Summary
डी Novo की म्यूटेशनों के कारण आम autism और एक प्रकार का पागलपन के रूप में इस तरह के विकारों को खोजने के लिए आण्विक आनुवंशिक रणनीति.
Protocol
1. रोग का चयन है कि डी Novo की म्यूटेशनों के कारण हो सकता है
एक रोग है जो निम्न मापदंड से मेल खाती है डी Novo उत्परिवर्तन परिकल्पना के साथ फिट कर सकते हैं:
- प्रजनन फिटनेस कम है.
- रोग की आवृत्ति व्यापक रूप से अलग वातावरण के बावजूद अपेक्षाकृत उच्च और स्थिर है.
- रोग के एक उच्च पैतृक उम्र के साथ जुड़ा हुआ है.
- क्लासिक उठाना और संघ अध्ययन रोग आनुवांशिकता का एक महत्वपूर्ण अंश को समझाने में विफल रहा है.
- जुड़वां क़बूल डेटा एक डी Novo की मॉडल का समर्थन करते हैं.
संभावना है कि एक आम रोग है जहां डी Novo की म्यूटेशनों के हिस्से में आनुवंशिक आधार को समझा जा सकता है एक महत्वपूर्ण पहला कदम है का विश्लेषण.
2. मामलों और डीएनए के नमूने का चयन
उपयुक्त नमूने के चयन डी Novo की म्यूटेशनों की पहचान की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है . डी Novo की म्यूटेशनों खोजने का मौका अधिकतम करने के लिए, हम निम्नलिखित सुझाव है:
- शुरुआत, गंभीर phenotype के कम उम्र के साथ मामलों अप्रभावित माता पिता, बड़े पिता के साथ और रोग का कोई विस्तारित परिवार के इतिहास के साथ, का चयन करें.
- रोगियों जिसका उपलब्ध DNAs अध्ययन का संचालन करने के लिए पर्याप्त हैं चुनें. विशेष रूप से महत्वपूर्ण एक प्राथमिक सेल स्रोत है कि संवर्धन करने के लिए अधीन नहीं किया गया था (जैसे रक्त डीएनए या लार डीएनए) से डीएनए की उपलब्धता है,
- दोनों माता पिता के डीएनए की उपलब्धता महत्वपूर्ण है क्रम में उत्परिवर्तन संचरण स्थिति (बनाम डी Novo की विरासत में मिला) निर्धारित करने के लिए है. अतिरिक्त प्रभावित साथियों और सामान्य नियंत्रण की उपलब्धता आनुवंशिक सत्यापन के अध्ययन के लिए आवश्यक है एक बार उम्मीदवार जीनों की पहचान कर रहे हैं.
- अनुमान नमूना आकार म्यूटेशनों दर, जीन की राशि के लिए जांच की जानी और मामलों है कि एक डी Novo उत्परिवर्तन से परिणाम हो सकता है के अंश के अनुमान पर आधारित है .
3. जीन resequencing, दो प्रमुख दृष्टिकोण
- उच्च गुणवत्ता कम throughput अनुक्रमण
इस दृष्टिकोण उम्मीदवार जीनों के दृष्टिकोण पर आधारित है.- उम्मीदवार जीन (एस) का चयन
सर्वश्रेष्ठ उम्मीदवार जो 6 प्रमुख मापदंड पर बनाया गया है एक स्कोरिंग प्रणाली पर आधारित जीन का चयन करें. तो कुल कि सभी छह तालिका 1 में सूचीबद्ध मापदंड का उपयोग करते हुए जिम्मेदार ठहराया अंक का योग करने के लिए corresponded गणना. और चयनित चयनित नहीं जीन वितरण की संख्या 1 में हमारी परियोजना से उदाहरण देखें.
