Summary
Как ниши и стволовые клетки образуются во время развития является важным вопросом практические последствия. В
Abstract
Многие органы зависят от стволовых клеток для их развития в период эмбриогенеза и для технического обслуживания или ремонта в течение взрослой жизни. Понимание того, как стволовые клетки образуются, и как они взаимодействуют с окружающей их средой Поэтому крайне важно для понимания развития, гомеостаза и болезни. Яичник плодовой мушки дрозофилы служил влиятельной моделью для взаимодействия зародышевой линии стволовых клеток (GSCs) с их соматических клетках поддержки (ниши) 1, 2. Известно расположение нишу и GSCs, в сочетании со способностью к генетически манипулировать ими, позволило исследователям выяснить различных взаимодействий между стволовыми клетками и их ниши 3-12.
Несмотря на огромное количество информации о механизмах управления GSC обслуживания и дифференциацию, относительно мало известно о том, как GSCs и их соматической форме ниши в процессе разработки. Около 18 соматических ниши, которых клеточные компоненты включают нити терминала и крышка клетки (рис. 1), форму в течение третьего личиночного возраста 13-17. GSCs происходят из первичных половых клеток (PGCs). PGCs размножаться на ранних личиночных стадиях, но после образования нишу подгруппе PGCs становится GSCs 7, 16, 18, 19. Вместе нишу соматических клеток и GSCs сделать функциональный блок, который производит яйца в течение всей жизни организма.
Многие вопросы, касающиеся образования GSC единицы остаются без ответа. Такие процессы, как координация между клеток-предшественников для ниш и прекурсоров стволовых клеток, или поколение асимметрии в PGCs, поскольку они становятся GSCs, наилучшим образом может быть изучен в личинку. Тем не менее, методические исследования личиночного развития яичников физически сложно. Во-первых, личиночной яичников малы. Даже в конце личиночной стадии они только 100 мкм в диаметре. Кроме того, яичники являются прозрачными и встроены в белый жир тела. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол для выделения яичниками с конца третьего возраста (LL3) Drosophila личинки, после окрашивания с флуоресцентными антителами. Мы предлагаем некоторые технические решения проблем, таких как размещение яичников, окрашивания и стирки тканей, которые не тонут, и убедившись, что антитела проникают в ткани. Этот протокол может быть применен к ранее личиночной стадии и личиночной яички, а также.
Protocol
1. Яйцо укладки
- За пять дней до вскрытия: разрешить повязана самок откладывают яйца в течение 2-4 часов на свежие продукты питания дополнена с дрожжами. Чтобы получить синхронизированы и хорошо развитые личинки, важно не иметь переполненных культурный (около 30 яиц / 25mm флакон). Как правило, 7-16 женщин используются на флакон, в зависимости от того, насколько хорошо они лежали.
2. Выбор личинки
- Подготовка 9-а стекло рассекает блюдо заполнено средой Рингера (128 мм NaCl, 2 мМ KCl, CaCl 2 1,8 мм, 4 мм MgCl 2, 35.5mM сахарозы, 5 мМ рН Hepes 6.9).
- Подготовка ячейки сита в шесть-луночного планшета среде, содержащей Рингера и поместите его на лед. Кроме того, мы используем специально изготовленные формы оснащены нейлоновой сетки.
- Выберите приурочен личинок из флакона стен с использованием тонких биологических пинцет (щипцы) и поместите их в сдерживании рассекает блюдо Рингера.
- Передача женщин личинки к чистой хорошо. Мы различаем самок от самцов по их половых желез. Мужские яички легко идентифицируются как большие ясно овалы встроенный в задней трети жира в организме. Женские яичники, расположенный в той же части жира в организме, могут быть идентифицированы как гораздо меньше, ясные, круглые сферах.
3. Препарирование личинка
- Держите личинки вниз только сзади мозга щипцами и удалить голову вторая пара щипцов.
- Положите оставшиеся задней части на спинной стороне, с трахее вниз.
- Держите личинки задних дыхальца с одной парой щипцов и толкать ее внутрь медленно, в то время как другая пара скользит кутикулу назад, пока примерно половина тела личинки жира всплывает.
- Крепко держите заднему концу и использовать другую пару щипцов, чтобы свободно провести кутикулы. Аккуратно и медленно тронуться с места задним концом так, что кутикула и прилагается слайд кишечника через щель. В конце этого процесса, жира должно быть полностью отделено от кишечника и кутикулы. Отключите кишечник от передней части жира в организме. Для окрашивания и монтажа проще, важно, чтобы жир остался нетронутым.
