Summary
Moleculair genetische strategie voor het vinden van de novo mutaties veroorzaken veel voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie.
Abstract
Er zijn verschillende lijnen van bewijs van de rol van de novo mutaties als een mechanisme voor veel voorkomende aandoeningen, zoals autisme en schizofrenie. Ten eerste, de de novo mutatie snelheid in de mens is relatief hoog, zodat nieuwe mutaties worden gegenereerd op een hoge frequentie in de populatie. Echter, de novo mutaties niet gemeld in de meest voorkomende ziekten. Mutaties in genen die leiden tot ernstige ziekten waarbij er een sterke negatieve selectie tegen het fenotype, zoals de letaliteit in de embryonale fase of verminderde reproductieve fitness, zullen niet worden doorgegeven aan meerdere gezinsleden, en zal daarom niet worden gedetecteerd door de koppeling gen in kaart brengen of vereniging studies. De waarneming van zeer hoge concordantie in eeneiige tweelingen en een zeer lage concordantie in twee-eiige tweelingen ook sterk ondersteunt de hypothese dat een belangrijk deel van de gevallen kan het gevolg zijn van nieuwe mutaties. Dat is het geval voor ziekten zoals autisme en schizofrenie. Ten tweede, ondanks de verlaging van de reproductieve fitness 1 en uiterst variabel omgevingsfactoren, is de incidentie van sommige ziekten blijven wereldwijd op een relatief hoge en constante snelheid. Dit is het geval voor autisme en schizofrenie, met een incidentie van ongeveer 1% wereldwijd. Mutatie-belasting kan worden gezien als een balans tussen de selectie voor of tegen een schadelijke mutatie en de productie ervan door de novo mutatie. Lagere tarieven van de voortplanting vormen een negatieve selectie factor die het aantal mutante allelen moet verminderen in de populatie, wat uiteindelijk leidt tot een verminderde prevalentie van de ziekte. Deze selectieve druk de neiging om van verschillende intensiteit in verschillende omgevingen. Toch hebben deze ernstige psychische stoornissen gehandhaafd op een constant relatief hoge prevalentie in de wereldwijde populatie over een brede waaier van culturen en landen, ondanks een sterke negatieve selectie tegen hen twee. Dit is niet wat men zou kunnen voorspellen bij ziekten met een verminderde reproductieve fitness, tenzij er een hoog tempo nieuwe mutatie. Ten slotte is de effecten van de vaderlijke leeftijd: er is een significant verhoogd risico van de ziekte met toenemende vaderlijke leeftijd, die zou kunnen voortvloeien uit de leeftijd gerelateerde toename in vaderlijke de novo mutaties. Dit is het geval voor autisme en schizofrenie 3. De man-naar-vrouw-verhouding van mutaties wordt geschat op ongeveer 4-6:1, vermoedelijk als gevolg van een hoger aantal kiem-celdelingen met de leeftijd bij mannen. Daarom zou een voorspellen dat de novo mutaties zouden vaker komen van mannen, vooral oudere mannen 4. Een hoog percentage van nieuwe mutaties kan verklaren ten dele waarom genetische studies tot nu toe niet in geslaagd om vele genen die predisponeren voor complexen ziekten genen, zoals autisme en schizofrenie te identificeren, en waarom ziekten zijn aangemerkt voor slechts 3% van de genen in het menselijk genoom . Identificatie voor de novo mutaties als oorzaak van een ziekte vraagt om een doelgerichte moleculaire benadering, die het bestuderen van de ouders en betrokken onderwerpen omvat. Het proces om te bepalen of de genetische basis van een ziekte kan leiden tot een deel van de novo mutaties en de moleculaire benadering om vast te stellen deze koppeling zal worden geïllustreerd met behulp van autisme en schizofrenie als voorbeelden.
Protocol
1. Selectie van ziekte die kan worden veroorzaakt door de novo mutaties
Een ziekte die overeenkomt met de volgende criteria kan aansluiten bij de de novo mutatie hypothese:
- De reproductieve conditie is verminderd.
