Summary
Virochip является пан-вирусных микрочипов предназначен для одновременного обнаружения всех известных вирусов, а также новыми вирусами на основе сохранения гомологии последовательности. Здесь показано, как запустить анализ Virochip для анализа клинических образцов на наличие известных и неизвестных вирусов.
Abstract
Диагноз вирусного причины многих инфекционных заболеваний, трудно из-за присущего разнообразию последовательности вирусов, а также текущие появление новых вирусных патогенов, таких как атипичная пневмония коронавирус и 2009 пандемии вирус гриппа H1N1, которые не обнаруживаются традиционными методами. Для решения этих задач, мы уже разработаны и утверждены пан-вирусных микрочипов платформу под названием Virochip со способностью обнаруживать все известные вирусы, а также новые варианты на основе сохранения гомологии последовательности 1. Использование Virochip, мы определили весь спектр вирусов связано с респираторными инфекциями, в том числе случаи необъяснимых критических заболеваний у госпитализированных пациентов, при этом чувствительность равна или превосходит обычные клинические 2-5 тестирования. Virochip также используется для выявления новых вирусов, в том числе ОРВИ коронавирус 6,7, роман клады риновирусов 5, XMRV (ретровирус, связанных с раком предстательной железы) 8, птичий bornavirus (причина изнуряющая болезнь у попугаев) 9, и роман cardiovirus у детей с респираторными и желудочно-кишечные заболевания 10. Текущая версия Virochip была портирована на платформу Agilent микрочипов и состоит из ~ 36000 зондов производным от более чем ~ 1500 вирусов в GenBank по состоянию на декабрь 2009 года. Здесь мы показываем, этапы обработки анализа Virochip от начала до конца (~ 24 час времени оборота), в том числе образцы нуклеиновых кислот, ПЦР-амплификации с использованием случайных праймеров, флуоресцентный краситель регистрации, и микрочипов гибридизации, сканирование и анализ.
Protocol
Шаги анализа Virochip включают (1) нуклеиновых кислот из клинических образцов, (2) обратную транскрипцию добываемого РНК и 2-го цепи кДНК синтеза, (3) ПЦР-амплификации кДНК случайно загрунтовать, (3) Cy3 флуоресцентных красителей включение , (4) гибридизации меченого материала Virochip микрочипов, и (5) сканирование и анализ (рис. 1). Протокол показано ниже продемонстрирует использование анализа Virochip на образце назальный мазок из ребенка с гриппоподобным заболеванием.
Грунтовка Последовательности
Грунтовка 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 '
Грунтовка В 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
1. Нуклеиновых кислот
- Выделения нуклеиновых кислот из клинических образцов должны быть выполнены в соответствии Уровень биологической безопасности 2 (BSL-2) или выше условий, так как эти образцы являются потенциально заразными.
- Образец назальный мазок транспортируется в вирусной среде холдинга. Алиготе 200 мкл образца в 1,5 мл трубки микроцентрифужных Эппендорф.
- Дополнительно: пройти пробы через фильтр 0,22 мкм (для очистки вирусных частиц)
- Дополнительно: предварительной обработки образца с ДНКазы (деградировать ДНК хост геномных и очистить для защищенных, encapsidated вирусной нуклеиновой кислоты) с использованием Turbo ДНКазы комплект (Амбион) в соответствии с инструкциями производителя
- Извлечение примера с использованием Zymo ZR Вирусная РНК Добыча Kit или Qiagen Ultrasens Virus Kit в соответствии с инструкциями производителя.
2. Обратная транскрипция и 2-й-цепи кДНК синтеза ("Круглый")
- Добавить 1 мкл 40 пмоль / мкл праймера до 4 мкл извлеченные РНК. Нагреть до 65 ° С в течение 5 мин в амплификаторе (например GeneAmp PCR System 9700), а затем дать остыть при комнатной температуре х 5 мин.
