Summary
Virochip एक अखिल वायरल साथ - साथ संरक्षित अनुक्रम समरूपता के आधार पर सभी ज्ञात के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस उपन्यास वायरस का पता लगाने के लिए डिज़ाइन माइक्रोएरे है. यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे एक Virochip परख चलाने के लिए दोनों ज्ञात और अज्ञात वायरस की उपस्थिति के लिए नैदानिक नमूनों का विश्लेषण.
Abstract
कई संक्रामक रोगों के वायरल कारणों के निदान के वायरस के निहित अनुक्रम विविधता के रूप में अच्छी तरह के रूप में सार्स coronavirus और 2009 महामारी H1N1 इन्फ्लूएंजा वायरस, कि पारंपरिक तरीकों के द्वारा detectable नहीं कर रहे हैं जैसे उपन्यास वायरल रोगज़नक़ों, के चल रहे उद्भव के कारण मुश्किल है. इन चुनौतियों से निपटने के के लिए, हम पहले और विकसित किया है एक माइक्रोएरे संरक्षित अनुक्रम 1 समरूपता के आधार पर सभी ज्ञात के रूप में अच्छी तरह के रूप में वायरस उपन्यास वेरिएंट का पता लगाने की क्षमता के साथ अखिल वायरल Virochip बुलाया मंच पुष्टि. Virochip का उपयोग करना, हम अस्पताल में भर्ती रोगियों में अस्पष्टीकृत गंभीर बीमारी के मामलों सहित श्वसन संक्रमण, एक के बराबर या पारंपरिक चिकित्सीय परीक्षण 2-5 के लिए बेहतर संवेदनशीलता के साथ, के साथ जुड़े वायरस का पूरा स्पेक्ट्रम की पहचान की है. Virochip भी उपन्यास वायरस सार्स coronavirus 6,7, एक उपन्यास rhinovirus 5 क्लेड, XMRV (एक प्रोस्टेट कैंसर से जुड़े retrovirus) 8, एवियन (तोते में एक बर्बाद कर रोग का कारण) bornavirus 9 सहित, की पहचान किया गया है, और श्वसन और 10 अतिसारीय बीमारी के साथ बच्चों में एक उपन्यास cardiovirus है. Virochip के वर्तमान संस्करण एक Agilent माइक्रोएरे मंच रखी है और ~ +३६,००० 2009 के दिसंबर के रूप में ~ अधिक GenBank में 1500 वायरस से निकाली गई जांच के होते हैं. यहाँ हम शुरू से ही एक Virochip परख प्रसंस्करण में शामिल चरणों (~ 24 घंटे प्रतिवर्तन समय) नमूना न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पीसीआर प्रवर्धन यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग, फ्लोरोसेंट रंजक समावेश, और माइक्रोएरे संकरण, स्कैनिंग, और विश्लेषण सहित खत्म प्रदर्शित करता है.
Protocol
Virochip परख के कदम (1) न्यूक्लिक एसिड नैदानिक नमूनों से निकासी, (2) निकाले शाही सेना के रिवर्स प्रतिलेखन और 2 एन डी कतरा सीडीएनए संश्लेषण, (3) बेतरतीब ढंग से primed सीडीएनए पीसीआर प्रवर्धन, (3) Cy3 फ्लोरोसेंट डाई समावेश शामिल लेबल Virochip माइक्रोएरे के लिए सामग्री के संकरण (4), और (5) स्कैनिंग और विश्लेषण (चित्रा 1). प्रोटोकॉल नीचे दिखाया गया है एक बच्चे से एक इन्फ्लूएंजा जैसी बीमारी के साथ एक नाक झाड़ू नमूने पर Virochip परख का उपयोग प्रदर्शन करेंगे.
प्राइमर दृश्यों
प्राइमर एक 5'-GTTTCCCAGTCACGATA--3 (9 एन) '
बी 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 प्राइमर '
1. न्यूक्लिक एसिड निकासी
- नैदानिक नमूनों से न्यूक्लिक एसिड निकासी जैवसुरक्षा स्तर 2 (BSL-2) या उच्च शर्तों के तहत किया जाना चाहिए, के रूप में इन नमूनों संभावित संक्रामक हैं.