- De frequentie van de ziekte is relatief hoog en constant, ondanks zeer uiteenlopende omgevingen.
- De ziekte is geassocieerd met een hoger vaderlijke leeftijd.
- De klassieke linkage en associatie studies niet tot een significante fractie van de ziekte erfelijkheid te verklaren.
- De dubbele concordantie gegevens ondersteunen een de novo model.
Analyse van de waarschijnlijkheid dat een veel voorkomende ziekte, waar de novo mutaties kunnen voor een deel verklaren de genetische basis is een belangrijke eerste stap.
2. Selectie van de gevallen en DNA-monsters
Selectie van geschikte monsters is van cruciaal belang voor het succes van de identificatie van de novo mutaties. Het maximaliseren van de kans op het vinden de novo mutaties, raden wij u het volgende:
- Selecteer de gevallen met vroege leeftijd van begin, ernstige fenotype, met onaangetast ouders, oudere vaders en zonder uitgebreide familie geschiedenis van de ziekte.
- Kies patiënten bij wie de beschikbare DNA's voldoende zijn om de studie uit te voeren. Vooral van belang is de beschikbaarheid van DNA van een primaire cel bron die niet werd onderworpen aan het kweken (bijv. bloed of speeksel DNA DNA),
- De beschikbaarheid van beide ouders DNA is van cruciaal belang om de mutatie transmissie status (erfelijk versus de novo) te bepalen. De beschikbaarheid van extra aangetast cohorten en normale controles is noodzakelijk voor genetische validatie studies als kandidaat-genen worden geïdentificeerd.
- Schat de steekproefgrootte op basis van de mutaties snelheid, de hoeveelheid genen te screenen en de raming van de fractie van de zaken die kunnen voortvloeien uit een de novo mutatie.
3. Gen resequencing; twee belangrijke benaderingen
- Hoge kwaliteit lage throughput sequencing
Deze aanpak is gebaseerd op de kandidaat-genen benaderingen.- Selectie van kandidaat-gen (s)
Selecteer de beste kandidaat-genen op basis van een score systeem dat is gebouwd op zes belangrijke criteria. Vervolgens berekent het totaal dat overeenkwam met de som van alle toegekende punten met behulp van de zes criteria vermeld in tabel 1. Zie het voorbeeld van ons project in figuur 1 van geselecteerde en niet geselecteerde genen distributie.
Tabel 1. Criteria voor de selectie van kandidaat-gen
Figuur 1. Grafiek toont de verdeling van de geselecteerde en niet geselecteerde genen voor sequencing in ons project. Wij kregen een verdeling van genen in volgorde van de kandidaat-eigenschappen door het sorteren van genen op basis van hun score waarde. Bijvoorbeeld SHANK3 en NRXN1 genen, twee genen die we hebben gevonden de novo mutatie, had een score 7 en 6 (maximum is 12). - Ontwerp met behulp van primers Primers3 software via Exonprimer. Alleen coderend gebied en splice knooppunt moeten worden gedekt met een extra 50 basenparen aan elke kant van het exon.
- Optimaliseren van PCR-condities voor de keuze van de Taq, reactie volume, enz.
- Optimaliseren van alle PCR-fragmenten
- Amplify 5 ng genomisch DNA uit bloedmonsters volgens standaardprocedures
- Voordat u voor sequencing, doe kwaliteitscontrole van uw PCR-producten door het laden van een 2% agarose gel. Geselecteerde willekeurig monsters.
- Volgorde van de PCR-producten op een DNA Analyzer op een streng. Een fragment wordt als succesvol volgorde als de analyse van meer dan 90% van de sporen is mogelijk. Dit is van toepassing voor een grootschalige screening.