- Добавьте 5 мкл мастер смесь, состоящую из 2 мкл 5X буфера РТ, 1 мкл 12,5 мМ дНТФ, 1 мкл воды, 0,5 мкл 0,1 М ДТТ, и 0,5 мкл SSIII РТ (Invitrogen). Инкубировать при 42 ° С х 60 минут.
- В программируемых амплификаторе, тепла до 94 ° С х 2 мин (для отмены обратной реакции транскриптазы), охладить до 10 ° С, пульс центрифуге, а затем добавить 5 мкл смеси Sequenase, состоящий из 1 мкл 5X буфера Sequenase, 3,8 мкл воды, и 0,15 мкл Sequenase (USB Corporation). Для 2-го синтеза нити, нарастить от 10 ° C до 37 ° С в течение 8 мин, проведение 8 мин, затем тепло до 94 ° С х 2 мин (для инактивации Sequenase) и охладить до 10 ° C (удержание).
- Дополнительно: Rd образец кДНК можно хранить в этом месте при температуре -20 ° C.
3. ПЦР-амплификации кДНК Случайно грунтовкой ("Круглый B")
- Добавьте 5 мкл Rd образца 45 мкл мастер смесь, состоящую из 5 мкл 10х буфера ПЦР, 1 мкл 12,5 мМ дНТФ, 1 мкл 100 пмоль / мкл праймера B, 1 мкл KlenTaq Л.А. (Sigma), и 37 мкл воды.
- Выполнить ПЦР протокола следующим образом: 94 ° C, 2 мин → (25 циклов 94 ° С, 30 сек / 50 ° С, 45 сек / 72 ° С, 1 мин) → 72 ° С, 5 мин → 10 ° C ( удерживайте)
- Проверка образца Rd В на 1,5% агарозном гель-электрофореза. Мазок из примерно 200 - 1000 б.п. следует визуализировать (рис. 2А)
4. Cy3 флуоресцентная краска регистрации
- Дополнительно: еще один образец может быть помечены флуоресцентным красителем Cy5 и гибридизовали к тому же микрочипов.
- Чтобы включить аа-дНТФ, добавляют 5 мкл образца Rd B до 45 мкл мастер смесь, состоящую из 5 мкл 10х буфера ПЦР, 1 мкл 12,5 мМ аа-дНТФ (Invitrogen), 1 мкл 100 пмоль / мкл праймера B, 1, 1 мкл KlenTaq Л.А. (Sigma), и 37 мкл воды. Выполнить ПЦР протокола следующим образом: 94 ° C, 2 мин → (15 циклов 94 ° С, 30 сек / 50 ° С, 45 сек / 72 ° С, 1 мин) → 72 ° С, 5 мин → 10 ° C ( удерживайте)
- Чистый образец Rd C с ДНК Чистота и концентратор-5 Kit (Zymo исследований) в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 10 мкл.
- Добавить 1 мкл 1М бикарбоната (Sigma) и 1 мкл Cy5 (GE Healthcare) к образцу Rd C.
- Инкубируйте х 1 час в темноте.
- Чистая Cy3 меченных образца с ДНК Чистота и концентратор-5 Kit (Zymo исследований) в соответствии с инструкциями производителя. Элюции в 12 мкл.
5. Гибридизация с Virochip Microarray
- Дополнительно: использование 1,5 мкл кДНК и проверить концентрацию и количество красителя зарегистрирована Nanodrop спектрофотометр (для нормализации образцов)
- В трубке полосу ПЦР добавить 1 мкл 25X буфера фрагментации, 5 мкл 5X блокирующего буфера, 9,5 мкл (или количество нормализовать) из Cy3 меченных образца, и воду, чтобы общий объем 25 мкл (Agilent)
- Добавьте 25 мкл 2X гибридизации GEx буфера (Agilent). Спином вниз кратко, чтобы удалить пузырьки.
- Нагрузка 40 мкл образца на слайд прокладкой.
- Место Agilent отпечатанных Virochip массив (Университет Californi, Сан-Франциско / Agilent) (сторона с маркировкой "Agilent" вниз) в верхней части слайда прокладку и закрепите винтом плотно.