- नाक झाड़ू नमूना वायरल पकड़े माध्यम में ले जाया जाता है. विभाज्य एक 1.5 एमएल Eppendorf microcentrifuge ट्यूब में 200 नमूना के μL.
- 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर (वायरल कणों के लिए शुद्ध करने के लिए) के माध्यम से पारित: वैकल्पिक नमूना
- वैकल्पिक: (मेजबान जीनोमिक डीएनए नीचा और संरक्षित, encapsidated वायरल न्यूक्लिक एसिड के लिए शुद्ध) DNase निर्माता के निर्देशों के अनुसार टर्बो DNase किट (Ambion) का उपयोग के साथ pretreat नमूना
- नमूना Zymo ZR वायरल शाही सेना निकालना किट या निर्माता के निर्देशों के अनुसार Qiagen Ultrasens वायरस किट का उपयोग कर निकालें.
2. रिवर्स प्रतिलेखन और 2 एन डी कतरा सीडीएनए संश्लेषण ("एक दौर")
- 4 शाही सेना को निकाले उल उल 1 40 प्राइमर / pmol μL जोड़ें. 65 से हीट ° सी (जैसे GeneAmp पीसीआर सिस्टम 9700) thermocycler और फिर 5 मिनट के लिए कमरे Temp x 5 मिनट में ठंडा.
- 2 μL 5X आरटी बफर, 1 μL 12.5 मिमी dNTP, 1 μL पानी, 0.5 μL 0.1M डीटीटी, और 0.5 μL SSIII आरटी (Invitrogen) से मिलकर एक मास्टर मिश्रण के 5 μL जोड़ें. 42 में सेते डिग्री सेल्सियस x 60 मिनट.
- एक प्रोग्राम thermocycler में, 94 के लिए गर्मी डिग्री सेल्सियस x 2 (निरस्त करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस प्रतिक्रिया) मिनट, 10 को शांत ° सी, नाड़ी अपकेंद्रित्र, और तब 5 μL Sequenase 1 μL 5X Sequenase बफर, 3.8 μL पानी से मिलकर मिश्रण जोड़ने, और 0.15 μL Sequenase (यूएसबी निगम). 2 एन डी कतरा संश्लेषण के लिए रैंप से 10 ° 37 सी डिग्री सेल्सियस 8 मिनट से अधिक 94 के लिए 8 मिनट, फिर गर्मी पकड़ डिग्री सेल्सियस एक्स 2 (Sequenase निष्क्रिय) मिनट और 10 डिग्री सेल्सियस (पकड़) शांत.
- वैकल्पिक: Rd एक सीडीएनए नमूना -20 ° सी. पर इस बिंदु पर संग्रहीत किया जा सकता है है
3. पीसीआर के प्रवर्धन अनियमित Primed सीडीएनए ("दौर बी")
- 5 μL 10X पीसीआर बफर, 1 μL 12.5 मिमी dNTP, 1 μL 100 प्राइमर pmol / μL बी, 1 μL KlenTaq ला (सिग्मा), और 37 μL पानी से मिलकर एक मास्टर मिश्रण के 45 μL Rd के 5 उल एक नमूना जोड़ें.
- निम्नानुसार पीसीआर प्रोटोकॉल चलाएँ: 94 डिग्री सेल्सियस, 2 → मिनट (94 के 25 चक्रों डिग्री सेल्सियस, 30 / एस 50 डिग्री सेल्सियस, 45 / 72 एस ° सी, 1 मिनट) 72 → डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट 10 → ° C ( पकड़)
- एक 1.5% agarose वैद्युतकणसंचलन जेल पर Rd बी नमूना जाँच करें. लगभग 200 से एक धब्बा - 1000 बीपी visualized किया जाना चाहिए (2A चित्रा)
4. Cy3 प्रतिदीप्त डाई निगमन
- वैकल्पिक: एक और नमूना Cy5 फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया जा सकता है और एक ही माइक्रोएरे के लिए संकरित.
