En strategi för att identifiera de novo mutationer i vanliga sjukdomar som autism och schizofreni

Summary

Molekylärgenetiska strategi för att hitta de novo mutationer som orsakar vanliga sjukdomar som autism och schizofreni.

Abstract

Det finns flera rader av underlagen för roll de novo mutationer som en mekanism för vanliga sjukdomar som autism och schizofreni. För det första är de novo mutationshastighet hos människa relativt hög, så nya mutationer genereras på en hög frekvens i befolkningen. Dock har de novo mutationer inte rapporterats i de vanligaste sjukdomarna. Mutationer i gener som leder till svåra sjukdomar där det finns ett starkt negativt urval mot fenotypen, till exempel dödlighet i embryonala stadier eller nedsatt fortplantningsförmåga kondition, inte kommer att översändas till flera familjemedlemmar och därför inte kommer att upptäckas av länkage genetisk kartläggning eller förening studier. Observation av mycket hög samstämmighet i enäggstvillingar och mycket låg samstämmighet i tvåäggstvillingar också starkt stöd för hypotesen att en betydande andel av fallen kan bero på nya mutationer. Så är fallet för sjukdomar som autism och schizofreni. För det andra, trots minskad reproduktionsförmåga kondition ¹ och extremt varierande miljöfaktorer, ökar förekomsten av vissa sjukdomar upprätthålls i hela världen på en relativt hög och konstant hastighet. Detta är fallet för autism och schizofreni, med en incidens på ca 1% över hela världen. Mutationsstatus belastning kan ses som en balans mellan utbud för eller emot en skadlig mutation och sin produktion med de novo mutation. Lägre reproduktion utgör ett negativt urval faktor som bör minska antalet muterade alleler i befolkningen, vilket slutligen leder till minskad sjukdomsprevalensen. Dessa selektiva tryck tenderar att vara av olika intensitet i olika miljöer. Icke desto mindre har dessa allvarliga psykiska störningar hållits på en konstant relativt hög förekomst i befolkningen i världen inom ett brett spektrum av kulturer och länder trots en starkt negativ urval mot dem ^2. Detta är inte vad man skulle förutspå i sjukdomar med nedsatt fortplantningsförmåga fitness, såvida det inte fanns en stor ny mutation takt. Slutligen har effekterna av faderns ålder: finns det en signifikant ökad risk för sjukdomen med ökande faderliga ålder, vilket kan bli resultatet av åldersrelaterad ökning av faderlig de novo mutationer. Detta är fallet för autism och schizofreni ^3. Hanen till hona förhållandet mutationshastighet uppskattas till cirka 4-6:1, förmodligen på grund av ett högre antal bakteriefri celldelningar med åldern hos män. Därför skulle en förutspår att de novo mutationer skulle oftare kommer från män, särskilt äldre män ^4. En hög nya mutationer kan delvis förklara varför genetiska studier har hittills misslyckats med att identifiera många gener som predisponerar för komplex sjukdomar gener, som autism och schizofreni, och varför sjukdomar har identifierats för endast 3% av gener i det mänskliga genomet . Identifiering av de novo mutationer som orsak till en sjukdom kräver en riktad molekylär strategi, som inkluderar studerande föräldrar och berörda ämnen. Processen för att avgöra om den genetiska grunden för en sjukdom kan delvis bero på att de novo mutationer och molekylär metod för att upprätta denna länk kommer att illustreras med hjälp av autism och schizofreni som exempel.

Protocol

1. Val av sjukdom som kan orsakas av de novo mutationer

En sjukdom som motsvarar följande kriterier kan få plats med de novo-mutation hypotes:

1. Den reproduktiva fitness minskar.
2. Frekvensen av sjukdomen är relativt hög och konstant trots mycket varierande miljöer.
3. Sjukdomen är förenad med en högre faderlig ålder.
4. Den klassiska kopplingen och studier föreningen misslyckats med att förklara en större del av sjukdomen ärftlighet.
5. De två konkordans data stödjer en de novo-modell.

Analys av sannolikheten att en vanlig sjukdom där de novo mutationer kan delvis förklara den genetiska grunden är ett avgörande första steg.

2. Val av fall och DNA-prov

Val av lämpliga prov är avgörande för att lyckas med identifiering av de novo mutationer. För att maximera chansen att finna de novo mutationer, rekommenderar vi följande:

1. Välj fall med tidiga debutåldern, svår fenotyp med opåverkade föräldrar, äldre fäder och utan släkt historia av sjukdomen.
2. Välj patienter vars tillgängliga DNA är tillräckliga för att genomföra studien. Särskilt kritiska är att det finns DNA från en primär cell källa som inte utsattes för odling (t.ex. blod-DNA eller saliv DNA)
3. Tillgången till båda föräldrarna DNA är avgörande för att fastställa status mutationen transmission (ärvda kontra de novo). Tillgång till extra drabbade kohorter och normala kontroller är nödvändigt för genetiska valideringsstudier gång kandidatgener identifieras.
4. Uppskatta urvalsstorleken baserad på mutationer hastighet, mängden av gener som ska granskas och uppskattningen av andelen fall som kan bli resultatet av en de novo-mutation.

