Una estrategia para identificar mutaciones de novo en los trastornos comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia

Summary

Estrategia de genética molecular para encontrar mutaciones de novo que causan enfermedades comunes tales como el autismo y la esquizofrenia.

Abstract

Hay varias líneas de evidencia que apoya el papel de las mutaciones de novo, como mecanismo para enfermedades comunes, tales como el autismo y la esquizofrenia. En primer lugar, la tasa de mutación de novo en los seres humanos es relativamente alta, por lo que nuevas mutaciones se generan en una alta frecuencia en la población. Sin embargo, mutaciones de novo no se han reportado en la mayoría de las enfermedades comunes. Las mutaciones en los genes que conducen a enfermedades graves donde existe una fuerte selección negativa contra el fenotipo, como la mortalidad en las fases embrionarias o la aptitud reproductiva reducida, no se transmitirá a varios miembros de la familia, y por lo tanto no será detectado por el mapeo de genes vinculación o asociación los estudios. La observación de concordancia muy alta en gemelos monocigóticos y la concordancia muy baja en los gemelos dicigóticos también apoya firmemente la hipótesis de que una fracción significativa de los casos puede ser consecuencia de nuevas mutaciones. Tal es el caso de enfermedades como el autismo y la esquizofrenia. En segundo lugar, a pesar de reducción de la aptitud reproductiva ¹ y los factores ambientales extremadamente variable, la incidencia de algunas enfermedades se mantiene en todo el mundo a una velocidad relativamente alta y constante. Este es el caso del autismo y la esquizofrenia, con una incidencia de aproximadamente el 1% de todo el mundo. Carga mutacional puede ser considerado como un equilibrio entre la selección a favor o en contra de una mutación deletérea y su producción por una mutación de novo. Las menores tasas de reproducción constituyen un factor de selección negativa que se debe reducir el número de alelos mutantes en la población, en última instancia conduce a la prevalencia de la enfermedad disminuyó. Estas presiones selectivas tienden a ser de distinta intensidad en diferentes ambientes. Sin embargo, estos trastornos mentales graves se han mantenido en una constante prevalencia relativamente alta en la población de todo el mundo a través de una amplia gama de culturas y países a pesar de una fuerte selección negativa en contra de ellos ^dos. Esto no es lo que se podría predecir en enfermedades con capacidad de reproducción reducida, a menos que hubiera una alta tasa de mutación nueva. Finalmente, los efectos de la edad paterna: hay un aumento significativo del riesgo de la enfermedad con la edad paterna, lo que podría resultar del aumento relacionado con la edad paterna en mutaciones de novo. Este es el caso del autismo y la esquizofrenia ^3. La relación hombre-mujer de la tasa de mutación se estima en aproximadamente 4-6:1, presumiblemente debido a un mayor número de divisiones de células germinales con la edad en los hombres. Por lo tanto, se podría predecir que mutaciones de novo que con mayor frecuencia provienen de los hombres, en particular los varones mayores ^4. Una alta tasa de nuevas mutaciones podrían en parte explicar por qué los estudios genéticos no han logrado identificar muchos genes que predisponen a las enfermedades de los complejos de genes, como el autismo y la esquizofrenia, y por qué las enfermedades se han identificado sólo al 3% de los genes en el genoma humano . La identificación de mutaciones de novo como causa de una enfermedad requiere un enfoque específico molecular, que incluye a los padres y el estudio de los sujetos afectados. El proceso para determinar si la base genética de una enfermedad puede resultar, en parte, a partir de mutaciones de novo y el enfoque molecular para establecer este vínculo se ilustrará, con el autismo y la esquizofrenia como ejemplos.

Protocol

1. Selección de la enfermedad que puede ser causado por mutaciones de novo

Una enfermedad que corresponde a los siguientes criterios pueden encajar con la hipótesis de la mutación de novo:

1. La capacidad reproductiva se reduce.
2. La frecuencia de la enfermedad es relativamente alta y constante a pesar de muy diversos entornos.
3. La enfermedad se asocia con una mayor edad paterna.
4. El vínculo clásico y estudios de asociación no pudo explicar una fracción significativa de la heredabilidad de la enfermedad.
5. Los datos de concordancia de gemelos apoyar un modelo de novo.

El análisis de la probabilidad de que una enfermedad común en mutaciones de novo puede explicar en parte la base genética es un primer paso crítico.

2. Selección de casos y muestras de ADN

La selección de muestras adecuadas es fundamental para el éxito de la identificación de mutaciones de novo. Para maximizar las posibilidades de encontrar mutaciones de novo, se recomienda lo siguiente:

1. Seleccionar los casos con la edad temprana de inicio, fenotipo grave, con los padres afectados, los padres mayores y no tienen antecedentes familiares prolongado de la enfermedad.
2. Elegir a los pacientes cuyo ADN disponibles son suficientes para realizar el estudio. Especialmente crítica es la disponibilidad de ADN de una fuente de células primarias que no fue objeto de cultivo (por ejemplo ADN de sangre o de ADN de saliva),
3. La disponibilidad de los padres del ADN es fundamental para determinar el estado de la transmisión de la mutación (heredado frente de novo). Disponibilidad de nuevos cohortes afectadas y los controles normales es necesario para los estudios de validación genética, una vez se identifican los genes candidatos.
4. Estimar el tamaño de la muestra sobre la base de la tasa de mutaciones, la cantidad de genes que se proyectarán y la estimación de la fracción de casos que pueden resultar de una mutación de novo.