- आ - dNTP शामिल करने के लिए, 5 उल 10X पीसीआर, 1 उल 12.5 मिमी आ dNTP (Invitrogen), 1 उल 100 / pmol उल प्राइमर बी बफर, 1 से मिलकर एक मास्टर मिश्रण के 45 उल Rd बी नमूने के 5 उल जोड़ने, 1 उल KlenTaq ला (सिग्मा), और 37 उल पानी. पीसीआर प्रोटोकॉल के रूप में निम्नानुसार: 94 डिग्री सेल्सियस, 2 → मिनट (94 के 15 चक्रों डिग्री सेल्सियस, 30 / एस 50 डिग्री सेल्सियस, 45 / 72 एस ° सी, 1 मिनट) 72 → डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट 10 → ° C ( पकड़)
- स्वच्छ और निर्माता के निर्देशों के अनुसार Concentrator-5 किट (Zymo रिसर्च) डीएनए के साथ Rd सी नमूना साफ़. 10 μL में Elute.
- 1M बिकारबोनिट का 1 उल (सिग्मा) और 1 Cy5 उल Rd सी नमूना (जीई हेल्थकेयर) जोड़ें.
- सेते x 1 घंटे अंधेरे में.
- स्वच्छ और निर्माता के निर्देशों के अनुसार Concentrator-5 किट (Zymo रिसर्च) डीएनए के साथ साफ Cy3 - लेबल नमूना. 12 μL में Elute.
5. Virochip माइक्रोएरे के लिए संकरण
- वैकल्पिक: μL 1.5 का उपयोग करने के लिए सीडीएनए एकाग्रता और डाई की राशि एक Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शामिल की जांच (नमूनों की सामान्य के लिए)
- एक पीसीआर पट्टी ट्यूब में 25 μL की कुल मात्रा (Agilent) 1 μL 25x विखंडन बफर, 5 μL 5X अवरुद्ध बफर, Cy3 - लेबल नमूना 9.5 μL (या सामान्य राशि), और पानी जोड़ें
- 2X Gex संकरण बफर (Agilent) के 25 μL जोड़ें. संक्षेप में नीचे स्पिन बुलबुले को दूर.
- गैस्केट स्लाइड पर नमूने के 40 μL लोड.
- प्लेस Agilent मुद्रित Virochip (सरणी Californi के विश्वविद्यालयएक सैन फ्रांसिस्को / Agilent) (चिह्नित "Agilent" नीचे की ओर) और गैसकेट स्लाइड के शीर्ष पर पेंच कस जकड़ना.
- 65 में रातोंरात संकरण डिग्री सेल्सियस ओवन, 10 rpm पर गति सेटिंग.
- 37 डिग्री सेल्सियस सरणियाँ, पहले से गरम 2 बफर (Agilent) धो एक बफर (Agilent) में अलग गैसकेट / स्लाइड सरणी सैंडविच पानी के भीतर ले लो. बफर में 1 x 1 मिनट धो लें. Preheated बफर 2 x 1 मिनट में धो डालें. धीरे धीरे 2 बफर से स्लाइड निकालने के लिए, बुलबुले बचने के लिए सावधान किया जा रहा (kimwipe उपयोग के लिए दूर सीधे सरणी के सक्रिय पक्ष को छू से बचने के लिए सावधान किया जा रहा अतिरिक्त नमी बाती)
- स्लाइड धारक में स्लाइड प्लेस और सरणी स्कैनर में सम्मिलित है.
6. Virochip स्कैनिंग और विश्लेषण
- स्कैन Cy3 लेबल सरणी 5 सुक्ष्ममापी साधन मानक स्कैनिंग प्रोटोकॉल (चित्रा 2B) के अनुसार या 2 सुक्ष्ममापी पर.