- Влажные пастбище пипеткой тщательно со средним Рингера, предпочтительно также содержащие расчлененный личинок. Это помогает пальто пипетки и предотвращает жира от прилипания к ним. Использование пастбищ пипетки для передачи жира в организме в среду Ringer ледяной в ячейки фильтра.
4. Фиксация и Окрашивание
Все действия выполняются при комнатной температуре, за исключением первой инкубации с антителом, при 4 ° C.
- Инкубируйте жира в 5% формальдегида в среде Рингера. в течение 20 минут с нежным агитации.
- Промыть в течение 5 минут с 1% PBT (1% Тритон Х-100 в PBS). Повторите это действие в течение 10 минут и третий раз в течение 45 минут. 1% Тритон Х-100 требуется для перфорации личиночной яичника и позволяют антител к проникнуть в нее.
- Блок с 0,3% PBTB (0,3% Тритон Х-100 и 1% BSA в PBS) в течение 1 часа с нежным агитации
- Инкубируйте с желаемым 1-й антител разводят в 0,3% PBTB в течение ночи при 4 ° С с нежным агитации. Этот шаг обычно выполняется в 0,2 мл трубок на роликах.
- Передача жира тело обратно в камеру фильтры.
- Промыть 3 раза, 30 минут каждый, с 0,3% PBTB с нежным агитации.
- Блок с 0,3% PBTB с добавлением 5% нормальных осла сыворотке в течение 1 часа с нежным агитации.
- Инкубируйте с соответствующими вторичными антителами разводненная (в соответствии со спецификацией производителя) в блокирующий раствор (0,3% PBTB с добавлением 5% нормальной сыворотки осла в 0,3% PBT) в течение 2 часов с нежным агитации. Если антитела люминесцентные, инкубировать в темноте с этого момента. Этот шаг обычно выполняется в 0,2 мл трубок на роликах.
- Промыть 3 раза по 30 минут каждая с 0,3% PBT с нежным агитации.
5. Монтаж
- Передача жира в организме в чистую пробирку Эппендорф. Очень тщательно удалите все жидкости подальше и сразу же накрыть Vectashield монтажа средств массовой информации. Мы используем vectashield регулярно, поскольку он не затвердевает в то время как яичники, отделившись от жира в организме.
Образцы могут храниться при монтаже средств массовой информации при 4 ° С не более недели. - Отрежьте конец кончиком пипетки и использовать его для передачи тщательно жира в организме с минимальным объемом монтажных средств массовой информации (около 30 мкл для 30мм покровное стекло) на предметное стекло.
- Используйте две никелированные держателей контактный, держа 0,1 мм в диаметре контакты распространяться жира в организме. Яичники расположены в задней трети жира в организме. Жира в организме, что их окружает, как правило, форму 'цветок'. Это помогает определить расположение яичников. Рассеките из "цветы" от остального жира в организме и выбросить последнего.
- Удаление жира surro телаunding гонады путем скрещивания два контакта тщательно вокруг него. Место изолированных гонады на слайде от жира остаток тела.
- Накрыть крышкой и скольжения печать с лаком для ногтей.
- Визуализируйте непосредственно с помощью конфокальной микроскопии. Образцы могут храниться при температуре 4 ° С на срок до трех недель.
6. Представитель Результаты
Мы использовали выше протокол последовать создание нескольких клеточных поколений в яичнике соматические, в том числе GSCs и их соматического ниши. Для этой цели мы используем специфические антитела и маркеры, чтобы различать различные типы клеток в развивающемся гонады. Здесь мы показываем пример двух LL3 яичников окрашивали различные комбинации антител. Рисунок 1А подчеркивает нити терминала и крышка клетки (зеленый), которые в совокупности образуют соматических клеток нишу. Рис 1B, показывает, приобщенных клеток (ИС, пурпурный), которые напрямую связаться половых клеток (синий).
Рисунок 1. LL3 яичников. (А) моноклональное антитело 1В1 (пурпурный) очертания соматических клеток и пятна fusome, внутриклеточных органелл внутри PGCs (стрелки). Ловушка усилитель чч-LacZ (анти β-галактозидазы, зеленый) выражается в терминале нитей. В основе нити соматических клеток колпачок (стрелки) можно наблюдать. (Б) 1В1 антитело (зеленый) очертания всех соматических клеток в яичнике. Анти-Васа (синий) этикетки всех PGCs. PGCs обратиться непосредственно приобщены клеток (ИС, анти-пробке, пурпурный). Бар (для А и В) составляет 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это видео демонстрирует изоляции и окраске протокол конце третьего возраста яичники личиночной. Для выполнения этого протокола в плановом порядке и надежно, следует обратить внимание на следующие моменты:
- Для синхронизации и хорошо развитые личинки, за скученности следует избегать.
