Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

Summary

Strategia di genetica molecolare per la ricerca di mutazioni de novo che causano malattie comuni come l'autismo e la schizofrenia.

Abstract

Ci sono diverse linee di prove a sostegno del ruolo delle mutazioni de novo come un meccanismo per malattie comuni, come l'autismo e la schizofrenia. In primo luogo, il tasso di mutazione de novo negli esseri umani è relativamente alto, in modo da nuove mutazioni sono generati ad una frequenza elevata nella popolazione. Tuttavia, mutazioni de novo, non sono state riportate nella maggior parte delle malattie comuni. Le mutazioni nei geni che porta a malattie gravi dove vi è una forte selezione negativa contro il fenotipo, come ad esempio letalità embrionale o nelle fasi ridotta capacità riproduttiva, non saranno trasmessi a più membri della famiglia, e quindi non verranno rilevati dalla mappatura genetica linkage o associazione studi. L'osservazione di concordanza molto elevata nei gemelli monozigoti e concordanza molto basso in gemelli dizigoti inoltre sostiene con forza l'ipotesi che una frazione significativa di casi possono derivare da nuove mutazioni. Tale è il caso di malattie come l'autismo e la schizofrenia. In secondo luogo, nonostante la riduzione di fitness riproduttiva ¹ e fattori ambientali estremamente variabili, l'incidenza di alcune malattie è mantenuta in tutto il mondo ad un tasso relativamente alto e costante. Questo è il caso per l'autismo e la schizofrenia, con un'incidenza di circa l'1% in tutto il mondo. Carico mutazionale può essere pensato come un equilibrio tra scelta a favore o contro una mutazione deleteria e la sua produzione da mutazione de novo. Abbassare i tassi di riproduzione costituiscono un fattore negativo di selezione che dovrebbe ridurre il numero degli alleli mutanti nella popolazione, in ultima analisi porta alla prevalenza della malattia è diminuita. Queste pressioni selettive tendono ad essere di diversa intensità in ambienti diversi. Tuttavia, questi disturbi mentali gravi sono stati mantenuti con una prevalenza costante relativamente alta nella popolazione di tutto il mondo attraverso una vasta gamma di culture e paesi, nonostante una forte selezione negativa contro di loro ^2. Questo non è ciò che si potrebbe prevedere in malattie con ridotta capacità riproduttiva, a meno che non vi era un alto tasso di mutazione. Infine, gli effetti dell'età paterna: vi è un aumento significativo del rischio della malattia con l'aumento dell'età paterna, che potrebbe derivare dalla crescita legate all'età paterna a mutazioni de novo. Questo è il caso per l'autismo e la schizofrenia ^3. Il maschio-femmina rapporto tra tasso di mutazione è stimato in circa 4-6:1, presumibilmente a causa di un maggior numero di cellule germinali divisioni con l'età nei maschi. Pertanto, si potrebbe prevedere che mutazioni de novo sarebbe più frequentemente vengono da maschi, soprattutto maschi più anziani ^4. Un alto tasso di nuove mutazioni possono in parte spiegare perché studi genetici non sono ancora riusciti a identificare molti geni predisponenti alle malattie complessi di geni, come l'autismo e la schizofrenia, e perché le malattie sono state identificate per solo il 3% dei geni nel genoma umano . Identificazione di mutazioni de novo come causa di una malattia che richiede un approccio mirato molecolare, che comprende i genitori lo studio e soggetti affetti. Il processo per determinare se la base genetica di una malattia può risultare in parte da mutazioni de novo e l'approccio molecolare per stabilire questo collegamento saranno illustrate, con l'autismo e la schizofrenia come esempi.

Protocol

1. Selezione di malattia che può essere causata da mutazioni de novo

Una malattia che corrisponde ai seguenti criteri può andare bene con la mutazione de novo ipotesi:

1. Il fitness riproduttiva è ridotta.
2. La frequenza della malattia è relativamente elevata e costante, nonostante le più diverse ambienti.
3. La malattia è associata con un'età superiore paterna.
4. Il legame classica e studi di associazione non è riuscito a spiegare una frazione significativa della ereditarietà della malattia.
5. I dati di concordanza gemelli sostenere un modello ex novo.

L'analisi del rischio che una malattia comune in cui mutazioni de novo può in parte spiegare la base genetica è un primo passo fondamentale.

2. Selezione dei casi e campioni di DNA

Selezione dei campioni necessari è fondamentale per il successo della identificazione di mutazioni de novo. Per massimizzare la possibilità di trovare mutazioni de novo, si raccomanda quanto segue:

1. Selezionare i casi con età precoce di insorgenza, fenotipo grave, con genitori non affetti, anziani padri e senza storia famiglia allargata della malattia.
2. Scegli pazienti il ​​cui DNA disponibili sono sufficienti per condurre lo studio. Particolarmente critica è la disponibilità di DNA da una fonte cellula primaria che non è stato sottoposto a coltura (ad esempio il DNA del sangue o DNA della saliva),
3. La disponibilità di entrambi i genitori del DNA è fondamentale al fine di determinare lo stato di trasmissione mutazione (ereditato vs de novo). Disponibilità di ulteriori coorti interessate e controlli normali è necessario per gli studi di convalida genetici una volta geni candidati sono identificati.
4. Stimare la dimensione del campione sulla base del tasso mutazioni, la quantità di geni per essere sottoposti a screening e la stima della frazione di casi che possono derivare da una mutazione de novo.

