Summary
寻找从头突变导致自闭症和精神分裂症等常见疾病的分子遗传学战略。
Abstract
有证据支持机制，为常见的疾病，如自闭症和精神分裂症，从头突变作用的几行。首先， 重新在人类的突变率是比较高的的，所以在人口中的高频率产生新的基因突变。然而， 从头突变没有被报道的最常见的疾病。导致严重的疾病，在胚胎阶段或减少生殖健身有一个强烈反对负选择表型，如杀伤力的基因突变，不会被发送到多个家庭成员，并因此不会被检测联动基因图谱或协会研究。同卵双胞胎中的一致性非常高的观察和非常低的异卵双胞胎的一致性也强烈支持这一假设，相当一部分的情况下，可能会导致从新的基因突变。疾病，如自闭症和精神分裂症的情况下是这样。其次，尽管降低生殖健身1和一个变数极大的环境因素，对一些疾病的发病率是全世界保持在一个相对较高的恒定速率。这是孤独症和精神分裂症的情况下，与全世界的发病率约为1％。突变负荷可以被认为是一个新生突变的有害突变和其生产或反对之间选择平衡。繁殖率较低，构成了一个消极的选择，应减少在人群中的突变的等位基因的数量，最终导致疾病的患病率下降的因素。这些选择性的压力往往是在不同的环境不同强度。然而，这些严重的精神疾患，一直保持在一个恒定在跨文化和国家的广泛的全球人口的患病率相对较高，尽管一个强烈反对他们2负选择。这是不是什么人会预测在降低生殖健身疾病，除非有新的突变率。最后，父亲年龄的影响：有是一个疾病的风险显着增加，随着父亲年龄的增加，这可能导致从年龄增加从头在父亲的基因突变有关。这是自闭症和精神分裂症3。突变率的男性与女性的比例估计约为4-6:1，大概是由于岁男性的生殖细胞分裂。因此，人会预测， 从头突变会更频繁的男性，尤其是老年男性4。一个新的基因突变率很高，可能部分解释遗传研究为什么迄今未能确定诱发复合物疾病的基因，如自闭症和精神分裂症有关的许多基因，以及为什么疾病已经确定人类基因组中只有3％的基因。鉴定从头突变引起的一种疾病，需要有针对性的分子的方法，其中包括学习的父母和受影响的学科。确定某种疾病的遗传基础，可能会导致部分从头突变和分子的方法来建立这个链接将作为例子说明，使用自闭症和精神分裂症的过程。
Protocol
1。可能从头突变引起的疾病选择
符合下列条件的一种疾病，可配合新生突变假说：
- 生殖健身是减少。
- 尽管各种不同的环境，疾病的频率是比较高的和不断的。
- 具有较高的父亲年龄相关的疾病。
- 经典的连锁和关联研究无法解释的疾病遗传的重要部分。
- 双胞胎的一致性数据支持一种新模式。
分析的可能性，一种常见的疾病，诺突变可能部分解释的遗传基础，是关键的第一步。
2。选择的情况下，DNA样本
选择适当的样本是新突变的鉴定成功的关键。为了最大限度地寻找新突变的机会，我们提出以下建议：
- 从小发病，严重的表型选择的情况下，未受影响的父母，和老父亲没有关于该疾病的大家庭历史。
- 选择患者的足够可用的DNA进行研究。尤其重要的是从一个没有受到培养的原代细胞源（如血液DNA或唾液中的DNA）的DNA可用性，
- 父母双方的DNA的可用性是关键，以确定突变传输状态继承与从头。额外的影响同伙的可用性和正常对照组进行基因验证研究是必要的，一旦发现候选基因。
- 估计样本大小的基础上的突变率，量的基因进行筛选， 并从新生突变的情况下，可能会导致分数的估计的。
3。基因测序;两个主要途径
- 高品质低通量测序
这种方法是基于对候选基因的方法。- 候选基因的选择（S）
选择的最佳人选，根据计分制，这是对6个主要的标准建造的基因。然后计算出对应的总的归结点使用表1中列出的六个标准的总和。看到从我们的项目选择和未选择的基因分布在图1的例子。
用于候选基因的选择标准见表1 。
图1显示在我们的项目排序的选择，而不是选定的基因分布图。我们获得了候选人属性，根据自己的分数值排名基因排序的基因分布。例如，SHANK3 NRXN1基因，两个基因，我们发现新生突变，产生了7 分和6（最大为12）。 - 设计引物，通过Exonprimer使用Primers3软件。只有编码区和剪接交界处应涵盖包括一个额外的50外显子两侧的碱基对。
- 优化PCR条件的Taq的选择，反应体积等。
- 优化PCR片段
- 根据标准程序，从血液样本中提取的基因组DNA扩增5纳克
- 在测序发送之前，做您的PCR产物的质量控制，加载2％琼脂糖凝胶。选定的随机样本。
- 在一个链上的DNA分析仪的序列的PCR产物。如果超过90％的痕迹分析是可能的一个片段被认为是成功测序。这是适用于大规模筛查。
- 变异检测
- 如PolyPhred，Polyscan和突变测量师的基因组变异的基因分型检测和使用工具。 2个以上的检测工具的组合是理想的。例如，PolyPhred V.5和PolyPhred V.6使用默认设置不检测的相同变化。 Polyscan V.3有INDELS（93％）的SNPs（96％）和较高的假阳性突变率。 PolyPhred V.6没有发现真正INDELS的多数，但有假阳性突变率（INDELS）低于Polyscan V.3整体（90％）。我们应该删除Polyscan V.3的单核苷酸多态性检测的选项，都保持PolyPhred V.5和PolyPhred V.6变异检测。突变测量师和Polyscan是为更好地检测INDELS。注：在使用Polyscan时，不应适用于SNP的检测选项。只有“INDEL”选项应。 Polyscan产生许多虚假的SNP的检测阳性。
