A estratégia para identificar mutações de novo em Distúrbios comuns, tais como autismo e esquizofrenia

Summary

Estratégia de genética molecular para encontrar mutações de novo causando doenças comuns, tais como autismo e esquizofrenia.

Abstract

Existem várias linhas de evidência apoiando o papel de mutações de novo como um mecanismo para doenças comuns, tais como autismo e esquizofrenia. Primeiro, a taxa de mutação de novo em seres humanos é relativamente alto, assim que novas mutações são gerados em alta freqüência na população. No entanto, mutações de novo não foram relatados na maioria das doenças comuns. Mutações em genes, levando a doenças graves, onde há uma forte seleção negativa contra o fenótipo, como letalidade em estágios embrionários ou aptidão reprodutiva reduzida, não será transmitido para vários membros da família e, portanto, não serão detectados pelo mapeamento genético de ligação ou associação estudos. A observação de concordância muito alta em gêmeos monozigóticos e concordância muito baixo em gêmeos dizigóticos também apoia fortemente a hipótese de que uma fração significativa dos casos pode resultar de novas mutações. Tal é o caso de doenças como autismo e esquizofrenia. Em segundo lugar, apesar de reduzida aptidão reprodutiva ¹ e extremamente variável fatores ambientais, a incidência de algumas doenças é mantida em todo o mundo a uma taxa relativamente alta e constante. Este é o caso para o autismo e esquizofrenia, com uma incidência de aproximadamente 1% em todo o mundo. Carga mutacional pode ser pensado como um equilíbrio entre a seleção a favor ou contra uma mutação deletéria e sua produção por mutação de novo. Menores taxas de reprodução constituir um fator de seleção negativa que deve reduzir o número de alelos mutantes na população, levando a prevalência da doença diminuiu. Estas pressões seletivas tendem a ser de diferente intensidade em diferentes ambientes. No entanto, esses transtornos mentais graves têm sido mantidos em uma prevalência relativamente alta constante da população em todo o mundo através de uma ampla gama de culturas e países, apesar de uma forte seleção negativa contra eles ^dois. Este não é o que se poderia prever em doenças com aptidão reprodutiva reduzida, a menos que houvesse uma alta taxa de mutação nova. Finalmente, os efeitos da idade paterna: há um aumento significativo do risco da doença com o aumento da idade paterna, o que poderia resultar do aumento da idade paterna relacionados em mutações de novo. Este é o caso para o autismo ea esquizofrenia ^3. A relação homem-mulher da taxa de mutação é estimado em cerca de 4-6:1, presumivelmente devido a um maior número de células germinativas divisões com a idade no sexo masculino. Portanto, podemos prever que as mutações de novo seria mais freqüentemente vêm os homens, sobretudo do sexo masculino mais velhos ^4. A alta taxa de novas mutações podem, em parte, explicar por que estudos genéticos têm até agora não conseguiram identificar muitos genes predisponentes para genes complexos doenças, tais como autismo e esquizofrenia, e por que as doenças têm sido identificados para apenas 3% dos genes no genoma humano . Identificação de mutações de novo como uma causa de uma doença exige uma abordagem orientada molecular, que inclui os pais a estudar e indivíduos afetados. O processo para determinar se a base genética de uma doença pode resultar em parte de mutações de novo e da abordagem molecular para estabelecer esta relação será ilustrada, usando o autismo ea esquizofrenia como exemplos.

Protocol

1. Seleção de doença que pode ser causada por mutações de novo

Uma doença que corresponde aos seguintes critérios podem se encaixar com a hipótese de mutação de novo:

1. A aptidão reprodutiva é reduzida.
2. A freqüência da doença é relativamente alta e constante, apesar amplamente variados ambientes.
3. A doença é associada a um maior idade paterna.
4. A ligação clássico e estudos de associação não conseguiu explicar uma fração significativa da hereditariedade da doença.
5. Os dados com gêmeos de apoiar um modelo novo.

Análise da probabilidade de que uma doença comum, onde as mutações de novo pode em parte explicar a base genética é um primeiro passo crítico.

2. Seleção de casos e amostras de DNA

Seleção de amostras adequadas é fundamental para o sucesso da identificação de mutações de novo. Para maximizar a chance de encontrar mutações de novo, nós recomendamos o seguinte:

1. Selecionar os casos com idade precoce de início fenótipo, grave, com pais não afetados, pais mais velhos e sem história familiar da doença prolongada.
2. Escolha pacientes cujos DNAs disponíveis são suficientes para conduzir o estudo. Especialmente crítico é a disponibilidade de DNA a partir de uma fonte de células primárias que não foi submetido a cultura (por exemplo, DNA de sangue ou saliva DNA),
3. A disponibilidade de ambos os pais DNA é fundamental para determinar o status de transmissão mutação (vs herdou de novo). Disponibilidade de novos grupos afetados e controles normais é necessário para os estudos de validação genética uma vez que genes candidatos são identificados.
4. Estimar o tamanho da amostra com base na taxa de mutações, a quantidade de genes para ser exibido ea estimativa da fração de casos que podem resultar de uma mutação de novo.

