Summary
自閉症や統合失調症などの一般的な疾患を引き起こすのde novo変異を見つけるための分子遺伝学的戦略。
Abstract
そのような自閉症や統合失調症などの一般的な疾患のメカニズム、などのde novo変異の役割を支持する証拠のいくつかの行があります。最初に、ヒトの新生突然変異率が比較的高い、新たな突然変異が集団で高い頻度で生成されるので。しかし、de novoの変異が最も一般的な疾患で報告されていない。このような胚の段階で致死性または減少生殖適応度などの表現型に対する強い否定的な選択がある重篤な疾患につながる遺伝子の突然変異は、複数の家族に送信されず、したがって、連鎖遺伝子のマッピングまたは協会によって検出されません。の研究。一卵性双生児で非常に高い一致と二卵性双生児の非常に低い一致の観察にも強く例かなりの部分は、新しい変異に起因するかもしれないという仮説をサポートしています。このように、自閉症や統合失調症などの疾患のためのケースです。第二に、削減生殖適応度1と非常にさまざまな環境要因にもかかわらず、いくつかの疾患の発生率は比較的高いと一定の速度で世界的に維持されます。これは全世界で約1％の発生率で、自閉症や統合失調症の場合です。突然変異荷重は新生突然変異による有害な突然変異とその製造または反対選択のバランスとして考えることができます。再現率の低下は、最終的に減少した疾患の有病率につながる、人口の突然変異対立遺伝子の数を減らす必要ネガティブ選択の要因となる。これらの選択圧が異なる環境で異なる強度の傾向にあります。それにもかかわらず、これらの重度の精神障害は、それら2に対して強い負の選択にもかかわらず、文化や国の幅広い世界的な人口の一定の比較的高い有病率で維持されています。これは高い新しい突然変異率があった場合を除き1つが低下生殖適応度と病気に予測するものではありません。最後に、父方の年齢の影響：父方のde novo変異の年齢関連の増加から生じる可能性が増加する父方の年齢と病気のリスクの有意な増加は、あります。これは、自閉症や統合失調症3のケースです。突然変異率の男女比は、おそらく男性では年齢とともに生殖細胞の分裂の高い数のために、約4-6:1と推定されている。したがって、一つは 、de novo変異がより頻繁に男性、特に高齢男性4から来ることを予測する。遺伝学的研究はこれまで、自閉症や統合失調症などの複合体の疾患遺伝子の素因となる多くの遺伝子を、同定に失敗した、となぜ病気がヒトゲノム中の遺伝子のわずか3％に同定されている理由は新しい突然変異の頻度が高い場合は、部分的に説明することがあります。病気の原因としてのde novo変異の同定は、勉強の両親と影響を受けた科目を含む標的分子のアプローチが必要です。疾患の遺伝的根拠はde novoの突然変異から一部と、このリンクを確立するために分子的なアプローチにつながる可能性がある場合を決定するためのプロセスは、例として、自閉症や統合失調症を用いて、例示される。
Protocol
1。 de novoの突然変異によって引き起こされるかもしれない疾患の選定
以下の基準に対応する疾患は、de novo突然変異の仮説と合うことができる。
- 生殖適応度が減少します。
- 病気の頻度は、広く多様な環境にもかかわらず、比較的高いと一定です。
- 病気は、より高い父親の年齢に関連付けられています。
- 古典的な連携と関連研究は、疾患の遺伝のかなりの部分を説明するために失敗しました。
- 双子のコンコーダンスデータは、de novoのモデルをサポートしています。
のde novo変異が一部の遺伝的根拠を説明するかもしれない共通の病気が重要な第一歩である可能性の分析。
2。ケースとDNAサンプルの選択
適切なサンプルの選択は 、de novo変異の同定の成功にとって重要です。 de novoの変異を見つけることのチャンスを最大にするために、我々は、以下を推奨します。
- 影響を受けない両親、古い父とし、病気の拡大家族の歴史を持つ、発症、重症の表現型の早い年齢でケースを選択してください。
- その利用可能なDNAの研究を行うのに十分な患者を選択してください。特に重要な培養に供されていない主な細胞源（例えば血液のDNAまたは唾液のDNA）からのDNAの可用性は、です。
- 両親のDNAの可用性は、突然変異の送信ステータスを（対デノボを継承）を決定するために重要です。候補遺伝子が同定されれば、追加の影響を受けるのコホートと正常対照の可用性は、遺伝学的検証研究が必要である。
- 突然変異率は、スクリーニングする遺伝子の量とのde novo突然変異に起因するかもしれない例割合の推定値に基づいて、サンプルのサイズを見積もります。
3。遺伝子再配列、2つの主要な方法
- 高品質、低スループットシーケンシング
このアプローチは、候補遺伝子アプローチに基づいています。- 候補遺伝子の選択（複数可）
