Summary
자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애를 일으키는 데 노보 변이를 찾기위한 분자 유전 전략.
Abstract
같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 대한 메커니즘로 드 노보 변이의 역할을 지원하는 증거가 여러 라인이있다. 첫째, 인간의 드 노보 변이 속도가 상대적으로 높은 새로운 돌연변이 인구의 높은 주파수에서 생성됩니다. 그러나, 드 노보 변이가 가장 흔한 질병에보고되지 않았습니다. 배아 단계 또는 감소 생식 적합성 이러한 파괴 장면을 보여 주죠로 표현형,에 대한 강한 부정적인 선택이 심각한 질병에 최고의 유전자에 돌연변이가 여러 가족에게 전염되지 않습니다, 따라서 결합 유전자 매핑 또는 협회에 의해 감지되지 않습니다 연구. monozygotic 쌍둥이에서 매우 높은 일치의 관찰과 dizygotic 쌍둥이 매우 낮은 일치도 강하게 가지 경우 상당한 분율이 새로운 돌연변이에서 발생할 수있는 가설을 지원합니다. 이러한은 자폐증과 정신 분열증과 같은 질환의 경우입니다. 둘째, 감소 생식 피트니스 1과 매우 가변 환경 요인에도 불구하고, 일부 질병의 발병률이 상대적으로 높고 일정한 속도로 세계적으로 유지됩니다. 이것은 전세계적으로 약 1 %의 발병률과 자폐증과 정신 분열증의 경우입니다. Mutational 부하가에 대한 선택 사이의 균형 또는 드 노보 돌연변이에 의해 해로운 돌연변이 및 생산에 대한 생각을하실 수 있습니다. 생식의 낮은 가격은 궁극적으로 감소 질병 유행 선도, 인구의 돌연변이 대립 유전자의 개수를 줄일 수 있어야 부정적인 선택 요소를 구성합니다. 이러한 선택적 압력은 다른 환경에서 서로 다른 강도의 경향이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 심각한 정신 질환은 그들이에 대한 강한 부정적인 선택에도 불구하고 문화와 국가의 광범 세계 인구의 지속적인 비교적 높은 유행에서 유지되었습니다. 이것은 높은 새로운 돌연변이 비율이 있었다고하지 않는 한, 감소 생식 적합성과 질병의 예측 될지되지 않습니다. 마지막으로, 아버지의 나이의 영향 :이은 아버지 드 노보 변이에서 연령 관련 증가에서 발생할 수 증가 아버지의 나이와 질병의 증가 위험이 상당히 있습니다. 이것은 자폐증과 정신 분열증 세의 경우입니다. 돌연변이 속도의 남성 대 여성 비율은 아마도 남성의 나이가 세균 세포 분열의 높은 숫자로 인해 약 4-6:1 규모이다. 따라서, 하나는 드 노보 변이가 더 자주 남성, 특히 기존의 남성 4에서 온 것이라고 예측합니다. 유전자 연구가 지금까지와 같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 단지 질환의 유전자에 predisposing 많은 유전자를 식별하는 데 실패, 왜 질병이 인간 게놈에서 유전자의 단순한 3%에 대한 확인되었습니다 이유는 새로운 변이의 높은 비율은 부분적으로 설명 있습니다 . 질병의 원인으로 드 노보 변이에 대한 식별 공부 부모와 영향을받는 과목을 포함하는 타겟 분자 접근을 필요로합니다. 질병의 유전 기초가 드 노보 변이에서 부분이 연결이 예에서 볼 수 있듯이 자폐증과 정신 분열증을 사용하여 그림 것입니다 확립 분자 접근을 초래할 수있다면 결정하기위한 과정입니다.
Protocol
1. 드 노보 변이로 인해 발생할 수 있습니다 질병의 선택
다음 기준에 해당하는 질병은 드 노보 변이의 가설을 저장할 수 :
- 생식 적합성이 줄어 듭니다.
- 질병의 빈도는 널리 환경 변화에도 불구하고 상대적으로 높은 지속됩니다.
- 질병은 높은 아버지의 나이가 연결되어 있습니다.
