Summary
Hoe niches en stamcellen vorm tijdens de ontwikkeling is een belangrijke vraag met praktische implicaties. In het
Abstract
Veel organen zijn afhankelijk van stamcellen voor hun ontwikkeling tijdens de embryogenese en voor onderhoud of reparatie tijdens het volwassen leven. Te begrijpen hoe stamcellen vormen, en hoe ze omgaan met hun omgeving is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van de ontwikkeling, homeostase en ziekte. De eierstok van de fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft gediend als een invloedrijk model voor de interactie van kiembaan stamcellen (GSCs) met hun somatische ondersteuning cellen (niche) 1, 2. De bekende locatie van de niche en de GSCs, gekoppeld aan de mogelijkheid om genetisch manipuleren, heeft het mogelijk onderzoekers een groot aantal interacties tussen stamcellen en hun niches 3-12 toe te lichten.
Ondanks de overvloed aan informatie over de mechanismen die de SGR onderhoud en differentiatie, relatief weinig bekend over hoe GSCs en hun somatische niches vormen tijdens de ontwikkeling. Ongeveer 18 somatische niches, waarvan cellulaire componenten omvatten terminal filament en cap cellen (figuur 1), vormen tijdens het derde larvale instar 13-17. GSCs afkomstig uit primordiale kiemcellen (PGC). PGC's verspreiden zich in de vroege larvale stadia, maar na de vorming van de niche een subgroep van PGC's wordt GSCs 7, 16, 18, 19. Samen vormen de somatische niche cellen en de GSCs maken een functionele eenheid dat eieren produceert gedurende de hele levensduur van het organisme.
Veel vragen met betrekking tot de vorming van de SGR-eenheid blijven onbeantwoord. Processen, zoals de coördinatie tussen de voorloper cellen voor niches en stamcellen voorlopers, of het genereren van asymmetrie in PGC's naarmate ze GSCs, kan het beste worden bestudeerd in de larve. Echter, een methodische studie van de larvale ontwikkeling ovarium is fysiek uitdagend. Ten eerste larvale eierstokken zijn klein. Zelfs op late larvale stadia zij slechts 100 urn over te brengen. Daarnaast, de eierstokken zijn transparant en zijn ingebed in een wit dik lichaam. Hier beschrijven we een stap-voor-stap protocol voor het isoleren van de eierstokken van de late derde instar (LL3) Drosophila larven, gevolgd door kleuring met fluorescerende antilichamen. Wij bieden een aantal technische oplossingen voor problemen zoals het lokaliseren van de eierstokken, vlekken en het wassen van weefsels die niet zinken, en ervoor te zorgen dat de antilichamen doordringen in het weefsel. Dit protocol kan worden toegepast op eerdere larvale stadia en larven testes ook.
Protocol
1. Eileg
- Vijf dagen vóór versnijding: laat de bevruchte vrouwtjes eieren voor 2-4 uren lag op vers voedsel aangevuld met gist. Om gesynchroniseerd en goed ontwikkelde larven, is het belangrijk niet te hebben overvolle gekweekt (ongeveer 30 eieren / 25mm flacon). Gewoonlijk worden 7-16 vrouwtjes gebruikt per flacon, afhankelijk van hoe goed ze lagen.
2. Het selecteren van larven
- Bereid een 9-goed glas ontleden schaal gevuld met medium Ringer's (128mm NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mm CaCl 2, 4mm MgCl 2, 35.5mM Sucrose, 5mM Hepes pH 6,9).
- Bereid cel filters in een zes-well plaat met Ringer's medium en plaats deze op ijs. Als alternatief gebruiken wij speciaal gemaakt mallen voorzien van een nylon mesh.
- Pick getimed larven van de flacon muren met behulp van fijne biologische pincet (tangen) en plaats ze in met de beltoon van ontleden schotel.