- Varianten Detectie
- Gebruik tools voor detectie en genotypering van genomische variaties zoals PolyPhred, Polyscan en mutatie Surveyor. Een combinatie van meer dan 2 detectie-instrumenten is ideaal. Bijvoorbeeld PolyPhred v.5 en PolyPhred v.6 met de standaard instellingen niet detecteren dezelfde variaties. Polyscan v.3 heeft een hogere false positive mutatie tarief voor SNPs (96%) en minder voor de INDELs (93%). PolyPhred V.6 niet ontdekt de meerderheid van de ware INDELs, maar hebben een vals-positieve mutatie tarief (voor INDELs) lager dan Polyscan v.3 totaal (90%). We moeten verwijderen de optie van SNP detectie voor Polyscan v.3 en houden zowel PolyPhred v.5 en PolyPhred v.6 voor variant detectie. Mutatie Surveyor en Polyscan zijn beter voor het opsporen van indels. Opmerking: De optie van de SNP-detectie mogen niet worden toegepast bij het gebruik van Polyscan. Alleen de "indel" optie moet worden ingeschakeld. Polyscan gegenereerd om een groot aantal vals positieve voor SNP-detectie.
- Voor elke unieke roman exonic varianten gedetecteerd, handmatig te bevestigen door reamplifying het fragment en resequencing de proband en beide ouders met behulp van reverse en forward primers aan een technisch artefact te elimineren.
- Selectie van kandidaat-gen (s)
- Hele exome sequencing
Deze aanpak is een high throughput sequencing gericht op de meerderheid van de coderende gebieden van het menselijke genoom. We zijn nu op dit moment gebruik van deze nieuwe aanpak in ons lab, het versnellen van de detectie van potentiële kandidaat-genen.- Bestel de "SureSelect Human Alle Exon" gericht op het coderende gebied van meer dan 16.000 genen (50 MB van het genoom), ontworpen door Agilent of een ander soortgelijk product door anderen, zoals Roche. Voorafgaand aan de vast te leggen kit bestellen, moet de volgorde platforms te bepalen (Illumina vs vast).
- Doe de vangst volgens het protocol Agilent
- Volgorde het product op uw eigen beschikbare next-generation platform
- Variant detectie van de hele exome sequencing: Diverse bioinformatica tools voor detectie en genotypering van genomische afwijkingen van de next-generation sequencing platform beschikbaar zijn, zoals BWA, Bfast, Bioscope die de uitlijning zal presteren. Waarna extra vrij beschikbare downstream tools (bijvoorbeeld SAM gereedschap, Varscan, Annovar) zou het nodig had om te bellen en annoteren van de varianten. Commerciële software die volgorde uitlijning en variant bellen en annotatie bevat zijn ook beschikbaar, zoals, NextGen (Softgenetics), CLC Bio, en anderen
4. Genomic varianten prioritering
Geïdentificeerde varianten worden vervolgens geprioriteerd voor de follow-up op basis van hun waarschijnlijkheid in het zijn de novo en schadelijk zijn voor eiwit of mRNA de functie en / of structuur. De variant follow-up prioriteiten voor de detectie van de novo variant moet worden als volgt:
- Unieke variaties (een keer waargenomen in een enkel geval)
- Variaties niet in de ouders
- Eiwit-truncerende variaties: onzin, indels leidt tot frameshift en splicing mutaties.
- Missense en stille variatie voorspeld functioneel storend (bijvoorbeeld invloed hebben op mRNA splicing). Gebruik Polyphen, SIFT en Panther voor functionele voorspelling effect op het eiwit.
Als u hele exome sequencing, kan de selectie van kandidaat-genen gebruikt worden als een strategie voor de prioriteitstelling varianten voor verdere studie.
5. Genetische validatie
- Resequence het hele gen in andere patiënt gevallen (om andere oorzakelijke mutaties te identificeren) en in de controlegroep. De controlemonsters zal worden gebruikt om allelische frequenties van de prioriteit varianten te evalueren. Elk gen die ten minste twee verschillende de novo schadelijke mutaties (onzin, splicing, frameshifts, en voorspelde schade missense) gevonden in verschillende patiënten (maar niet in controle monsters of openbare databases) moet sterk worden prioriteit voor verdere validatie studies. Dit omvat: 1) het testen voor een mogelijke splicing defect in lymfoblastoïde cellijnen afgeleid van de patiënt. In onze ervaring, de meeste genen opbrengst RT-PCR producten uit lymfoblastoïde cellijnen, 2) veranderde eiwit expressie niveaus te onderzoeken door middel van kwantitatieve Western blot analyse van eiwitten uittreksels uit de lymfoblastoïde cellijnen en 3) verder te testen de mutatie / gen op functioneel niveau in dier (c elegans, zebravis) en cellijn-modellen, zoals eerder gedaan door onze groep (ex: 5,6).