3. Gene resequencing; duas abordagens principais

1. Alta qualidade seqüenciamento baixa taxa de transferência
   Esta abordagem é baseada em genes as abordagens candidato.
   1. Seleção de genes candidatos (s)
      Selecionar o melhor candidato genes com base em um sistema de pontuação que é construído em 6 critérios principais. Em seguida, calcular o total que correspondia à soma de todos os pontos atribuídos usando os seis critérios relacionados na Tabela 1. Veja o exemplo do nosso projeto na figura 1 do selecionado e não selecionado distribuição genes.
      
      Tabela 1. Critérios utilizados para a seleção de genes candidatos
      
      
      Figura 1. Gráfico mostrando a distribuição dos genes selecionados e não selecionados para o seqüenciamento em nosso projeto. Obtivemos uma distribuição de genes classificados por propriedades candidato por genes de classificação de acordo com seu valor de pontuação. Por exemplo, SHANK3 e NRXN1 genes, dois genes que encontramos mutação de novo, teve uma pontuação de 7 e 6 respectivamente (o máximo é 12).
   2. Primers projeto usando software Primers3 através Exonprimer. Apenas codificação região e junção de emenda devem ser cobertos, incluindo um extra de 50 pares de base em cada lado do exon.
   3. Condições de otimizar o PCR para a escolha de Taq, volume de reação, etc
   4. Otimizar todos os fragmentos de PCR
   5. Amplificar 5 ng de DNA genômico extraído de amostras de sangue de acordo com procedimentos padrão
   6. Antes de enviar para o seqüenciamento, fazer controle de qualidade de seus produtos PCR carregando um gel de agarose 2%. Selecionados aleatoriamente amostras.
   7. A seqüência de produtos de PCR em um analisador de DNA em uma fita. Um fragmento é considerado sucesso seqüenciado se a análise de mais de 90% dos traços é possível. Isto é aplicável para uma exibição em grande escala.
   8. Detecção de variantes
      1. Use ferramentas para detecção e genotipagem das variações genômicas, tais como PolyPhred, Polyscan Surveyor e Mutação. Uma combinação de mais de 2 ferramentas de detecção é o ideal. Por exemplo, PolyPhred v.5 e v.6 PolyPhred com as configurações padrão não detectam as mesmas variações. Polyscan v.3 tem uma taxa de mutação mais elevada de falsos positivos de SNPs (96%) e menos para o indels (93%). PolyPhred v.6 não detectou a maioria das indels verdade, mas tem uma taxa de mutação de falsos positivos (para indels) inferior Polyscan total v.3 (90%). Devemos remover a opção de detecção de SNPs Polyscan v.3 e manter os dois PolyPhred v.5 e v.6 PolyPhred para a detecção da variante. Surveyor mutação e Polyscan são melhores para detectar indels. Nota: A opção de detecção de SNP não deve ser aplicado quando se utiliza Polyscan. Apenas o "INDEL" opção deve estar ligado. Polyscan gerado a muitos falsos positivos para a detecção de SNP.
      2. Para cada variantes exônico único romance detectado, confirmá-la manualmente por reamplifying fragmento e resequúnicos que experimentam o probando e ambos os pais usando primers reverse e encaminhar para eliminar qualquer artefato técnico.
2. Todo exome seqüenciamento
   Esta abordagem é um seqüenciamento de alto rendimento visando a maioria das regiões codificantes do genoma humano. Estamos agora a utilizar esta nova abordagem no nosso laboratório, acelerando a detecção de genes candidatos em potencial.
   1. Fim do "SureSelect Exon Todos os Humanos" alvo a região de codificação de mais de 16 mil genes (50 MB do genoma) desenhado por Agilent ou qualquer outro produto similar por outros como Roche. Antes de encomendar o kit de captura, as plataformas de seqüenciamento deve ser determinar (Illumina vs sólido).
   2. Fazer a captura de acordo com o protocolo Agilent
   3. Seqüência o produto em sua respectiva plataforma da próxima geração disponível
   4. Detecção de variantes a partir do seqüenciamento exome todo: Várias ferramentas de bioinformática para detecção e genotipagem das variações genômicas a partir da plataforma de sequenciamento de última geração estão disponíveis, tais como BWA, Bfast, Bioscope que irão realizar as alinhamento. Após o qual livremente disponíveis ferramentas adicionais a jusante (por exemplo SAM ferramentas, Varscan, Annovar) seriam necessárias para chamar e anotar as variantes. Software comercial que integra o alinhamento de seqüência e chamando variante e anotação também estão disponíveis, tais como, NextGen (Softgenetics), Bio CLC, e outros