3. Gene resequencing; två huvudinriktningar för

1. Hög kvalitet med låg genomströmning sekvensering
   Detta synsätt bygger på kandidatgener metoder.
   1. Val av kandidat gen (er)
      Välj den bästa kandidaten gener bygger på ett poängsystem som bygger på 6 viktiga kriterier. Sedan beräkna den totala som motsvarade summan av alla poäng tillskrivs med sex kriterier som anges i tabell 1. Se exempel från vårt projekt i figur 1 av utvalda och inte utvalda gener distribution.
      
      Tabell 1. Kriterier som används för kandidaten genen valet
      
      
      Figur 1. Diagram som visar fördelningen av utvalda och inte valt gener för sekvensering i vårt projekt. Vi fick en spridning av gener efter kandidat egenskaper genom att sortera gener efter betyg värde. Till exempel hade SHANK3 och NRXN1 gener, två gener som vi hittade de novo-mutation, en poäng 7 respektive 6 (max är 12).
   2. Design grundfärger med Primers3 program via Exonprimer. Endast kodning regionen och skarva korsning bör omfattas även en extra 50 baspar på varje sida av exon.
   3. Optimera PCR förutsättningar för valet av Taq, reaktion volym etc.
   4. Optimera alla PCR-fragmenten
   5. Förstärk 5 ng genomiska DNA extraherat från blodprover enligt standardrutiner
   6. Innan du skickar för sekvensering, gör kvalitetskontroll av PCR-produkter genom att ladda en 2% agarosgel. Valts ut slumpmässigt urval.
   7. Sekvens PCR-produkter på ett DNA-Analyzer på en strand. En skärva anses framgångsrikt sekvenserat om den analys av mer än 90% av spåren är möjligt. Detta gäller för en storskalig screening.
   8. Varianter Detection
      1. Använd verktyg för detektion och genotypning av genomiska variation som PolyPhred, Polyscan och Mutation Lantmätare. En kombination av mer än 2 upptäckt verktyg är perfekt. Till exempel PolyPhred v.5 och PolyPhred V.6 med standardinställningarna inte upptäcka samma variationer. Polyscan v.3 har en högre falskt positivt mutationshastighet för SNP (96%) och mindre för INDELs (93%). PolyPhred v.6 inte upptäcktes de flesta sanna INDELs men har ett falskt positivt mutationshastighet (för INDELs) lägre än Polyscan v.3 totalt (90%). Vi bör ta bort möjligheten att SNP detektion för Polyscan v.3 och hålla både PolyPhred v.5 och PolyPhred v.6 för variant upptäckt. Mutation Surveyor och Polyscan är bättre för att upptäcka indels. Notera: Alternativet att SNP-detektering ska inte tillämpas vid användning Polyscan. Endast "indel" alternativet ska vara på. Polyscan genereras för att många falska positiva för SNP upptäckt.
      2. För varje unik roman exonic varianter upptäcks bekräfta det manuellt genom reamplifying fragmentet och resequencing den proband och båda föräldrarna med hjälp av back och fram primers för att eliminera eventuella tekniska artefakt.
2. Hela exome sekvensering
   Denna strategi är en hög genomströmning sekvensering riktar merparten av kodande regioner i det mänskliga genomet. Vi är nu använder denna nya metod i vårt labb, snabbare upptäckt av potentiell kandidat gener.
   1. Beställ "SureSelect Human Alla Exon" som riktar sig till kodningen regionen över 16.000 gener (50 MB av genomet) designad av Agilent eller någon annan liknande produkt av andra som Roche. Innan beställa fånga kit bör sekvensering plattformarna bestämma (Illumina vs fast).
   2. Gör fånga enligt Agilent protokollet
   3. Sekvens produkten på era respektive tillgänglig nästa generations plattform
   4. Variant upptäckt från hela exome sekvensering: Flera bioinformatiska verktyg för detektion och genotypning av genomiska variationer från nästa generations sekvensering plattformen finns tillgängliga som BWA, bfast, Bioscope som kommer att utföra justeringen. Därefter ytterligare fritt tillgängliga nedströms verktygsmaskiner (t.ex. SAM-verktyg, Varscan, Annovar) skulle behövas det att ringa och kommentera varianter. Kommersiella program som innehåller sekvens anpassning och variant ringer och anteckningar finns också exempel, NextGen (Softgenetics), CLC Bio och andra