- Гибридизации на ночь в 65 ° С духовке, настройки скорости в 10 оборотов в минуту.
- Для мытья массивы, разогрейте буфера 2 (Agilent) до 37 ° C. Возьмите, кроме прокладки слайд / массив подводных сэндвич в буфере 1 (Agilent). Стирать в буфер 1 х 1 мин. Стирать в разогретой буфера 2 х 1 мин. Медленно снимите слайд из буфера 2, соблюдая осторожность, чтобы избежать пузырей (используется для kimwipe фитиль от излишней влаги будьте осторожны, чтобы избежать непосредственно трогательные активной стороне массива)
- Место слайд в слайд-держатель и вставить в массив сканера.
6. Virochip Сканирование и анализ
- Сканирование Cy3 меченных массива в 5 мкм и 2 мкм в соответствии со стандартом протокола сканирования инструмента (рис. 2В).
- Анализ Virochip микрочипов при визуальном осмотре, кластерный анализ, или автоматизированный анализ Virochip программы, E-Предсказать 11. По каждому из этих трех методов, вирус гриппа легко обнаружить в образце назальный мазок (от ребенка с гриппоподобным заболеванием) (рис. 2C)
7. Представитель Результаты:
Когда протокол все сделано правильно, мазок должен быть замечен на электрофореза в агарозном геле после шагом Rd B (рис. 2А). Virochip микрочипов на платформе Agilent будет трудно проанализировать визуально (рис. 2Б), но если вирус присутствует оно должно быть легко определить при визуальном осмотре, кластерный анализ, и / или E-Predict (рис. 1в). Образцы могут подсыпали измеряемых величин нуклеиновой кислоты из известных вирусов (например, вирус табачной мозаики; MS2 бактериофаг) в качестве положительного контроля для анализа.
Рисунок 1. Схема Virochip микрочипов обработки и анализа. Извлеченные нуклеиновых кислот из клинических образцов случайным усиливается, меченные флуоресцентными красителями и гибридизации с Virochip микрочипов. Microarrays сканируются на 2 мкм разрешение и проанализированы с помощью различных вычислительных средств, в том числе E-Predict.
Рисунок 2. Этапы анализа Virochip После усиления случайных ПЦР, мазок 200 -. 1000 б.п. могут быть визуализированы помощью гель-электрофореза (A) (B) Три Virochip микрочипов из 8 массивов / стекло слайде показано, с малой области. одного микрочипов раздутых на вставке в нижнем правом углу. (С) Автоматизированная микрочипов вирусного анализа с использованием E-Предсказать выявления наличия вируса гриппа А в клинической пробе. Высокий показатель сходства (S = 0,55) соответствует р-значение, близкое к нулю, что делает это чрезвычайно важным предсказанием.
Discussion
Virochip протокол, как описано здесь является сложным и требует тщательного и квалифицированного исследования техник. Правильная концентрация реагента и условий для ПЦР, маркировки и гибридизации являются критическими. Протокол Virochip могут быть легко изменены, чтобы приспособить анализа больные ткани с использованием метода извлечения ткани, такие как TRIzol (Invitrogen) для выделения нуклеиновых кислот. Зонды могут быть добавлены или удалены, сколько необходимо для получения желаемого спектра и широта охвата, например, зонды для обнаружения невирусные целей, таких как бактерии и грибки могут быть разработаны и добавил, "на лету". Некоторые приложения анализа Virochip в настоящее время в стадии разработки включают широкий спектр вирусных диагностики в клинической лаборатории, расследования вспышек, чистота скрининга лекарственных препаратов и вакцин, и новые вирусные открытия возбудителя.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим David Wang, Анатолий Urisman, Эми Kistler, Кель Фишер, Патрик Танг, и Александр Greninger для первоначальной разработки и оптимизации протокола Virochip. Эта работа проводится при поддержке гранта NIH K08 и Abbott Discovery Award (в КС) и Медицинского института Говарда Хьюза (для JLD).
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
