression in zebrafish to teach basic molecular biology skills. Zebrafish. 6, 187-199 (2009).
- Schoenwolf, G. C. Laboratory Studies of Vertebrate and Invertebrate Embryos: Guide and Atlas of Descriptive and Experimental Development. , 9th Edition, Pearson Education- Benjamin Cummings. Upper Saddle River, NJ. (2008).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H. Somite development in zebrafish. Dev Dyn. 219, 287-303 (2000).
- Weinberg, E. S., Allende, M. L., Kelly, C. S., Abdelhamid, A., Murakami, T., Andermann, P., Doerre, O. G., Grunwald, D. J., Riggleman, B. Developmental regulation of zebrafish MyoD in wild-type, no tail and spadetail embryos. Development. 122, 271-280 (1996).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Dev. Biol. 214, 23-37 (1999).