- 클래식 연계 및 협회 연구는 질병 heritability의 상당 부분을 설명하지 못했습니다.
- 트윈 일치 데이터는 드 노보 모델을 지원합니다.
드 노보 변이가 일부에서 유전 기초를 설명 수있는 일반적인 질병은 중요한 첫 단계입니다 가능성 분석.
2. 케이스 및 DNA 샘플의 선택
적절한 샘플의 선택은 드 노보 변이의 식별의 성공을 위해 중요합니다. 드 노보 변이를 찾는 기회를 극대화하기 위해, 우리는 다음을 추천 :
- 영향을받지 부모, 나이가 아버지와 질병의 확대없이 가족 역사를 가진, 발병, 심한 표현형의 어린 나이와 사례를 선택합니다.
- 그의 사용할 수 DNAs 연구를 실시 충분 환자를 선택합니다. 특히 중요한 culturing의 대상이 아니었 일차 전지 소스 (예 : 혈액 DNA 또는 타액 DNA)에서 DNA의 가용성은,
- 양쪽 부모 DNA의 가용성 변이 전송 상태 (대 드 노보를 상속) 결정하기 위해 중요합니다. 후보 유전자가 확인되면 추가 영향을 동료 및 일반 컨트롤의 가용성 유전자 확인 연구가 필요합니다.
- 변이 속도, 상영하는 유전자의 양과 드 노보 돌연변이에서 발생할 수 가지 경우 분율의 추정에 따라 표본 크기를 예상하고있다.
3. 진 resequencing, 두 가지 주요 방법
- 고품질 낮은 처리량 시퀀싱
이 접근법은 후보 유전자 접근 방식을 기반으로합니다.- 후보 유전자의 선택 (S)
6 주요 기준에 건설되는 점수 시스템을 바탕으로 최고의 후보 유전자를 선택합니다. 다음 표 1에 나열된 여섯 기준을 사용하여 귀속 모든 포인트의 합계 통신을 총 계산합니다. 선택과 선택되지 않은 유전자 분포의 그림 1에서 우리의 프로젝트에서 예제를 참조하십시오.
후보 유전자 선택에 사용되는 표 1. 기준
그림 1. 우리 프로젝트의 시퀀싱에 대해 선택하고 선택하지 않은 유전자의 분포를 보여주는 그래프. 우리는 그들의 점수 값에 따라 정렬 유전자에 의해 후보 등록에 의해 순위가 유전자의 분포를 획득하였습니다. 예를 들어, SHANK3과 NRXN1 유전자, 우리는 드 노보 변이를 발견이 유전자 (최대 12) 각각 점수 7 6 있었다. - Exonprimer 통해 Primers3 소프트웨어를 사용하여 디자인 primers. 전용 영역을 코딩 및 스플 라이스 교차점은 엑슨의 각 측면에 여분의 50 기본 쌍을 포함하여 적용해야합니다.
- DNA 형성 촉매의 선택에 대한 최적화 PCR 조건, 반응 볼륨 등
- 모든 PCR 조각을 최적화
- 표준 절차에 따라 혈액 샘플에서 추출한 게놈 DNA의 5 NG를 증폭
- 시퀀싱을 위해 보내기 전에 2 % 아가로 오스 겔을 로딩하여 PCR 제품의 품질 관리를 않습니다. 무작위로 샘플을 선택했습니다.
- 한 가닥의 DNA 분석에 순서 PCR 제품. 흔적의 90 % 이상의 분석이 가능하면 조각이 성공적으로 합성 간주됩니다. 이것은 대규모의 심사에 대해 적용됩니다.
