Une stratégie pour identifier des mutations de novo dans les troubles courants comme l'autisme et la schizophrénie

Summary

Stratégie génétique moléculaire pour trouver des mutations de novo provoquant des troubles courants tels que l'autisme et la schizophrénie.

Abstract

Il ya plusieurs lignes de preuves appuyant le rôle des mutations de novo comme un mécanisme de troubles courants, tels que l'autisme et la schizophrénie. Premièrement, le taux de mutation de novo chez l'homme est relativement élevée, donc de nouvelles mutations sont générés à une fréquence élevée dans la population. Cependant, des mutations de novo n'ont pas été signalés dans la plupart des maladies courantes. Des mutations dans les gènes conduisant à des maladies graves où il ya une forte sélection négative contre le phénotype, tels que la létalité dans les stades embryonnaires ou réduit la capacité de reproduction, ne seront pas transmis aux membres de famille multiples, et donc ne sera pas détecté par la cartographie génétique de liaison ou d'une association des études. L'observation de concordance très élevé chez les jumeaux monozygotes et de la concordance très faible chez les jumeaux dizygotes soutient aussi fortement l'hypothèse selon laquelle une fraction importante de cas peuvent résulter de nouvelles mutations. Tel est le cas pour les maladies comme l'autisme et la schizophrénie. Deuxièmement, malgré réduite reproduction de fitness ¹ et extrêmement variable des facteurs environnementaux, l'incidence de certaines maladies dans le monde entier est maintenu à un taux relativement élevé et constant. C'est le cas de l'autisme et la schizophrénie, avec une incidence d'environ 1% dans le monde entier. La charge mutationnelle peut être considéré comme un équilibre entre la sélection pour ou contre une mutation délétère et sa production de novo de mutation. La baisse des taux de reproduction constitue un facteur de sélection négative qui devrait réduire le nombre d'allèles mutants dans la population, conduisant finalement à la prévalence des maladies ont diminué. Ces pressions sélectives ont tendance à être d'intensité différente dans différents environnements. Néanmoins, ces troubles mentaux graves ont été maintenus à un taux de prévalence relativement élevée constante dans la population mondiale dans un large éventail de cultures et de pays en dépit d'une forte sélection négative contre eux ^2. Ce n'est pas ce que l'on prédire les maladies avec la capacité de reproduction réduite, sauf si il y avait un taux de mutation élevé de nouvelles. Enfin, les effets de l'âge paternel: il ya une augmentation significative du risque de la maladie avec l'âge paternel augmente, ce qui pourrait résulter de l'augmentation liée à l'âge de paternelle mutations de novo. C'est le cas de l'autisme et la schizophrénie ^3. Le ratio hommes-femmes des taux de mutation est estimé à environ 4-6:1, vraisemblablement en raison d'un nombre plus élevé de cellules germinales divisions avec l'âge chez les hommes. Par conséquent, on pourrait prédire que les mutations de novo serait plus fréquemment proviennent de mâles, en particulier les hommes plus âgés ^4. Un taux élevé de nouvelles mutations peuvent en partie expliquer pourquoi les études génétiques ont jusqu'ici échoué à identifier de nombreux gènes de prédisposition à des maladies complexes des gènes, tels que l'autisme et la schizophrénie, et pourquoi les maladies ont été identifiés pour seulement 3% des gènes dans le génome humain . Identification des mutations de novo en tant que cause d'une maladie nécessite une approche moléculaire ciblée, qui comprend les parents étudient et les sujets concernés. Le processus permettant de déterminer si la base génétique d'une maladie peut résulter en partie de mutations de novo et de l'approche moléculaire pour établir ce lien sera illustrée, en utilisant autisme et la schizophrénie comme exemples.

Protocol

1. Sélection de la maladie qui peut être causée par des mutations de novo

Une maladie qui correspond aux critères suivants peuvent tenir à l'hypothèse de mutations de novo:

1. L'aptitude à la reproduction est réduite.
2. La fréquence de la maladie est relativement élevée et constante malgré des environnements très variés.
3. La maladie est associée à un âge plus élevé paternelle.
4. Le lien classique et les études d'association a omis d'expliquer une fraction significative de l'héritabilité de la maladie.
5. Les données de concordance jumelles soutenir un modèle de novo.

Analyse de la probabilité qu'une maladie commune où des mutations de novo peut expliquer en partie la base génétique est une première étape essentielle.

2. Sélection des cas et des échantillons d'ADN

Sélection des échantillons appropriés est essentiel pour la réussite de l'identification de mutations de novo. Pour maximiser les chances de trouver des mutations de novo, nous recommandons ce qui suit:

1. Sélectionnez cas avec l'âge précoce de survenue, le phénotype sévère, avec des parents non, pères plus âgés et sans antécédents de la famille élargie de la maladie.
2. Choisissez les patients dont les ADN disponibles sont suffisantes pour mener l'étude. Surtout crucial est la disponibilité de l'ADN provenant d'une source de cellules primaires qui n'a pas été soumis à la culture (ADN par exemple du sang ou d'ADN de salive),
3. La disponibilité des deux parents, l'ADN est essentielle afin de déterminer l'état de la transmission de mutation (héritée vs de novo). Disponibilité des cohortes supplémentaires affectés et des témoins normaux est nécessaire pour les études de validation génétique fois les gènes candidats sont identifiés.
4. Estimer la taille de l'échantillon sur la base des taux de mutations, la quantité de gènes à être projeté et l'estimation de la fraction des cas qui peuvent résulter d'une mutation de novo.