4. Genomic varianter prioritering

Identifierade varianter är då prioriteras för uppföljning enligt deras sannolikhet i att vara de novo och skadliga för protein eller mRNA funktion och / eller struktur. Varianten följa upp prioriteringarna för detektion av de novo variant skall som följer:

1. Unik variationer (observerade en gång i ett enda fall)
2. Variationer närvarande inte föräldrarna
3. Protein-trunkering varianter: nonsens, indels leder till frameshift och mutationer splitsning.
4. Missense och tyst variation förväntas vara funktionellt störande (t.ex. påverkar mRNA splitsning). Använd Polyphen, sålla och PANTHER för funktionella förutsäga effekt på proteinet.

Om du använder hela exome sekvensering, kan valet av kandidat gener kan användas som en strategi för att prioritera varianter för vidare studier.

5. Genetiska validering

1. Ändring av turordning hela genen i ytterligare patientfall (för att identifiera andra orsakande mutationer) och kontroller. Kontrollen prov kommer att användas för att utvärdera allela frekvenser av prioriterade varianter. Varje gen innehåller minst två olika de novo skadliga mutationer (nonsens, splitsning, frameshifts, och förutspådde att skada missense) som finns i olika patienter (men inte i kontrollprover eller offentliga databaser) bör vara högt prioriterat för fortsatta valideringsstudier. Detta omfattar: 1) testa en potentiell skarvning fel i lymfoblastoid cellinjer från patienten. Vår erfarenhet är att de flesta gener ger RT-PCR-produkter från lymfoblastoida cell-linjer, 2) undersöka förändrade proteinnivåer uttryck genom kvantitativ Western blot-analys av protein utdrag ur lymfoblastoida cell-linjer och 3) ytterligare testa mutation / gen på funktionell nivå i djur (C elegans, Zebrafish) och cellmodeller linje som tidigare utförts av vår grupp (ex: 5,6).

6. Representativa resultat:

Efter detta protokoll, kunde vi identifiera nya gener för schizofreni och autism. Ett exempel är vår nyligen SHANK3 genfynd (Figur 2). Två olika de novo mutationer i SHANK3 genen, en nonsensmutation finns i tre drabbade bror och en missense mutation i en drabbad kvinna.

Figur 2. (A) segregeringen av R1117X nonsensmutation i tre drabbade bröder i familjen PED 419. Den proband indikeras av pilen. (B) segregeringen av R536W missense mutation i proband men inte hennes icke-drabbade bror i PED 56.

Discussion

Det förfarande som beskrivs här syftar till att identifiera särskilda gemensamma sjukdomar som sannolikt resultat, delvis från de novo-mutationer, och att bevisa denna hypotes. De novo mutationer är en väletablerad mekanism för utveckling av en rad sjukdomar, till exempel ärftlig cancer syndrom, men har varit dåligt utforskat i vanliga sjukdomar. Detta beror delvis på de tekniska utmaningarna vid identifiering av de novo-mutationer, vilket kräver att sekvensering av stora mängder DNA, som bara helt nyligen blivit kostnadseffektivt och med tillkomsten av nästa generations sekvensering. Dessutom var de novo mutationshastighet hos människor, tills helt nyligen, bara en uppskattning. Endast helt nyligen har det förekommit rapporter bestämma direkt mutationshastighet hos människor. Före dessa mätningar var det svårt att förutsäga urvalsstorlek som krävs för denna typ av studie och för att avgöra om de observerade de novo mutationshastighet är större än baslinjen takt. Sekvensering gener kontra hela genomet? Eftersom majoriteten av de rapporterade sjukdomar mutationer är missense / nonsens mutationer och skarva plats mutationer (enligt HGMD webbplats) vår screening strategi skulle identifiera över 68% av kända mutationer. Det finns också ett tydligt samband mellan graden av aminosyran ersättning och sannolikheten för en klinisk fenotyp. I jämförelse med en konservativ aminosyra substitution, är nonsens förändring 9,0 gånger större risk att presentera kliniskt 7. Således, vid denna tid sekvensering kandidatgener är den mest kostnadseffektiva strategin.

Framgången för den skisserade förfarandet beror på flera viktiga steg, som beskrivs i detalj och illustreras med två exempel, autism och schizofreni. Det finns många fallgropar som måste undvikas, till exempel vilken sjukdom att välja vilka patienter som till skärm, källa till DNA, och uppgifter om hur effektivt identifiera de novo-mutationer. Vi erbjuder en metod för att mest effektivt att bestämma hur stor del av fallen på någon sjukdom som resulterar från sådana spontana mutationer.