4. Priorização de variantes genômicas

Variantes identificadas são então priorizados para acompanhamento de acordo com sua probabilidade de ser de novo e deletério à proteína ou mRNA função e / ou estrutura. A variante de acompanhamento para a detecção de prioridades de novo variante deve ser como segue:

1. Variações exclusivas (observado uma vez em um único caso)
2. Variações não está presente nos pais
3. Proteína-truncando variações: nonsense, frameshift indels levando a mutações e emendas.
4. Variação missense e silencioso previsto para ser funcionalmente perturbador (por exemplo, afetam splicing do mRNA). Use SIFT Polyphen e PANTHER para efeito de previsão funcionais na proteína.

Se estiver usando seqüenciamento exome todo, a seleção de genes candidatos pode ser usado como uma estratégia para priorizar variantes para estudos adicionais.

5. Validação genética

1. Resequence o gene inteiro em casos de pacientes adicionais (para identificar outras mutações causais) e nos controles. As amostras de controle serão utilizados para avaliar as freqüências alélicas das variantes priorizados. Qualquer gene que contém pelo menos duas diferentes mutações de novo deletérios (splicing nonsense, quadro de leitura, e previu missense prejudiciais) encontrada em pacientes diferentes (mas não em amostras de controlo ou de bases de dados públicas) deve ser altamente priorizadas para estudos de validação adicional. Isto inclui: um teste) para um defeito de splicing potencial em linhagens de células linfoblastóides derivado do paciente. Em nossa experiência, a maioria dos genes rendimento RT-PCR produtos de linhas celulares linfoblastóides, 2) investigar o nível de expressão alterada de proteínas através da análise quantitativa blot ocidental de extratos protéicos das linhas de células linfoblastóides e 3) ensaio da mutação / gene ao nível funcional em animal (c elegans, Zebrafish) e modelos de celulares de linha como feito anteriormente por nosso grupo (ex: 5,6).

6. Resultados representativos:

Na sequência deste protocolo, que foram capazes de identificar novos genes para a esquizofrenia e autismo. Um exemplo é a nossa descoberta do gene recentemente SHANK3 (Figura 2). Duas diferentes mutações de novo no gene SHANK3, uma mutação nonsense encontradas em três irmão afetado e uma mutação missense em uma fêmea afetada.

Figura 2. (A) A segregação da mutação nonsense R1117X em três irmãos afetados da família PED 419. O probando é indicado pela seta. (B) segregação da mutação missense R536W no probando, mas não seu irmão não afetado no PED 56.

Discussion

O procedimento descrito aqui tem como objetivo identificar certas doenças comuns que resultam provavelmente, em parte, a partir de mutações de novo, e para provar esta hipótese. Mutações de novo são um mecanismo bem estabelecido para o desenvolvimento de uma série de doenças, por exemplo, as síndromes de câncer hereditário, mas tem sido pouco explorado em doenças comuns. Isto em parte os resultados dos desafios técnicos envolvidos na identificação de mutações de novo, o que exige o seqüenciamento de grandes quantidades de DNA, que só muito recentemente se tornou rentável, com o advento do seqüenciamento da próxima geração. Além disso, a taxa de mutação de novo em humanos foi, até muito recentemente, apenas uma estimativa. Só muito recentemente tem havido relatórios diretamente determinar a taxa de mutação nos humanos. Antes dessas medidas, era difícil prever o tamanho da amostra necessário para este tipo de estudo e para determinar se a taxa de mutação observada de novo é maior do que a taxa de referência. Seqüenciamento de genes candidatos em relação genoma inteiro? Como a maioria das mutações de doenças relatadas são missense / nonsense e mutações são mutações splice site (de acordo com o site HGMD) nossa estratégia de triagem identificaria mais de 68% das mutações conhecidas. Há também uma clara relação entre a gravidade da substituição de aminoácidos e da probabilidade de um fenótipo clínico. Em comparação com uma substituição do ácido amino conservador, uma mudança absurdo é 9,0 vezes mais propensos a apresentar-se clinicamente 7. Assim, neste momento genes candidatos seqüenciamento é a estratégia mais rentável.

O sucesso do procedimento descrito depende de vários passos críticos, que são descritos em detalhes e ilustrados usando dois exemplos, o autismo ea esquizofrenia. Existem muitas armadilhas que devem ser evitadas, como qual a doença para selecionar, o que os pacientes a fonte de tela, de DNA, e os detalhes de como eficiência na identificação de mutações de novo. Nós fornecemos um método para determinar de forma mais eficiente a fração de casos de qualquer doença que resulta de tais mutações espontâneas.