3. Gene resecuenciación, dos enfoques principales

1. De alta calidad secuencia de bajo rendimiento
   Este enfoque se basa en los genes candidatos enfoques.
   1. La selección de genes candidatos (s)
      Seleccionar el mejor candidato genes sobre la base de un sistema de puntuación que se basa en seis criterios principales. A continuación, calcular el total que corresponde a la suma de todos los puntos atribuidos con los seis criterios enumerados en la Tabla 1. Véase el ejemplo de nuestro proyecto en la figura 1 de la distribución seleccionado y no seleccionado los genes.
      
      Tabla 1. Criterios para la selección de genes candidatos
      
      
      Figura 1. Gráfico que muestra la distribución de los genes seleccionados y no seleccionado para la secuenciación de nuestro proyecto. Se obtuvo una distribución de genes entre los viajeros de propiedades candidato por los genes de clasificación de acuerdo a su valor en puntos. Por ejemplo, los genes y SHANK3 NRXN1, dos genes que hemos encontrado una mutación de novo, tenían una puntuación de 7 y 6, respectivamente (el máximo es 12).
   2. Cartillas de diseño con Primers3 software a través de Exonprimer. Sólo la región de codificación y nudo de empalme deben ser cubiertos, incluyendo un extra de 50 pares de bases a cada lado del exón.
   3. Optimizar las condiciones de PCR para la elección de Taq, el volumen de reacción, etc
   4. Optimizar todos los fragmentos de PCR
   5. Amplificar 5 ng de ADN genómico extraído de muestras de sangre de acuerdo a procedimientos estándar
   6. Antes de enviar la secuencia, hacer control de calidad de sus productos PCR por la carga de un 2% en gel de agarosa. Seleccionaron al azar las muestras.
   7. Secuencia de los productos de PCR en un analizador de ADN en una cadena. Un fragmento de la secuencia se considera con éxito si el análisis de más del 90% de las huellas es posible. Esto es aplicable para una proyección a gran escala.
   8. Detección de variantes
      1. Utilice las herramientas para la detección y genotipificación de las variaciones genómicas como PolyPhred, Polyscan Surveyor y mutación. Una combinación de más de dos herramientas de detección es ideal. Por ejemplo, PolyPhred v.5 y v.6 PolyPhred con la configuración predeterminada no detectan las variaciones de lo mismo. V.3 Polyscan tiene una tasa de falsos positivos mutación mayor de SNPs (96%) y menos para el indeles (93%). PolyPhred v.6 no detecta la mayoría de los indeles cierto, pero tienen una tasa de falsos positivos de mutación (por indeles) inferior Polyscan general v.3 (90%). Debemos eliminar la opción de detección de SNPs para v.3 Polyscan y mantener ambas PolyPhred v.5 y v.6 PolyPhred para la detección de la variante. Surveyor mutación y Polyscan son mejores para la detección de indeles. Nota: La opción de detección de SNP no debe aplicarse cuando se utiliza Polyscan. Sólo el "indel" opción debe estar encendida. Polyscan generado a muchos falsos positivos para la detección de SNP.
      2. Para cada uno nuevas variantes únicas exonic detectado, lo confirman de forma manual por reamplifying el fragmento y resequexperimentando el índice y los dos padres utilizando los cebadores atrás y hacia adelante para eliminar cualquier artefacto técnico.
2. Toda la secuencia exoma
   Este enfoque es una secuenciación de alto rendimiento dirigidos la mayoría de las regiones codificantes del genoma humano. Ahora estamos en la actualidad con este nuevo enfoque en el laboratorio, lo que acelera la detección de posibles genes candidatos.
   1. Pide el "SureSelect Humanos Todos los Exon" dirigidas a la región de codificación de más de 16.000 genes (50 MB del genoma), diseñado por Agilent o cualquier otro producto similar a otros como Roche. Antes de pedir el kit de captura, las plataformas de secuenciación debe determinar (Illumina vs sólido).
   2. Hacer la captura de acuerdo con el protocolo de Agilent
   3. Secuencia del producto en su respectiva disposición plataforma de próxima generación
   4. Variante de la detección de toda la secuencia exoma: Varias herramientas bioinformáticas para la detección y genotipificación de las variaciones del genoma de la plataforma de secuenciación de última generación están disponibles, tales como ABM, bfast, Bioscope que llevará a cabo la alineación. Después de que otras herramientas de abajo libre disposición (por ejemplo, herramientas de SAM, Varscan, Annovar) sería necesario para llamar y anotar las variantes. Software comercial que incorpora la alineación de secuencias y llamando a la variante y la anotación también están disponibles como, NextGEN (Softgenetics), Bio CLC, y otros