3. Gene risequenziamento; due approcci principali

1. Un elevato throughput di sequenziamento di bassa qualità
   Questo approccio si basa su approcci candidato geni.
   1. Selezione dei geni candidati (s)
      Selezionare i geni miglior candidato sulla base di un sistema di punteggio che si basa su 6 criteri principali. Poi calcolare il totale che corrispondeva alla somma di tutti i punti attribuiti utilizzando i sei criteri elencati nella Tabella 1. Vedi l'esempio del nostro progetto in figura 1 selezionati e non selezionati distribuzione geni.
      
      Criteri Tabella 1. Utilizzati per la selezione gene candidato
      
      
      Figura 1. Grafico mostra la distribuzione dei geni selezionati e non selezionati per il sequenziamento del nostro progetto. Abbiamo ottenuto una distribuzione di geni classificati in base alle proprietà candidato da geni ordinamento in base al loro valore di punteggio. Per esempio, SHANK3 e NRXN1 geni, due geni che abbiamo scoperto la mutazione de novo, avevano un punteggio rispettivamente di 7 e 6 (il massimo è 12).
   2. Primer di progettazione utilizzando il software attraverso Primers3 Exonprimer. Solo codifica regione e giunzione giunzione devono essere coperti anche un extra di 50 coppie di basi su ogni lato della esone.
   3. Ottimizzare le condizioni di PCR per la scelta di Taq, volume di reazione, ecc
   4. Ottimizzare tutti i frammenti di PCR
   5. Amplifica 5 ng di DNA genomico estratto da campioni di sangue secondo le procedure standard
   6. Prima di inviare per il sequenziamento, hanno il controllo di qualità dei vostri prodotti PCR caricando un gel di agarosio al 2%. Selezionato in modo casuale campioni.
   7. Sequenza i prodotti di PCR su un analizzatore di DNA su un filo. Un frammento è considerato sequenziato con successo se l'analisi di oltre il 90% delle tracce è possibile. Questo è applicabile per uno screening su larga scala.
   8. Varianti di rilevamento
      1. Utilizzare strumenti per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genomiche come PolyPhred, Polyscan e Surveyor mutazione. Una combinazione di più di 2 strumenti di rilevazione è l'ideale. Per esempio, PolyPhred v.5 e PolyPhred v.6 con le impostazioni predefinite non rilevano le stesse variazioni. V.3 Polyscan ha un più alto tasso di mutazione falsi positivi per SNP (96%) e meno per il indel (93%). PolyPhred v.6 non ha rilevato la maggioranza delle indel vero, ma hanno un tasso di falsi positivi mutazione (per indel) inferiore Polyscan complessivo v.3 (90%). Dobbiamo rimuovere l'opzione di rilevamento SNPs per v.3 Polyscan e mantenere entrambi PolyPhred v.5 e PolyPhred v.6 per il rilevamento di variante. Geometra mutazione e Polyscan sono migliori per la rilevazione indel. Nota: l'opzione di rilevamento SNP non dovrebbero essere applicate per l'uso Polyscan. Solo l'opzione "Indel" dovrebbe essere accesa. Polyscan generato a molti falsi positivi per la rilevazione di SNP.
      2. Per ogni uniche varianti exonic romanzo rilevato, confermare manualmente reamplifying il frammento e resequteleconferenza del probando ed entrambi i genitori con primer reverse e l'ora di eliminare qualsiasi artefatto tecnico.
2. Tutto exome sequenziamento
   Questo approccio è una sequenza ad alto rendimento mira la maggior parte delle regioni codificanti del genoma umano. Ora siamo attualmente usando questo nuovo approccio nel nostro laboratorio, accelerando l'individuazione di geni candidati potenziali.
   1. Ordina "SureSelect Umano Tutti Exon" intese a promuovere l'regione codificante di oltre 16.000 geni (50 MB del genoma) progettato da Agilent o qualsiasi altro prodotto simile da altri come Roche. Prima di ordinare il kit di cattura, le piattaforme di sequenziamento dovrebbe essere stabilire (Illumina vs solido).
   2. La cattura secondo il protocollo Agilent
   3. Sequenza del prodotto sul Vostro rispettivi disponibili piattaforma di nuova generazione
   4. Rilevamento delle varianti dal sequenziamento tutto exome: Diversi strumenti bioinformatici per la rilevazione e la genotipizzazione delle varianti genomiche dalla prossima generazione della piattaforma di sequenziamento sono disponibili come BWA, Bfast, Bioscope che eseguirà l'allineamento. Dopo di che strumenti aggiuntivi liberamente disponibili a valle (ad esempio strumenti SAM, Varscan, Annovar) sarebbero necessari per chiamare e annotare le varianti. Software commerciale che incorpora allineamento di sequenza e la chiamata variante e annotazioni sono disponibili anche come, NextGEN (Softgenetics), CLC Bio, e altri