- दृश्य निरीक्षण, गुच्छ विश्लेषण, या स्वचालित Virochip विश्लेषण प्रोग्राम द्वारा Virochip प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए, 11 ई भविष्यवाणी. इन तीन तरीकों में से प्रत्येक से, इन्फ्लूएंजा वायरस नाक झाड़ू (इन्फ्लूएंजा जैसी बीमारी के साथ एक बच्चे से) नमूना (चित्रा 2C) में आसानी से पता चला है
7. प्रतिनिधि परिणाम:
जब प्रोटोकॉल सही ढंग से किया है, एक धब्बा Rd बी कदम (2A चित्रा) के बाद agarose जेल वैद्युतकणसंचलन पर देखा जाना चाहिए. Agilent मंच पर Virochip माइक्रोएरे नेत्रहीन विश्लेषण (चित्रा 2B) मुश्किल हो जाएगा, लेकिन यदि कोई वायरस मौजूद है यह दृश्य निरीक्षण, गुच्छ विश्लेषण, और / या ई भविष्यवाणी (चित्रा 1C) द्वारा आसानी से पहचाना जाना चाहिए. परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा, नमूने एक ज्ञात वायरस (MS2 जीवाणुभोजी जैसे तंबाकू मोज़ेक वायरस) से मापा न्यूक्लिक एसिड की मात्रा के साथ बालीदार किया जा सकता है.
चित्रा 1. Virochip माइक्रोएरे प्रोसेसिंग और विश्लेषण के नैदानिक नमूनों से योजनाबद्ध न्यूक्लिक एसिड निकाले. बेतरतीब ढंग से प्रवर्धित, फ्लोरोसेंट रंजक के साथ लेबल कर रहे हैं, और Virochip माइक्रोएरे के लिए संकरित. प्रोटीन 2 सुक्ष्ममापी संकल्प पर स्कैन कर रहे हैं और कम्प्यूटेशनल उपकरण की एक किस्म का उपयोग, ई भविष्यवाणी सहित विश्लेषण.
चित्रा 2. Virochip परख में कदम यादृच्छिक पीसीआर, 200 का एक धब्बा द्वारा प्रवर्धन के बाद 1000 बीपी जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा visualized किया जा सकता है (ए) (बी) में 8 सरणियों / गिलास स्लाइड के तीन Virochip बाहर प्रोटीन, एक छोटे से क्षेत्र के साथ दिखाया जाता है. सही नीचे कोने पर इनसेट में उड़ा एक माइक्रोएरे के (सी) स्वचालित माइक्रोएरे वायरल विश्लेषण का उपयोग कर ई - नैदानिक नमूने में इन्फ्लूएंजा ए वायरस की मौजूदगी का खुलासा भविष्यवाणी. उच्च समानता स्कोर (= एस 0.55) पी मूल्य है कि शून्य के करीब है मेल खाती है, इस प्रकार एक अत्यंत महत्वपूर्ण भविष्यवाणी बनाने.
Discussion
Virochip के रूप में यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल जटिल है और एक जटिल और कुशल अनुसंधान तकनीशियन की आवश्यकता है. सही अभिकर्मक सांद्रता और पीसीआर, लेबलिंग के लिए शर्तों, और संकरण महत्वपूर्ण हैं. Virochip प्रोटोकॉल आसानी से रोगग्रस्त ऊतकों के न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए TRIzol (Invitrogen) के रूप में एक ऊतक निष्कर्षण विधि के उपयोग से विश्लेषण को समायोजित करने के लिए संशोधित कर सकते हैं. जांच या जोड़ा जा सकता है वांछित स्पेक्ट्रम और कवरेज की चौड़ाई प्राप्त करने के लिए आवश्यक के रूप में नष्ट कर दिया है, उदाहरण के लिए, जैसे जीवाणु और कवक nonviral लक्ष्य का पता लगाने के के लिए जांच और डिजाइन किया जा सकता है "मक्खी पर" जोड़ा. विकास के अंतर्गत वर्तमान Virochip परख के कुछ अनुप्रयोगों के नैदानिक प्रयोगशाला, प्रकोप की जांच, दवाओं और टीकों की शुद्धता स्क्रीनिंग, और उपन्यास वायरल रोगज़नक़ खोज में व्यापक स्पेक्ट्रम वायरल निदान शामिल हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम प्रारंभिक और Virochip प्रोटोकॉल के विकास के अनुकूलन के लिए डेविड वैंग, अनातोली Urisman, एमी Kistler, Kael फिशर, पैट्रिक तांग, और अलेक्जेंडर Greninger धन्यवाद. यह काम एक NIH K08 अनुदान और Abbott डिस्कवरी पुरस्कार (सीसी के लिए) और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट (JLD के लिए) द्वारा समर्थित है.
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