4. Variantes genómicas priorización

Variantes identificadas se priorizan para el seguimiento de acuerdo a su probabilidad de ser de novo y son nocivos para la función de proteínas o de ARNm y / o estructura. La variante de seguimiento de las prioridades para la detección de la variante de novo debe ser como sigue:

1. Variaciones únicas (como se observa, una vez en un solo caso)
2. Variaciones no están presentes en los padres
3. Proteínas truncar variaciones: un disparate, que lleva a indeles frameshift y mutaciones de empalme.
4. Variación de cambio de sentido y silenciosa prevé que sea funcionalmente perturbador (por ejemplo, afectan empalme del ARNm). Use PolyPhen, SIFT y PANTHER para efecto de predicción funcional de la proteína.

Si se utiliza la secuencia exoma todo, la selección de genes candidatos puede ser utilizado como una estrategia para dar prioridad a las variantes en estudio.

5. Validación genética

1. Volver a secuenciar el gen entero en casos de pacientes adicionales (para identificar otras mutaciones causantes) y en los controles. Las muestras de control se utilizarán para evaluar las frecuencias alélicas de las variantes de prioridad. Cualquier gen que contiene al menos dos diferentes mutaciones de novo nocivos (sin sentido, de empalme, marco de lectura, y predijo missense perjudiciales) en pacientes diferentes (pero no en las muestras de control o bases de datos públicas) debe ser de alta prioridad para los estudios de validación. Esto incluye: 1) las pruebas de un defecto de empalme potencial en líneas de células linfoblásticas derivadas de la paciente. En nuestra experiencia, la mayoría de los genes de rendimiento RT-PCR a partir de líneas de células linfoblásticas, 2) investigar los niveles alterados de expresión de la proteína por el análisis cuantitativo de Western blot de extractos de proteínas de las líneas de células linfoblásticas y 3) prueba más de la mutación / gen en el nivel funcional en animal (C. elegans, pez cebra) y los modelos de la línea celular como ya se ha hecho por nuestro grupo (por ejemplo: 5,6).

6. Los resultados representativos:

Siguiendo este protocolo, hemos sido capaces de identificar nuevos genes de la esquizofrenia y el autismo. Un ejemplo es nuestra recientemente SHANK3 el descubrimiento de genes (Figura 2). Dos diferentes mutaciones de novo en el gen SHANK3, una mutación sin sentido en tres hermanos afectados y una mutación sin sentido en una mujer afectada.

Figura 2. (A) La segregación de la mutación sin sentido R1117X de tres hermanos afectados de la familia 419 PED. El índice es indicado por la flecha. (B) La segregación de la mutación missense R536W en el probando, pero no su hermano no afectado en 56 PED.

Discussion

El procedimiento descrito aquí tiene como objetivo identificar determinadas enfermedades comunes que resultan probablemente, en parte, a partir de mutaciones de novo, y para probar esta hipótesis. Mutaciones de novo son un mecanismo bien establecido para el desarrollo de una serie de enfermedades, por ejemplo, los síndromes de cáncer hereditario, pero ha sido poco explorado en las enfermedades comunes. Esto a parte de los desafíos técnicos que participan en la identificación de mutaciones de novo, lo que requiere la secuenciación de grandes cantidades de ADN, que sólo muy recientemente rentable con la llegada de la Next Generation Sequencing. Además, la tasa de mutación de novo en los seres humanos era, hasta hace muy poco, sólo una estimación. Sólo muy recientemente se han producido informes que determinan directamente la tasa de mutación en los seres humanos. Antes de estas medidas, es difícil predecir el tamaño de muestra necesario para este tipo de estudio y para determinar si lo observado de la tasa de mutación de novo es mayor que la tasa de referencia. Secuenciación de genes candidatos en comparación con todo el genoma? Dado que la mayoría de las mutaciones de la enfermedad reportados son sin sentido / sin sentido y las mutaciones son mutaciones del sitio de empalme (de acuerdo al sitio web HGMD) nuestra estrategia de cribado se identifican más del 68% de las mutaciones conocidas. También hay una clara relación entre la gravedad de la sustitución de aminoácidos y la probabilidad de un fenotipo clínico. En comparación con una sustitución de aminoácido conservadora, un cambio de sentido es 9,0 veces más probabilidades de presentar síntomas clínicos 7. Por lo tanto, en este momento secuenciación de genes candidatos es la estrategia más rentable.

El éxito del procedimiento descrito depende de varios pasos críticos, que se describen en detalle y se ilustra con dos ejemplos, el autismo y la esquizofrenia. Hay muchas trampas que deben evitarse, tales como la enfermedad de la que seleccionar, que los pacientes a la pantalla, la fuente de ADN, y los detalles de la forma de identificar de manera eficiente las mutaciones de novo. Ofrecemos un método más eficiente para la determinación de la fracción de casos de cualquier enfermedad que resulta de tales mutaciones espontáneas.