- Overdracht een vrouwelijke larve naar een schone goed. We onderscheiden vrouwtjes van mannetjes door hun geslachtsklieren. Man testes zijn gemakkelijk te herkennen als grote ovalen duidelijk ingebed in het achterste derde deel van het vet lichaam. Vrouwelijke eierstokken, gelegen aan hetzelfde deel van het vet het lichaam, kunnen worden geïdentificeerd als een veel kleinere, heldere, ronde bollen.
3. Dissectie van de larve
- Houd de larve naar beneden juist achter de hersenen met een tang en verwijder het hoofd met een tweede pincet.
- Plaats de resterende achterste deel aan de dorsale zijde, met de luchtpijp naar beneden.
- Houd de larve van de posterieure siphonen met een pincet en duw het naar binnen langzaam, terwijl het andere paar is schuiven de cuticula posterior tot ongeveer de helft van de larven dik lichaam ontstaat.
- Houd het achterste einde en gebruik de andere pincet om los te houden van de cuticula. Voorzichtig en langzaam weg te trekken het achterste uiteinde, zodat de cuticula en de bijgevoegde darm schuift door het gat. Aan het eind van dit proces, moet het vet lichaam volledig worden gescheiden van de darm en de cuticula. Koppel de darm uit het voorste deel van het vet lichaam. Om vlekken en montage eenvoudiger, is het belangrijk dat het vet lichaam intact blijft.
- Natte een weiland pipet grondig met medium Ringer's, bij voorkeur uit een putje met ontleed larven. Dit helpt de vacht van de pipet en voorkomt dat het vet lichaam vast te houden. Gebruik het weiland pipet om het vet te zetten in het lichaam medium de ijskoude Ringer's in de cel zeef.
4. Fixatie en kleuring
Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, met uitzondering van de incubatie met eerste antilichaam, bij 4 ° C.
- Incubeer het vet lichaam in 5% formaldehyde in medium Ringer's. gedurende 20 minuten onder zacht schudden.
- Was gedurende 5 minuten met 1% PBT (1% Triton x-100 in PBS). Herhaal deze stap voor 10 minuten en een derde keer voor 45 minuten. 1% Triton X-100 is vereist om de larvale eierstok perforeren en antilichamen om het door te laten dringen.
- Blok met 0,3% PBTB (0,3% Triton x-100 en 1% BSA in PBS) gedurende 1 uur onder zacht schudden
- Incubeer met de gewenste 1 e antilichaam verdund in 0,3% PBTB s nachts bij 4 ° C onder zacht schudden. Deze stap wordt meestal uitgevoerd in 0,2 ml buizen op een roller.
- Transfer terug dik lichaam naar cel zeven.
- Was drie keer, 30 minuten elk, met 0,3% PBTB onder zacht schudden.
- Blok met 0,3% PBTB aangevuld met 5% normaal serum ezel gedurende 1 uur onder zacht schudden.
- Incubeer met een passende secundair antilichaam verdund (volgens de fabrikant de specificaties) in de blockingbuffer (0,3% PBTB aangevuld met 5% normaal serum ezel in 0,3% PBT) gedurende 2 uur onder zacht schudden. Als het antilichaam is fluorescent, Incubeer in het donker vanaf dit punt verder. Deze stap wordt meestal uitgevoerd in 0,2 ml buizen op een roller.
- Was drie keer voor 30 minuten met elk 0,3% PBT onder zacht schudden.
5. Montage
- Breng de dikke lichaam om een schoon eppendorfbuisje. Heel voorzichtig weg verwijder alle vloeistoffen en direct te bedekken met Vectashield montage media. We maken gebruik van vectashield routinematig omdat het niet hard, terwijl de eierstokken worden afgescheiden van het vet lichaam.
Monsters kunnen worden opgeslagen in montage media bij 4 ° C gedurende maximaal een week. - Snij het einde van een pipet en gebruik deze om het vet er zorgvuldig met minimale volume van de montage van de media (ongeveer 30 pl voor een 30mm cover-slip) op een objectglaasje.