6. Representatieve resultaten:
Naar aanleiding van dit protocol, waren we in staat om nieuwe genen voor schizofrenie en autisme te identificeren. Een voorbeeld is onze recent SHANK3 ontdekking van genen (figuur 2). Twee verschillende de novo mutaties in SHANK3 gen, een nonsense mutatie gevonden in drie betrokken broer en een missense mutatie in een betrokken vrouw.
Figuur 2. (A) Scheiding van de R1117X nonsense mutatie in drie betrokken broers van de familie PED 419. De proband wordt aangegeven door de pijl. (B) Scheiding van de R536W missense mutatie in de proband, maar niet haar niet-getroffen broer in PED 56.
Discussion
De procedure hier beschreven beoogt de identificatie van specifieke gemeenschappelijke ziekten die waarschijnlijk leiden, voor een deel, van de novo mutaties, en om deze hypothese te bewijzen. De novo mutaties zijn een gevestigde mechanisme voor de ontwikkeling van een aantal ziekten, zoals bijvoorbeeld de erfelijke kanker syndromen, maar is slecht onderzocht in voorkomende ziekten. Dit voor een deel het gevolg van de technische uitdagingen die betrokken zijn bij de identificatie van de novo mutaties, die de opeenvolging van grote hoeveelheden DNA, waarin alleen sprake is vereist zeer kort rendabel met de komst van de Next Generation Sequencing. Daarnaast is de de novo mutatie snelheid in de mens was, tot voor kort, slechts een schatting. Pas zeer recent zijn er meldingen geweest direct het bepalen van de mutatie snelheid bij de mens. Voorafgaand aan deze metingen, was het moeilijk om de steekproefomvang die nodig is voor dit soort onderzoek te voorspellen en om te bepalen of de waargenomen de novo mutatie snelheid is groter dan de baseline. Sequencing kandidaat-genen versus hele genoom? Aangezien het merendeel van de gemelde ziekte mutaties zijn missense / nonsense mutaties en splice site mutaties (volgens HGMD web site) onze screening strategie zou identificeren meer dan 68% van de bekende mutaties. Er is ook een duidelijke relatie tussen de ernst van aminozuur vervanging en de kans op een klinische fenotype. In vergelijking met een conservatieve aminozuursubstitutie, een onzin verandering is 9,0 keer meer kans op klinisch presenteren 7. Dus op dit moment sequencing kandidaat-genen is de meest kosteneffectieve strategie.
Het succes van de geschetste procedure is afhankelijk van verschillende kritische stappen, die staan beschreven in detail en geïllustreerd met behulp van twee voorbeelden, autisme en schizofrenie. Er zijn vele valkuilen die moeten worden vermeden, zoals welke ziekte te selecteren, die patiënten te screenen, bron van DNA, en details over hoe ze efficiënt identificeren van de de novo mutaties. Wij bieden een methode om de meest efficiënte wijze het bepalen van de fractie van de gevallen van een ziekte die het gevolg is van een dergelijke spontane mutaties.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We danken onze financieringsbronnen Genome Canada en Genome Quebec, en de Universite de Montreal alsmede de financiering van de Canadese Stichting voor Innovatie voor de financiering van onze 'Synapse om Disease' (S2D) project.
References
- Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. Reproductive fitness in familial schizophrenia. Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).
- Jablensky, A. Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study. Psychol Med Monogr. , Suppl 20. 1-97 (1992).
- Malaspina, D. Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes. CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).
- DeLisi, L. E. A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder. Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).
- Gauthier, J. De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. , Forthcoming (2010).
- Piton, A. Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism. Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).
- Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes. Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).