तालिका 1. उम्मीदवार जीन चयन के लिए इस्तेमाल किया मानदंड
1 चित्रा ग्राफ़ हमारी परियोजना में अनुक्रमण के लिए और चयनित चयनित नहीं जीनों के वितरण दिखा. हम उम्मीदवार गुणों के द्वारा छँटाई जीन द्वारा अपने स्कोर मूल्य के अनुसार क्रमबद्ध जीनों के एक वितरण प्राप्त की. उदाहरण के लिए, SHANK3 और NRXN1 जीन, दो जीन है कि हम नोवो डे उत्परिवर्तन पाया, एक 7 अंक और 6 क्रमशः था (अधिकतम 12). - डिजाइन Exonprimer के माध्यम से Primers3 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राइमरों. केवल क्षेत्र कोडन और ब्याह जंक्शन एक्सॉन के प्रत्येक पक्ष पर एक अतिरिक्त 50 आधार जोड़े सहित शामिल किया जाना चाहिए.
- ऑप्टिमाइज़ पीसीआर स्थितियों Taq के चुनाव के लिए, प्रतिक्रिया की मात्रा, आदि
- सभी पीसीआर टुकड़े ऑप्टिमाइज़
- जीनोमिक डीएनए के मानक प्रक्रियाओं के अनुसार रक्त के नमूनों से निकाले 5 एनजी बढ़ाना
- अनुक्रमण के लिए भेजने से पहले, एक 2% agarose जेल लोड करके अपने पीसीआर उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण करते हैं. नमूने बेतरतीब ढंग से चुना गया.
- एक कतरा पर एक डीएनए विश्लेषक पर पीसीआर उत्पादों अनुक्रम. एक टुकड़ा माना जाता है सफलतापूर्वक अनुक्रम है अगर निशान के 90% से अधिक का विश्लेषण संभव है. यह एक बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए लागू होता है.
- वेरिएंट जांच
- PolyPhred, Polyscan और उत्परिवर्तन सर्वेयर के रूप में जीनोमिक बदलाव का पता लगाने जीनोटाइपिंग के लिए उपकरण का प्रयोग करें. 2 से भी अधिक का पता लगाने के उपकरण का एक संयोजन आदर्श है. उदाहरण के लिए, v.5 PolyPhred और v.6 PolyPhred साथ डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स एक ही विविधताओं का पता नहीं लगा. V.3 Polyscan INDELs (93%) के लिए SNPs (96%) और कम के लिए एक उच्च झूठी सकारात्मक उत्परिवर्तन की दर है. PolyPhred v.6 सच INDELs के बहुमत पता नहीं था, लेकिन एक झूठी सकारात्मक उत्परिवर्तन की दर (INDELs के लिए) Polyscan v.3 समग्र (90%) की तुलना में कम है. हम v.3 Polyscan के लिए SNPs का पता लगाने के विकल्प को हटा दें और दोनों v.5 PolyPhred रखने चाहिए और संस्करण का पता लगाने के लिए v.6 PolyPhred. उत्परिवर्तन सर्वेयर और Polyscan indels का पता लगाने के लिए बेहतर हैं. नोट: SNP का पता लगाने के विकल्प जब Polyscan का उपयोग नहीं लागू किया जाना चाहिए. केवल "indel" विकल्प पर होना चाहिए. Polyscan SNP पता लगाने के लिए कई झूठी सकारात्मक उत्पन्न.
- के लिए प्रत्येक अद्वितीय उपन्यास exonic वेरिएंट का पता चला, इसे मैन्युअल रूप से पुष्टि टुकड़ा और resequ reamplifyingproband और दोनों के माता पिता रिवर्स और आगे प्राइमरों का उपयोग करने के लिए किसी भी तकनीकी विरूपण साक्ष्य को खत्म करने encing.
- उम्मीदवार जीन (एस) का चयन
- पूरे exome अनुक्रमण
इस दृष्टिकोण एक उच्च throughput अनुक्रमण मानव जीनोम की कोडिंग क्षेत्रों के बहुमत को लक्षित है. अब हम वर्तमान में कर रहे हैं हमारी प्रयोगशाला में इस नए दृष्टिकोण का उपयोग कर, संभावित उम्मीदवार जीनों का पता लगाने में तेजी.- "SureSelect मानव सभी एक्सॉन" १६००० अधिक जीन की कोडिंग क्षेत्र (जीनोम के 50 MB) द्वारा डिजाइन रॉश की तरह दूसरों के द्वारा Agilent है या किसी भी अन्य समान उत्पाद लक्ष्यीकरण आदेश. कब्जा किट के आदेश से पहले, अनुक्रमण प्लेटफार्मों (Illumina बनाम ठोस) निर्धारित किया जाना चाहिए.