- Gebruik twee vernikkeld pin houders, holding 0,1 mm diameter pennen te spreiden het vet lichaam. De eierstokken bevinden zich aan de achterste derde deel van het vet lichaam. Het vet lichaam dat hen omringt wordt meestal de vorm van een 'bloem'. Dit helpt de locatie van de eierstokken. Ontleden de 'bloemen' van de rest van het vet het lichaam en gooi de laatste.
- Verwijder het vet lichaam SurroINANCIERING de gonaden door het oversteken van de twee pennen voorzichtig omheen. Plaats de geïsoleerde gonaden op de dia uit de buurt van het vet lichaam residu.
- Dek af met een dekglas en afdichting met nagellak.
- Visualiseer direct met behulp van een confocale microscoop. Monsters kunnen worden bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal drie weken.
6. Representatieve resultaten
We hebben de boven-protocol tot de oprichting van verschillende cellijnen binnen de somatische eierstok, waaronder GSCs en hun somatische niches te volgen. Hiervoor gebruiken we specifieke antilichamen en markers om onderscheid te maken tussen de verschillende celtypes in de ontwikkelingslanden gonade. Hier laten we een voorbeeld van twee LL3 eierstokken gekleurd met verschillende combinaties van antilichamen. Figuur 1A hoogtepunten terminal filament en pet cellen (groen), die samen de somatische cellen van de niche. Figuur 1B, toont de vermengde cellen (IC's, magenta), die rechtstreeks contact opnemen met kiemcellen (blauw).
Figuur 1. LL3 eierstokken. (A) monoklonaal antilichaam 1B1 (magenta) schetst somatische cellen en vlekken van de fusome, een intracellulaire organel binnen PGC (pijlen). De enhancer trap hh-lacZ (anti β-galactosidase, groen) wordt uitgedrukt in terminal filamenten. Aan de voet van de gloeidraad somatische cellen dop (pijlpunten), kunnen worden waargenomen. (B) 1B1 antilichaam (groen) schetst alle somatische cellen in de eierstok. Anti-Vasa (blauw) labels alle PGC's. PGC's direct contact op met de vermengde cellen (IC's, anti-file, magenta). Bar (voor A en B) is 20 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze video toont een isolement en kleuringsprotocol van de late derde instar larven eierstokken. Voor het uitvoeren van dit protocol routinematig en betrouwbaar, dient aandacht te worden besteed aan de volgende punten:
- Voor gesynchroniseerd en goed ontwikkelde larven, moet overbevolking worden vermeden.
- Om te voorkomen dat het verlies van de kleine doorzichtige eierstokken, zorg ervoor dat ontleden het vet lichaam intact. Dit zal ook helpen bij het lokaliseren van de eierstokken in de montage stadium, met name bij de montage van jongere (tweede of het begin van de derde instar) eierstokken.
- Met het oog op een groot aantal monsters verwerken in een tijd, gebruik van mobiele zeven of andere constructies.
- Zorg ervoor dat de monsters niet droog.
- We maken gebruik van een goede stereo-microscoop voor de montage podium. Met behulp van een doorvallend licht-basis met een eenzijdige donker ingediend kunnen we voorwaarden vinden waar het contrast tussen de doorschijnende eierstok en de witte vet lichaam maakt het gemakkelijk te vinden en manipuleren van de eierstokken.
- Na de montage, niet herhaaldelijk op temperatuur veranderingen, dit zorgt ervoor dat dissociatie van de antilichamen en vermindert de kwaliteit van de kleuring.
Dit protocol kan worden toegepast op eerdere larvale stadia, maar het vet lichaam is meer kwetsbaar en taaier, waardoor het iets ingewikkelder. Het is het beste om te oefenen dissecties van late derde instar de eerste plaats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
IM wordt ondersteund door de Marie Curie re-integratie toe te kennen. Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Fonds Grant niet. 1146-1108, door de Helen en Martin Kimmel Instituut voor Stem Cell Research aan het Weizmann Institute of Science en de Leir Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