6つの主要な基準に基づいて構築されたスコアリングシステムに基づいて最適な候補遺伝子を選択してください。次に、表1に示す6つの基準を使用して起因するすべてのポイントの合計に相当する合計を計算する。選択と選択されていない遺伝子の分布の図1における私たちのプロジェクトからの例を参照してください。
表1。候補遺伝子の選択に使用される基準
図1我々のプロジェクトで順序付けのために選択し、選択されていない遺伝子の分布を示すグラフ。我々は彼らのスコアの値に応じて遺伝子をソートすることで、候補のプロパティによって選ばれた遺伝子の分布を得た。例えば、SHANK3とNRXN1遺伝子、我々は新生突然変異を発見した二つの遺伝子は、（最大値は12です）、それぞれスコア7と6を持っていた。 - Exonprimerを通じてPrimers3ソフトウェアを使用して設計したプライマー。唯一のコード領域、スプライスジャンクションは、エクソンの各側に余分な50塩基対を含むカバーされるべきである。
- Taqポリメラーゼ、反応容積の選択のためのPCR条件等を最適化する
- すべてのPCR断片を最適化する
- 標準的な手順にしたがって血液サンプルから抽出したゲノムDNAの5 ngを増幅する
- シークエンシングのために送信する前に、2％アガロースゲルをロードすることによってあなたのPCR産物の品質管理を行います。無作為にサンプルを選択する。
- 一方の鎖上のDNA AnalyzerのシーケンスPCR産物を。トレースの90％以上の分析が可能な場合はフラグメントは正常塩基配列とみなされます。これは、大規模なスクリーニングに適用されます。
- バリアントの検出
- このようなPolyPhred、Polyscanと突然変異のサーベイヤーとしてゲノム変異の検出と遺伝子型のためのツールを使用してください。 2つ以上の検出ツールの組み合わせは理想的です。例えば、V.5をPolyPhredとデフォルトの設定でv.6をPolyPhred同じ変化を検出しません。 V.3 Polyscanはindelsの（93％）のためのSNP（96％）と少ないため高い偽陽性突然変異率を持っています。 PolyPhred V.6は真indelsの大多数を検出しましたが、偽陽性の突然変異率（indelsのための）（90％）Polyscan V.3全体のより低いを持っていませんでした。我々はPolyscan V.3のためのSNP検出のオプションを削除して、両方PolyPhred V.5を保持し、バリアントの検出のためv.6をPolyPhredてください。突然変異のサーベイとPolyscanはindelsの検出に優れています。注：Polyscanを使用するときにSNP検出のオプションが適用されるべきではない。のみ"INDEL"オプションをオンにする必要があります。 Polyscanは、SNP検出のための多くの偽陽性に生成されます。
- 検出されたそれぞれのユニークな小説エクソンバリアントの場合は、フラグメントとresequをreamplifyingして手動で確認する発端者と技術的なアーティファクトを除去するためにリバースとフォワードプライマーを使用して両方の両親をencing。
- 候補遺伝子の選択（複数可）
- 全体exomeシークエンシング
このアプローチは、人間のゲノムのコード領域の大部分をターゲットにハイスループットシーケンシングです。我々は現在、潜在的な候補遺伝子の検出を加速する、私たちの研究室ではこの新しいアプローチを使用しています。- ロシュのような他の人により、Agilentまたはその他の同様の製品によって設計された16,000以上の遺伝子（ゲノムの50 MB）のコード領域を標的とする"SureSelect人間のすべてのエクソンを"命ずる。キャプチャキットを注文する前に、シーケンシングプラットフォームは、（イルミナ対SOLID）を決定する必要があります。
- Agilentのプロトコルに応じてキャプチャを実行してください
- あなたのそれぞれの利用可能な次世代のプラットフォーム上でシーケンスの製品を
- 全体exomeシーケンシングからバリアントの検出：次世代シーケンシングプラットフォームからのゲノム変異の検出と遺伝子型のいくつかのバイオインフォマティクスのツールは、BWA、Bfast、アライメントを実行するビオスコープとして利用可能です。そのあとで追加の自由に利用できる下流のツールは、（たとえば、SAMツール、Varscan、Annovar）それは変種を呼び出して、注釈を付けるために必要になります。配列アラインメントとバリアントの呼び出しと注釈を組み込んだ商用ソフトウェアはまた、ネクストジェン（Softgenetics）、CLCバイオ、など、など、用意されています
4。ゲノムバリアントの優先順位付け
同定された変異体は、その後のde novoおよびタンパク質またはmRNAの機能及び/または構造体への有害さの彼らの確率に応じてフォローアップのために優先順位付けされます。バリアントは、以下のようになるはずのde novo変異の検出のための優先事項をフォローアップ：