- Agilent प्रोटोकॉल के अनुसार कब्जा करो
- अपने संबंधित उपलब्ध अगली पीढ़ी के मंच पर उत्पाद अनुक्रम
- पूरे exome अनुक्रमण से Variant पता लगाने: जैसे BWA, Bfast, BioScope जो संरेखण प्रदर्शन करेंगे और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण मंच से जीनोमिक बदलाव का पता लगाने जीनोटाइपिंग के लिए कई जैव सूचना विज्ञान उपकरण उपलब्ध हैं. जिसके बाद अतिरिक्त आज़ादी से उपलब्ध बहाव उपकरण (उदाहरण के लिए सैम उपकरण, Varscan, Annovar) यह फोन और वेरिएंट एनोटेट की जरूरत होगी. वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर है कि अनुक्रम संरेखण और संस्करण बुला और एनोटेशन को शामिल भी कर रहे हैं जैसे, (Softgenetics) NextGen, सीएलसी जैव, और दूसरों को उपलब्ध हैं
4. जीनोमिक वेरिएंट प्राथमिकता
पहचाने गए वेरिएंट तो अनुवर्ती डी Novo और प्रोटीन या mRNA समारोह और / या संरचना के लिए हानिकारक जा रहा है में अपने संभावना के अनुसार के लिए प्राथमिकता के आधार पर कर रहे हैं. संस्करण डी Novo संस्करण का पता लगाने के के लिए प्राथमिकताओं का पालन के रूप में अनुसरण किया जाना चाहिए:
- अद्वितीय विविधताओं (एक भी मामले में एक बार मनाया)
- माता पिता में विविधताएं मौजूद नहीं
- प्रोटीन छोटा भिन्नरूपों: बकवास, frameshift और splicing म्यूटेशनों के लिए अग्रणी indels.
- Missense और चुप भिन्नता कार्यात्मक विघटनकारी हो सकता है (उदाहरण के लिए, mRNA splicing को प्रभावित) की भविष्यवाणी की. प्रोटीन पर कार्यात्मक भविष्यवाणी प्रभाव के लिए Polyphen झारना, और पैंथर का प्रयोग करें.
पूरे exome अनुक्रमण का उपयोग कर यदि उम्मीदवार जीनों के चयन को प्राथमिकता देने वेरिएंट के लिए आगे के अध्ययन के लिए एक रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. जेनेटिक सत्यापन
- अतिरिक्त रोगी मामलों (अन्य प्रेरणा का म्यूटेशन की पहचान) और नियंत्रण में पूरे जीन Resequence. नियंत्रण के नमूने के लिए प्राथमिकता के आधार पर वेरिएंट के allelic आवृत्तियों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. कोई कम से कम दो विभिन्न डी Novo हानिकारक (बकवास, splicing, frameshifts, और हानिकारक missense भविष्यवाणी) अलग रोगियों (लेकिन नियंत्रण नमूने या सार्वजनिक डेटाबेस में नहीं) में पाया म्यूटेशन युक्त जीन अत्यधिक आगे सत्यापन के अध्ययन के लिए प्राथमिकता के आधार पर होना चाहिए. 1 lymphoblastoid सेल रोगी से प्राप्त लाइनों में एक संभावित splicing दोष के लिए) परीक्षण: यह भी शामिल है. हमारे अनुभव में, ज्यादातर जीन lymphoblastoid सेल लाइनों से RT-पीसीआर उत्पादों उपज; 2) मात्रात्मक lymphoblastoid सेल लाइनों और 3 से प्रोटीन के अर्क के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा बदल प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर की जांच) आगे परीक्षण / में कार्यात्मक स्तर पर उत्परिवर्तन जीन (ग एलिगेंस, Zebrafish) जानवर और सेल लाइन मॉडल के रूप में पहले हमारे समूह (पूर्व: 5,6) के द्वारा किया.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
इस प्रोटोकॉल के बाद, हम एक प्रकार का पागलपन और autism के लिए नई जीन की पहचान करने में सक्षम थे. एक उदाहरण हमारे SHANK3 हाल ही में जीन की खोज (चित्रा 2) है. दो SHANK3 जीन में विभिन्न डी Novo की म्यूटेशनों, एक बकवास प्रभावित तीन और एक प्रभावित महिला में एक missense उत्परिवर्तन भाई में पाया उत्परिवर्तन.