3. Gene reséquençage; deux grandes approches

1. Séquençage à haute qualité à faible
   Cette approche est basée sur des gènes candidats les approches.
   1. Sélection du gène candidat (s)
      Sélectionnez les meilleurs gènes candidat basé sur un système de notation qui est construit sur six critères principaux. Calculez ensuite le total qui correspondait à la somme de tous les points attribués à l'aide des six critères énumérés dans le tableau 1. Voir un exemple de notre projet dans la figure 1 de la distribution des gènes sélectionnés et non sélectionnés.
      
      Tableau 1 Critères. Utilisé pour la sélection de gènes candidats
      
      
      Figure 1. Graphique montrant la répartition des gènes sélectionnés et non sélectionnés pour le séquençage de notre projet. Nous avons obtenu une distribution des gènes classés par propriétés candidat par les gènes de tri en fonction de leur valeur de score. Par exemple, SHANK3 et NRXN1 gènes, deux gènes que nous avons trouvé une mutation de novo, avaient un score de 7 et 6 respectivement (maximum 12).
   2. Amorces de conception en utilisant le logiciel Primers3 travers Exonprimer. Seule la région codante et jonction d'épissage devraient être couverts, y compris un supplément de 50 paires de base de chaque côté de l'exon.
   3. Optimiser les conditions de PCR pour le choix de Taq, le volume de réaction, etc
   4. Optimiser tous les fragments de PCR
   5. Amplifier 5 ng d'ADN génomique extrait à partir d'échantillons de sang selon des procédures standard
   6. Avant d'envoyer pour le séquençage, ne contrôle qualité de vos produits de PCR en chargeant un de 2% gel d'agarose. Échantillons choisis au hasard.
   7. Séquence des produits de PCR sur un analyseur d'ADN sur un brin. Un fragment est considéré comme réussi le séquençage si l'analyse de plus de 90% de la trace est possible. Ceci est applicable pour un criblage à grande échelle.
   8. Détection Variantes
      1. Utiliser des outils pour la détection et le génotypage des variations génomiques telles que PolyPhred, Polyscan et Mutation Surveyor. Une combinaison de plus de 2 outils de détection est idéal. Par exemple, PolyPhred v.5 et PolyPhred v.6 avec les paramètres par défaut ne détectent pas les mêmes variations. V.3 Polyscan a un taux de mutation plus élevé de faux positifs pour le SNP (96%) et moins pour les indels (93%). PolyPhred v.6 n'a pas détecté la majorité des indels vrai, mais ont un taux de mutation faux positifs (pour indels) inférieur Polyscan globale v.3 (90%). Nous devons supprimer l'option de détection de SNPs pour v.3 Polyscan et garder les deux PolyPhred v.5 et PolyPhred v.6 pour la détection des variants. Mutation Surveyor et Polyscan sont meilleurs pour détecter les indels. Remarque: L'option de détection de SNP ne doit pas être appliquée lors de l'utilisation Polyscan. Seul le "Indel" option doit être activée. Polyscan généré de nombreux faux positifs pour la détection de SNP.
      2. Pour chaque roman de variantes uniques exonique détecté, il confirme manuellement en reamplifying le fragment et resequencing la proposante et les deux parents en utilisant des amorces marche avant et arrière pour éliminer tout artefact technique.
2. Whole exome séquençage
   Cette approche est un séquençage à haut débit ciblant la majorité des régions codantes du génome humain. Nous sommes maintenant utilisent actuellement cette nouvelle approche dans notre laboratoire, ce qui accélère la détection des gènes candidats potentiels.
   1. Commandez "SureSelect homme Tous Exon» ciblant la région codante de plus de 16 000 gènes (50 Mo du génome), conçu par Agilent ou tout autre produit similaire par les autres comme Roche. Avant de commander le kit de capture, les plates-formes de séquençage devrait être de déterminer (Illumina vs solide).
   2. Ne la capture selon le protocole d'Agilent
   3. Séquence du produit sur votre respectives disponibles la prochaine génération de plate-forme de
   4. Variante de détection à partir du séquençage toute exome: Plusieurs outils bioinformatiques pour la détection et le génotypage des variations génomiques de la plate-forme de séquençage nouvelle génération sont disponibles telles que BWA, Bfast, le Bioscope qui effectuera l'alignement. Après quoi supplémentaires librement disponibles des outils aval (par exemple SAM outils, Varscan, Annovar) serait nécessaire, il appeler et d'annoter les variantes. Les logiciels commerciaux qui intègre l'alignement de séquences et d'appeler la variante et l'annotation sont également disponibles tels que, NextGen (Softgenetics), CLC bio, et d'autres