4. Varianti genomiche priorità

Varianti individuate sono poi la priorità per il follow up in base alla loro probabilità di essere de novo e deleteri per la funzione delle proteine ​​e mRNA e / o la struttura. La variante di follow-up priorità per il rilevamento della variante de novo dovrebbe essere come segue:

1. Variazioni unica (osservata una volta in un caso singolo)
2. Variazioni non presenti nei genitori
3. Proteina tronca varianti: una sciocchezza, indel porta a frameshift e mutazioni di splicing.
4. Variazione missenso e silenziosa previsto per essere funzionalmente dirompenti (ad esempio, influenzare lo splicing). Usa Polyphen, SIFT e PANTHER per effetto previsione funzionali sulla proteina.

Se si utilizza il sequenziamento intero exome, la selezione di geni candidati può essere usato come una strategia di varianti priorità per ulteriori studi.

5. Convalida genetica

1. Resequence l'intero gene nei casi ulteriore paziente (per identificare altre mutazioni causali) e nei controlli. I campioni di controllo saranno utilizzati per valutare le frequenze alleliche di varianti priorità. Ogni gene contiene almeno due diverse mutazioni de novo deleterie (nonsense, splicing, mutazione, e previsto missenso dannose) si trovano in diversi pazienti (ma non nei campioni di controllo o banche dati pubbliche) dovrebbero essere altamente prioritario per gli studi di ulteriore validazione. Ciò include: 1) l'analisi per un difetto di splicing potenziale in linee cellulari linfoblastoidi derivate dal paziente. Nella nostra esperienza, la maggior parte dei geni resa RT-PCR prodotti da linee cellulari linfoblastoidi, 2) indagare alterati livelli di espressione delle proteine ​​da parte quantitativa Western blot di estratti proteici dalle linee linfoblastoidi e 3) verificare ulteriormente la mutazione / gene a livello funzionale in animale (c elegans, Zebrafish) e modelli linea cellulare come precedentemente fatto dal nostro gruppo (es: 5,6).

6. Rappresentante dei risultati:

A seguito di questo protocollo, siamo stati in grado di identificare nuovi geni per la schizofrenia e l'autismo. Un esempio è la recente scoperta del gene SHANK3 (Figura 2). Due diverse mutazioni de novo in SHANK3 gene, una mutazione nonsense trovati in tre fratello affetto e una mutazione missense in una femmina affetta.

Figura 2. (A) segregazione della mutazione nonsense R1117X in tre fratelli affetti di famiglia PED 419. Il probando è indicato dalla freccia. (B) segregazione della mutazione missense R536W nel probando, ma non lei non colpite fratello in PED 56.

Discussion

La procedura descritta qui si propone di individuare specifiche malattie comuni che probabile risultato, in parte, da mutazioni de novo, e per dimostrare questa ipotesi. Mutazioni de novo sono un meccanismo ben definito per lo sviluppo di una serie di malattie, per esempio il cancro sindromi ereditarie, ma è stato poco esplorato in malattie comuni. Questo in parte la conseguenza le sfide tecniche coinvolte nella identificazione di mutazioni de novo, che richiede il sequenziamento di grandi quantità di DNA, che ha solo molto recentemente diventato conveniente con l'avvento di sequenziamento di nuova generazione. Inoltre, il tasso di mutazione de novo negli esseri umani è stato, fino a poco tempo fa, solo una stima. Solo molto recentemente ci sono stati rapporti direttamente determinare il tasso di mutazione negli esseri umani. Prima di queste misure, era difficile prevedere la dimensione del campione necessaria per questo tipo di studio e di determinare se la mutazione osservata de novo tasso è superiore al tasso di base. Sequenziamento geni candidati contro il genoma? Poiché la maggior parte delle mutazioni malattia riportati sono missenso / mutazioni nonsenso e sono mutazioni sito di splice (secondo il sito web HGMD) la nostra strategia di screening dovrebbe identificare oltre il 68% delle mutazioni note. Vi è anche una chiara relazione tra la gravità della sostituzione di aminoacidi e la probabilità di un fenotipo clinico. Rispetto ad una sostituzione conservativa aminoacido, un cambiamento senza senso è 9,0 volte più probabilità di presentare clinicamente 7. Così, in questo momento geni candidati sequenziamento è la strategia più conveniente.

Il successo della procedura descritta dipende da diversi passaggi critici, che sono descritte in dettaglio e illustrata con due esempi, l'autismo e la schizofrenia. Ci sono molti trabocchetti che devono essere evitati, come ad esempio che la malattia di scegliere, che i pazienti a schermo, fonte di DNA, e dettagli su come identificare in modo efficace le mutazioni de novo. Forniamo un metodo più efficiente per la determinazione della frazione di casi di una malattia che deriva da tali mutazioni spontanee.