- 변형 감지
- 이러한 PolyPhred, Polyscan 및 돌연변이의 서베로 게놈 유사 감지 및 genotyping 도구를 사용하십시오. 2 개 이상의 검색 도구의 조합이 이상적입니다. 예를 들어, V.5을 PolyPhred하고 기본 설정이 같은 변화를 감지하지와 V.6를 PolyPhred. v.3 Polyscan는 INDELs (93 %)에 대한 SNPs (96 %)과 적은 비용으로 높은 거짓 긍정적인 돌연변이 속도를했습니다. PolyPhred V.6 사실 INDELs의 대부분을 감지하지만 (90 %) Polyscan v.3 전체보다 낮은 거짓 긍정적인 돌연변이 속도를 (INDELs)을하지 않았다. 우리는 v.3 Polyscan에 대한 SNPs 감지 옵션을 제거하고 V.5 PolyPhred 모두 유지하고 변형 감지 V.6를 PolyPhred해야합니다. 돌연변이의 서베 및 Polyscan는 indels 검출에 더 있습니다. 참고 : Polyscan를 사용할 때 SNP 검출의 옵션이 적용되지 않습니다. 오직 "indel"옵션을해야합니다. Polyscan는 SNP 탐지 많은 거짓 긍정으로 생성되었습니다.
- 각각의 독특한 소설 exonic 변종이 발견은 조각과 resequ을 reamplifying하여 수동으로 확인기술적 유물을 제거하기 위해 역방향 앞으로 primers를 사용하여 proband와 부모 모두를 encing.
- 후보 유전자의 선택 (S)
- 전체 exome 시퀀싱
이러한 접근 방식은 인간 genomes의 영역을 코딩의 대부분을 타겟으로 높은 처리량 시퀀싱입니다. 우리는 지금 현재 잠재 후보 유전자의 검출을 가속, 우리가 실험실에서이 새로운 접근 방식을 사용하고 있습니다.- 로체와 같은 다른 애질런트 또는 기타 유사한 제품의 설계 16,000 이상 유전자의 코딩 영역 (게놈의 50 MB)를 대상으로 "SureSelect 인간 모두 엑슨"을 주문. 캡처 키트를 주문하기 전에, 시퀀싱 플랫폼 (Illumina VS 고체) 결정되어야합니다.
- 애질런트 프로토콜에 따라 캡처를 수행
- 여러분의 각각의 가능한 차세대 플랫폼에서 시퀀스 제품
- 전체 exome 배열의 변형 검출 : 차세대 시퀀싱 플랫폼에서 게놈 유사 감지 및 genotyping에 대한 몇 가지 생물 정보학 도구 등 BWA, Bfast, 정렬을 수행합니다 Bioscope로 사용할 수 있습니다. 그 이후 추가로 자유롭게 사용할 하류 도구 (예 : SAM 도구, Varscan, Annovar)는 변종을 호출하고 주석하는 데 필요한 것입니다. 순서 정렬 및 변형 전화 및 주석을 포함 상용 소프트웨어는 또한 NextGEN (Softgenetics), CLC 바이오, 그리고 다른 사람으로 사용할 수 있습니다
4. 게놈 변형 우선 순위
확인된 변종은 다음 드 노보 및 단백질 또는 mRNA 기능 및 / 또는 구조에 해로운되는 그들의 확률에 따라 후속 조치의 우선 순위입니다. 변종은 다음과 같이되어야 드 노보 변종의 검출에 대한 우선순위를 따르십시오 :
- 고유 변형 (하나의 경우 한 번 휴일)
- 유사는 부모에 존재하지
- 단백질 truncating 변화 : 말도 안돼, frameshift 및 splicing 변이로 이어지는 indels합니다.
- Missense과 자동 변형 (예를 들어, mRNA의 splicing에 영향을) 기능 파괴로 예측했다. 단백질의 기능 예측 효과 Polyphen, 선별 및 표범을 사용합니다.
전체 exome 배열을 사용하는 경우 후보 유전자의 선택은 진학에 대한 우선순위를 변형에 대한 전략으로 사용할 수 있습니다.