- ユニークなバリエーション（一つのケースで一度に観察）
- 両親には存在しないバリエーション
- タンパク質-切り捨てるバリエーション：ナンセンス、フレームシフト、スプライシング変異につながるindelsの。
- ミスセンスとサイレント変異（例えば、mRNAのスプライシングに影響を与える）機能的に破壊的であると予測。タンパク質上の機能予測の効果のためのPolyphen、SIFTとPantherを使用してください。
全体exomeシーケンシングを使用している場合、候補遺伝子の選択は、さらなる研究のための優先順位を付ける変種のための戦略として使用することができます。
5。遺伝学的検証
- 追加の患者のケースで遺伝子全体を再シーケンス（他の原因となる変異を識別するため）およびコントロールで。対照試料は、優先順位付けの亜種の対立遺伝子頻度を評価するために使用されます。別の患者（ただし、コントロールサンプルまたは公共のデータベース内）にある少なくとも二つの異なるde novoの有害な突然変異を（ナンセンス、スプライシング、フレームシフト、および有害なミスセンスを予測）を含む任意の遺伝子は高度にさらに検証研究のために優先されるべき。患者由来リンパ芽球様細胞株における潜在的なスプライシングの欠陥のための1）のテストを：これが含まれています。我々の経験では、ほとんどの遺伝子は、リンパ芽球様細胞株からのRT - PCR産物を得、2）さらに、テストの機能レベルでの変異/遺伝子）リンパ芽球様細胞株および3からのタンパク質抽出物の定量的なウェスタンブロット分析により改変されたタンパク質の発現レベルを調べる動物（C虫、ゼブラフィッシュ）と、以前に私たちのグループ（例：5,6）によって行われたとして、細胞株モデル。
6。代表的な結果：
このプロトコルに続いて、我々は統合失調症と自閉症のための新しい遺伝子を同定することができた。一例として、私たちの最近SHANK3遺伝子の探索（図2）です。 SHANK3遺伝子内の異なる2つのde novo変異、三の影響を受ける弟一、影響を受けた女性の1つのミスセンス変異で見つかったものナンセンス突然変異。
図2。家族PED 419の三の影響を受ける人の兄弟にR1117Xナンセンス突然変異の（）分離。発端者は矢印で示されます。PED 56の（B）発端者のR536Wのミスセンス変異の分離ではなく、彼女の非罹患兄弟。
Discussion
ここで説明する手順は、de novo変異から、一部では、可能性の高い結果という特定の一般的な疾患を識別するために、そしてこの仮説を証明することを目指しています。 de novoの変異は、例えば、疾患の数、遺伝性がん症候群の開発のための十分に確立されたメカニズムですが、不十分な一般的な疾患で検討されている。ごく最近、次世代シーケンシングの出現との効果的なコストになっているDNAの大量のシーケンシングを必要とするのde novo変異、、の同定に関わる技術的な課題から一部の結果でこの。さらに、ヒトの新生突然変異率は、ごく最近まで、唯一の見積もりでした。ごく最近では、そこにレポートが直接ヒトでの突然変異率を決定している。これらの測定に先立ち、それはこの種の研究に必要なサンプルサイズを予測し、観測された新生突然変異率が基準率より大きいかどうかを確認することは困難であった。全ゲノム対の候補遺伝子をシーケンシング？報告された疾患の変異の大部分はミスセンス/ナンセンス変異であると私たちのスクリーニング戦略は、既知の変異の68％以上を特定するというスプライス部位の変異（HGMDウェブサイトによると）ですので。アミノ酸置換の重症度と臨床表現型の可能性との間の明確な関係もあります。保存的アミノ酸置換と比較して、ナンセンスの変化は臨床的に7を提示する可能性が9.0倍です。従って、この時点で、シーケンスの候補遺伝子は、最も費用対効果の高い戦略です。
概説する手順の成功は、詳細に概説し、二つの例、自閉症や統合失調症を使用して示されているいくつかの重要なステップ、に依存する。その画面、DNAの源、そして効率的にde novoの変異を識別する方法の詳細に患者の病気が選択するかなどの回避する必要がある多くの落とし穴が、、があります。我々は、最も効率的にそのような自然突然変異に起因するいかなる疾患の症例の割合を決定するための方法を提供する。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、資金調達源ゲノムカナダとゲノムケベック州、およびモントリオール大学と同様に（S2D）プロジェクト"病にシナプス"私たちに資金を供給するためのイノベーションのためのカナダの財団からの資金に感謝。
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