- Во избежание потери небольшие полупрозрачные яичников, удостоверьтесь, чтобы рассекать жира в организме без изменений. Это также поможет в поиске яичника на стадии монтажа, в частности при монтаже младшего (второго или начале третьего возраста) яичников.
- Для того, чтобы работать с различными образцами в то время, использование сотового фильтров или других приспособлений.
- Убедитесь, что образцы никогда не высохнуть.
- Мы используем хороший стерео-микроскоп для монтажа сцены. Использование проходящем свете базы с односторонним темно подал мы можем найти условия, когда контраст между полупрозрачными яичника и белого жира в организме позволяет с легкостью находить и манипулировать яичников.
- После монтажа, избежать повторных изменений температуры, это приводит к диссоциации антител и снижает качество окрашивания.
Этот протокол может быть применен к ранее личиночной стадии, но жира является более хрупким и липким, что делает ее несколько сложнее. Лучше всего заниматься вскрытия конце третьего возраста в первую очередь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
И. М. поддерживается Мари Кюри реинтеграции гранта. Эта работа была поддержана Израиль науке нет фонда Грант. 1146/08, по Хелен и Мартина Киммел Институт Исследования стволовых клеток в Институт Вейцмана и Лир благотворительный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | JT Baker | ||
| Kcl | Merck & Co., Inc. | ||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | ||
| MgCl2 | Merck & Co., Inc. | ||
| Sucrose | JT Baker | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | ||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | |
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Nickel plated pin holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | Corning | 7220-85 | |
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica Microsystems | ||
| 6 well plates | Costar | 3516 | |
| Slides | Menzel-Glaser | 798 | |
| Cover slips | Corning | 2940-223 | |
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | |
| Cell strainer | Falcon BD | FAL352350 | |
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | ||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | ||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | ||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
References
- Fuller, M. T., Spradling, A. C. Male and female Drosophila germline stem cells: two versions of immortality. Science. 316, 402-404 (2007).
- Li, L., Xie, T. Stem cell niche: structure and function. Annual review of cell and developmental biology. 21, 605-631 (2005).
- Chen, D., McKearin, D. Gene circuitry controlling a stem cell niche. Curr Biol. 15, 179-184 (2005).
- Kai, T., Spradling, A. An empty Drosophila stem cell niche reactivates the proliferation of ectopic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 4633-4638 (2003).
- Kai, T., Spradling, A. Differentiating germ cells can revert into functional stem cells in Drosophila melanogaster ovaries. Nature. 428, 564-569 (2004).
- Lopez-Onieva, L., Fernandez-Minan, A., Gonzalez-Reyes, A. Jak/Stat signalling in niche support cells regulates dpp transcription to control germline stem cell maintenance in the Drosophila ovary. Development. 135, 533-540 (2008).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Tazuke, S. I. A germline-specific gap junction protein required for survival of differentiating early germ cells. Development. 129, 2529-2539 (2002).
- Xie, T., Spradling, A. C. decapentaplegic is essential for the maintenance and division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Cell. 94, 251-260 (1998).
- Xie, T., Spradling, A. C. A niche maintaining germ line stem cells in the Drosophila ovary. Science. , 290-328 (2000).
- Guo, Z., Wang, Z. The glypican Dally is required in the niche for the maintenance of germline stem cells and short-range BMP signaling in the Drosophila ovary. Development. 136, 3627-3635 (2009).
- Wang, X., Harris, R. E., Bayston, L. J., Ashe, H. L. Type IV collagens regulate BMP signalling in Drosophila. Nature. 455, 72-77 (2008).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental biology. 170, 127-135 (1995).
- Song, X., Call, G. B., Kirilly, D., Xie, T. Notch signaling controls germline stem cell niche formation in the Drosophila ovary. 134, 1071-1080 (2007).
- Zhu, C. H., Xie, T. Clonal expansion of ovarian germline stem cells during niche formation in Drosophila. Development. 130, 2579-2588 (2003).
- Ward, E. J. Stem cells signal to the niche through the Notch pathway in the Drosophila ovary. Curr Biol. 16, 2352-2358 (2006).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Repression of primordial germ cell differentiation parallels germ line stem cell maintenance. Curr Biol. 14, 981-986 (2004).
- Gilboa, L., Lehmann, R. Soma-germline interactions coordinate homeostasis and growth in the Drosophila gonad. Nature. 443, 97-100 (2006).