4. Genomic hiérarchisation variantes

Variantes identifiées sont alors prioritaires pour le suivi en fonction de leur probabilité d'être de novo et délétère pour la fonction des protéines ou de l'ARNm et / ou de la structure. La variante de suivi des priorités pour la détection de novo variante doivent être comme suit:

1. Variations uniques (observée une fois dans un seul cas)
2. Variations pas présente chez les parents
3. Protéine-tronquant variations: un non-sens, indels menant à frameshift et des mutations d'épissage.
4. Variation de faux-sens et silencieux prévu pour être fonctionnellement perturbateurs (par exemple, affectent épissage de l'ARNm). Utilisez Polyphen, EIPD et PANTHER pour un effet de prédiction fonctionnelle de la protéine.

Si vous utilisez séquençage exome ensemble, la sélection de gènes candidats peut être utilisé comme une stratégie pour prioriser variantes pour étude complémentaire.

5. Validation génétique

1. Reséquencer l'ensemble du gène dans le cas de patients supplémentaires (pour identifier d'autres mutations causales) et dans les contrôles. Les échantillons de contrôle seront utilisés pour évaluer les fréquences alléliques des variantes priorité. Tout gène contenant au moins deux différentes mutations de novo délétères (non-sens, l'épissage, des déphasages, et prédit faux-sens dommageables) a constaté chez des patients différents (mais pas dans les échantillons de contrôle ou de bases de données publiques) doivent être hautement prioritaires pour les études de validation. Cela comprend: 1) Les essais pour un défaut d'épissage potentiels dans des lignées cellulaires lymphoblastoïdes dérivées du patient. Dans notre expérience, la plupart des gènes de rendement produits RT-PCR à partir des lignées cellulaires lymphoblastoïdes, 2) étudier l'expression des protéines modifiées niveaux par analyse quantitative blot Western d'extraits protéiques des lignées de cellules lymphoblastoïdes et 3) autre test de la mutation / gène au niveau fonctionnel animale (c elegans, poisson zèbre) et des modèles lignée cellulaire comme précédemment par notre groupe (ex: 5,6).

6. Les résultats représentatifs:

Suite à ce protocole, nous avons été en mesure d'identifier de nouveaux gènes de la schizophrénie et l'autisme. Un exemple est notre récente découverte du gène SHANK3 (figure 2). Deux différentes mutations de novo dans SHANK3 gène, une mutation non-sens dans trois frère touchée et une mutation faux-sens dans une femme touchée.

Figure 2. (A) la séparation de la mutation non-sens R1117X de trois frères de la famille affectée PED 419. Le propositus est indiquée par la flèche. (B) la ségrégation de la mutation faux-sens R536W dans le propositus, mais pas sa non-affectés frère dans PED 56.

Discussion

La procédure décrite ici vise à identifier des maladies courantes qui résultent probablement, en partie, de mutations de novo, et de prouver cette hypothèse. Des mutations de novo est un mécanisme bien établi pour le développement d'un certain nombre de maladies, par exemple les syndromes de cancer héréditaire, mais a été peu exploré dans les maladies communes. Ce en partie le résultat des défis techniques impliqués dans l'identification de mutations de novo, ce qui nécessite le séquençage de grandes quantités d'ADN, qui n'a que très récemment devenue rentable avec l'avènement du séquençage de nouvelle génération. En outre, le taux de mutation de novo chez l'homme était, jusqu'à très récemment, seule une estimation. Ce n'est que très récemment, at-il eu des rapports directement à la détermination du taux de mutation chez les humains. Avant ces mesures, il était difficile de prédire la taille de l'échantillon nécessaire pour ce genre d'étude et de déterminer si le taux observé de mutation de novo est supérieure au taux de référence. Séquençage des gènes candidats par rapport génome entier? Puisque la majorité des mutations faux-sens sont des maladies signalées / absurdités mutations sont des mutations et des sites d'épissage (selon le site web HGMD) de notre stratégie de dépistage permettrait d'identifier plus de 68% des mutations connues. Il ya aussi une relation claire entre la sévérité de remplacement d'acides aminés et la probabilité d'un phénotype clinique. Par rapport à une substitution d'acide aminé conservatrices, un changement non-sens est 9,0 fois plus susceptibles de présenter cliniquement 7. Ainsi, à ce moment séquençage des gènes candidats est la stratégie la plus rentable.

Le succès de la procédure décrite dépend de plusieurs étapes cruciales, qui sont décrites en détail et illustrés par deux exemples, l'autisme et la schizophrénie. Il ya de nombreux pièges qui doivent être évités, tels que la maladie dont pour choisir, quels patients à l'écran, la source de l'ADN, et les détails de comment identifier efficacement les mutations de novo. Nous fournissons une méthode pour déterminer le plus efficacement possible la fraction des cas de toute maladie qui résulte de ces mutations spontanées.