5. 유전자 검증
- 추가 환자 케이스 (다른 원인이되는 변이를 식별) 및 컨트롤의 전체 유전자를 Resequence. 컨트롤 샘플 우선순위 변종 allelic 주파수를 평가하는 데 사용됩니다. 다른 환자 (하지만 컨트롤 샘플 또는 공공 데이터베이스에)에있는 적어도 두 개의 서로 다른 데 노보 해로운 돌연변이 (넌센스, splicing, frameshifts 및 손상 missense 예상)이 들어있는 유전자는 매우 더 검증 연구 우선되어야합니다. 환자에서 파생된 lymphoblastoid 세포 라인에 잠재적인 splicing 결함 1) 테스트 :이 포함되어 있습니다. 우리의 경험에서, 대부분의 유전자 lymphoblastoid 세포 라인에서 RT - PCR 제품 수율, 2) 추가 시험의 기능 수준에서 돌연변이 / 유전자) lymphoblastoid 세포 라인과 3 단백질 추출물의 양적 서양 얼룩 분석에 의해 변경 단백질 발현 수준을 조사 동물 (C 엘레간스, Zebrafish)과 이전의 그룹 (예 : 5,6)에 의해 수행과 같은 세포 라인 모델.
6. 대표 결과 :
이 프로토콜에 따라, 우리는 정신 분열증과 자폐증에 대한 새로운 유전자를 식별할 수 있었다. 한 예로 우리가 최근 SHANK3 유전자 발견 (그림 2)입니다. SHANK3 유전자에 두 개의 서로 다른 드 노보 변이 한 영향을 여성의 세 형제 영향을 하나의 missense 변이에서 발견된 난센스 돌연변이.
그림 2. 가족 PED 419 세 영향을받는 형제의 R1117X의 난센스 돌연변이의 (A) 독방. proband은 화살표로 표시됩니다. PED 56 (B) proband에서 R536W의 missense 변이의 독방 아니지만 그 이외의 영향을받는 형제.
Discussion
여기에 설명된 절차는 가능성이 결과, 부분, 드 노보 돌연변이에서,이 가설을 증명하기 위해 특정 흔한 질병을 파악하는 것을 목표로하고있다. 드 노보 변이 예를 유전 암 syndromes에 대한 질병의 숫자의 개발을위한 잘 구축 메커니즘 있지만, 제대로 흔한 질병으로 살펴왔다. 이것은이 DNA의 대량의 시퀀싱을 필요로 드 노보 변이의 식별에 관련된 기술적인 도전의 부분 결과에 최근 차세대 시퀀싱의 출현과 함께 비용 효과됩니다. 또한, 인간의 드 노보 변이 율은 매우 최근까지, 오직 예상했다. 단지 아주 최근에이 보고서를 직접 인간의 변이 속도를 결정했습니다. 이전 다음 측정하기 위해서는 이런 종류의 연구에 필요한 표본의 크기를 예측하고 관찰 드 노보 돌연변이 속도는 기본 속도보다 큰 경우에는 결정하기 힘들었다. 전체 게놈 대 후보 유전자를 시퀀싱? 보고된 질병 돌연변이의 대부분 missense / 넌센스 돌연변이 있으며, 우리의 심사 전략 알려진 돌연변이 중 68 % 이상 식별하는 것입니다 스플 라이스 사이트 돌연변이 (HGMD 웹 사이트에 따라)이되기 때문입니다. 아미노산 교체의 심각와 임상 표현형의 가능성 사이에 명확한 관계가 있습니다. 마찬가지로 보수적인 아미노산 치환에 비해 말도 변경보다 9.0 배 임상 7 제시 가능성이 높습니다. 따라서 이번에 시퀀싱 후보 유전자가 가장 비용 효과적인 전략이다.
설명 프로 시저의 성공은 세부 사항에서 설명한 두 예제, 자폐증과 정신 분열증을 사용하여 그림 몇 가지 중요한 단계에 따라 달라집니다. 이러한 선택하는 질병으로 피해야 할 많은 함정이있다 어떤 화면, DNA의 소스 효율적 드 노보 변이를 식별하는 방법에 대한 자세한 내용을 환자. 우리는 가장 효율적으로 이러한 자발적인 돌연변이의 결과 질병의 경우의 분율을 결정하는 방법을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 (S2D) 프로젝트 '질병에 시냅스'우리 자금에 대한 혁신에 대한 캐나다 재단의 자금 출처 게놈 캐나다와 게놈 퀘벡, 그리고 Université 드 몬트리올뿐만 아니라 자금을 감사드립니다.
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