- 对于每一个独特的小说外显子变异检测，确认手动reamplifying片段和resequencing先证者和父母双方使用反向和正向引物，以消除任何技术神器。
- 候选基因的选择（S）
- 全外显子组测序
这种方法是针对大部分地区的人类基因组编码的高通量测序。我们现在在我们的实验室目前正在使用这种新方法，加速潜在候选基因的检测。- 订购“SureSelect人类所有外显子”，针对超过1.6万个基因的编码区（50 MB基因组），罗氏等其他由安捷伦或任何其他同类产品的设计。为了捕捉套件之前，测序平台应确定（Illumina公司对固体）。
- 根据安捷伦的协议，不要捕捉
- 提供各自的下一代平台上的产品序列
- 从整个外显子组测序的Variant检测：新一代测序平台的基因变异的检测和基因分型的几个生物信息学工具，如宽带无线接入，Bfast，放映机将执行对齐。之后，额外的免费提供的工具（例如SAM工具，Varscan，Annovar）下游将需要它来调用和注释的变种。采用序列比对和变体的调用和注释的商业软件，也可用，如下一代（Softgenetics），中图分类号生物和其他
4。优先级基因变种
优先跟进根据他们在诺和有害的蛋白或mRNA的功能和/或结构的概率确定的变种。跟进的变种新变种的检测重点应如下：
- （在一个单一的情况下观察到一次）独特的变化
- 变化不存在的父母
- 截断蛋白的变化：废话，INDELS导致移码和剪接突变。
- 错义和沉默变化的预测功能破坏性的（例如，影响mRNA剪接）。 Polyphen，上海对外贸易学院和Panther对蛋白质功能的预测效果。
如果使用全外显子组测序，选择候选基因可以被用来作为进一步研究的优先次序变种战略。
5。遗传验证
- 重新排序在其他病例（找出其他致病突变）和控制的整个基因。对照样品将被用来评估优先次序的变异的等位基因频率。包含至少两个不同的从头有害突变（废话，拼接，frameshifts，并预言损害错义）在不同的病人（但不是在控制样品或公共数据库）中发现的任何基因，应高度优先为进一步验证研究。这包括：1，从病人的淋巴母细胞系中的一个潜在的剪接缺陷）测试。根据我们的经验，大多数基因产生淋巴细胞系的RT - PCR产物; 2）调查改变蛋白的表达水平，蛋白提取物的定量免疫印迹分析淋巴细胞系和3）进一步的测试/功能水平的突变基因动物（C线虫，斑马鱼）和细胞株作为先前由本集团（如：5,6）模型。
6。代表性的成果：
根据这一协议，我们能够识别新的精神分裂症和自闭症的基因。一个例子是我们最近SHANK3基因的发现（图2）。两种不同的从头SHANK3基因突变，无义突变在三个受灾的兄弟和一个错义突变，在一个受影响的女性。
图2。 （一）分隔R1117X家庭PED的419中的影响在三个兄弟的无义突变。先证者的箭头表示（二）R536W错义突变的先证者的分离，但不是在PED的56她不影响弟弟。
Discussion
这里列出的程序的目的是确定具体的常见疾病，可能导致部分，从诺突变，并证明这一假说。从头突变的一些疾病，例如遗传性癌症综合征发展为建立良好的机制，但一直不佳，常见疾病的探讨。这从头突变，这就需要大量的DNA，它只有测序鉴定所涉及的技术挑战的一部分结果最近成为新一代测序的到来有效的成本。此外， 重新在人类的突变率，直到最近，只是一个估计。只是最近，有报道直接确定在人类的突变率。这些测量前，这是很难预测这类研究所需的样本大小，以确定所观察到的新生突变率大于基准率。全基因组测序与候选基因？由于大多数疾病突变错义/无义突变和剪接位点突变（根据HGMD网站）我们的筛选策略将确定已知的突变超过68％。也有一个氨基酸替换的严重性和可能性的临床表型之间的明确关系。一个保守的氨基酸替换相比，废话变化是9.0倍，可能目前临床上7。因此，在这个时候候选基因测序是最具成本效益的策略。
概述过程的成功取决于几个关键步骤，这是中详细概述，并举例说明了使用了两个例子，自闭症和精神分裂症。有很多陷阱需要避免，如选择何种疾病，患者到屏幕上，源DNA，和如何有效地识别诺突变的详细信息，。我们提供最有效的方法，确定任何疾病，这种自发突变的结果的情况下的一小部分。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢我们的资金来源加拿大基因组和基因组魁北克和蒙特利尔大学以及资金从加拿大创新基金会资助我们的“突触病”（S2D）项目。
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