चित्रा 2. (ए) R1117X बकवास उत्परिवर्तन के परिवार PED 419 के तीन प्रभावित भाइयों में अलगाव. proband तीर द्वारा संकेत है proband में R536W missense उत्परिवर्तन के अलगाव (बी), लेकिन 56 PED में उसके भाई गैर प्रभावित नहीं.
Discussion
यहाँ उल्लिखित की प्रक्रिया विशिष्ट आम बीमारियों की संभावना है कि परिणाम, भाग में, डी Novo की म्यूटेशनों से, और इस परिकल्पना को साबित करने के लिए की पहचान करना है. डी Novo की म्यूटेशनों वंशानुगत कैंसर सिंड्रोम उदाहरण के लिए रोग, के एक नंबर के विकास के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तंत्र हैं, लेकिन खराब आम बीमारियों में पता लगाया गया है. यह तकनीकी डी Novo की म्यूटेशनों, जो डीएनए है, जो केवल की बड़ी मात्रा के अनुक्रमण की आवश्यकता की पहचान में शामिल चुनौतियों से भाग परिणामों में बहुत हाल ही में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन के साथ लागत प्रभावी बनने. इसके अलावा, मानव में डी Novo उत्परिवर्तन की दर तक गया था, बहुत हाल ही में, केवल एक अनुमान है . केवल बहुत हाल ही में वहाँ की रिपोर्ट किया गया है सीधे मानव में उत्परिवर्तन की दर का निर्धारण. इन मापों से पहले, यह नमूना इस तरह के अध्ययन के लिए की जरूरत आकार की भविष्यवाणी और अगर मनाया डी Novo उत्परिवर्तन की दर आधारभूत दर से अधिक है निर्धारित करने के लिए मुश्किल था . पूरे जीनोम बनाम उम्मीदवार जीन अनुक्रमण? चूंकि रिपोर्ट रोग परिवर्तन के बहुमत missense / बकवास परिवर्तन कर रहे हैं और ब्याह साइट (HGMD वेब साइट के अनुसार) परिवर्तन हमारे स्क्रीनिंग की रणनीति ज्ञात परिवर्तन के 68% से अधिक की पहचान कर रहे हैं. वहाँ भी एमिनो एसिड प्रतिस्थापन की गंभीरता और एक नैदानिक phenotype की संभावना के बीच एक स्पष्ट संबंध है. के रूप में एक रूढ़िवादी एमिनो एसिड प्रतिस्थापन के साथ तुलना में, एक बकवास परिवर्तन 9.0 गुना अधिक के लिए चिकित्सकीय 7 मौजूद होने की संभावना है. इस प्रकार, इस समय अनुक्रमण उम्मीदवार जीन में सबसे अधिक लागत प्रभावी रणनीति है.
उल्लिखित प्रक्रिया की सफलता के कई महत्वपूर्ण कदम है, जो विस्तार में रेखांकित कर रहे हैं और दो उदाहरणों, आत्मकेंद्रित और एक प्रकार का पागलपन का उपयोग सचित्र पर निर्भर करता है. वहाँ कई बाधाएं है जो से परहेज किया जाना चाहिए जैसे बीमारी है जो चयन करने के लिए, जो डीएनए की स्क्रीन स्रोत है, और कैसे कुशलतापूर्वक डी Novo की म्यूटेशनों की पहचान करने के लिए विवरण के लिए रोगियों. हम सबसे अधिक कुशलता से किसी भी बीमारी है जो ऐसे सहज परिवर्तन से परिणाम के मामलों के अंश निर्धारित करने के लिए एक तरीका प्रदान करते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन से परियोजना (S2D) रोग के लिए Synapse 'हमारे धन के लिए हमारे वित्तपोषण स्रोतों जीनोम कनाडा और जीनोम क्यूबेक, और Université de मॉन्ट्रियल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से धन धन्यवाद.
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