Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Высокоэффективные трансдукция клеток рака печени с помощью рекомбинантной адено-ассоциированные вирус серотипа 3 Вектора

Published: March 22, 2011 doi: 10.3791/2538
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Cellular and Molecular Therapy, University of Florida

Summary

В этой статье мы опишем идентификации адено-связанный вирус серотипа 3 (AAV3), как наиболее эффективный вектор для направления человеческих клеток рака печени.

Abstract

Рекомбинантные векторы на основе непатогенных человека парвовирус, адено-ассоциированные вирусы 2 (AAV2) были разработаны и используются в настоящее время в ряде генной терапии клинических испытаний. В последнее время ряд дополнительных серотипов AAV также были изолированы, которые были показаны на выставке селективного ткани тропизм в различных мелких и крупных животных моделях 1. Из 10 наиболее часто используемых серотипов AAV, AAV3 на сегодняшний день является наименее эффективным в трансдукции клеток и тканей в лабораторных, так и в естественных условиях.

Однако, на наш недавно опубликованных исследований, мы зафиксировали, что AAV3 векторов преобразовывать человека рак печени - злокачественная опухоль печени (HB) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) - клеточные линии, очень эффективно, потому что AAV3 использует человеческие гепатоцитов рецептор фактора роста, как сотовые корецептором для переплета и вступление в этих клетках 2,3.

В этой статье мы опишем шаги, необходимые для достижения высокой эффективности трансдукции клеток человека рак печени с помощью рекомбинантной AAV3 переносчиков гена-репортера. Использование рекомбинантных AAV3 переносчиков терапевтических генов в конечном итоге может привести к потенциальной генной терапии рака печени у человека.

Protocol

1. Упаковка рекомбинантный адено-связанный вирус серотипа 3 (rAAV3) Векторы

  1. К веб-сайте: " http://www.geguchadze.com/calc "и рассчитать количество ДНК.
  2. Предварительно смесь плазмид pHelper (аденовирус помощника), pACG2c3 (AAV помощник) и pdsAAV-CB-EGFP (rAAV вектор) в среде без FBS и антибиотики. Всего объем должен быть 8750 мкл в течение десяти 15 см 2 пластины.
  3. Добавить непосредственное 1250 мкл PEI (0,1% т / х, Polysciences, Cat # 23966, рН 4,5) в раствор ДНК в шаге 1.2. Vortex ДНК-PEI решение в течение нескольких секунд.
  4. Инкубируйте ДНК-PEI решение сформировать комплекс в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
  5. Добавить 1 мл ДНК-PEI раствора на 15 см 2 пластины.
  6. Удалить среду после 4 часов, заменяя со свежими 25 мл полной среды +10% FBS (С-DMEM).
  7. Семьдесят два часа после трансфекции, царапать клеток и влить в 250 мл коническую трубку центрифуги.
  8. Спиновые при 3000 оборотах в минуту, при 4 ° С в течение 10 мин. Слейте надосадочную жидкость.
  9. Повторное приостановить осадок клеток в 5 мл РБ TMS буфера (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 8,0). Переезд в новый 15 мл коническую трубку.
  10. Замораживание в сухой лед-этанол бане в течение 10 мин и оттаивания при температуре 37 ° С в течение 10 мин. Повторите три раза.
  11. Добавить 1 мкл 4,8 М MgCl 2 и 2 мкл Benzonase (25 ед / мкл, Novagen, Cat # 70664-3). Vortex и инкубировать в 37 ° C в течение 40 мин.
  12. Спином вниз при 4000 оборотах в минуту, при 4 ° С в течение 40 мин и собирают супернатант (топленое лизат).
  13. В 13 мл Быстрая печать центрифужную пробирку (Beckman, Cat # 342413), нагрузка iodixanol градиент (OptiPrep, Cat # 1114542) сверху вниз: 2 мл 15%, 2 мл 25%, 1,5 мл 40% и 1,5 мл 60% iodixanol. Нагрузка супернатант (шаг 1,12) в верхней части iodixanol градиента. Заполните трубы с буфером РБ TMS.
  14. Центрифуга на 75000 оборотов в минуту в течение 1 часа при 16 ° С с использованием Бекман 90Ti ротора.
  15. Соберите 40% iodixanol фракция, вставляя шприц на 40-60% границы.
  16. Передача 40% iodixanol долю в одном 50 мл коническую трубку и составляют до 40 мл буфером (20 мМ трис, 15 мМ NaCl, рН 8,5).
  17. Соберите фильтрации аппаратура с использованием HiTrap Q HP колонки (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Промыть колонку со следующими буфер: 25 мл буфера (20 мМ трис, 15 мМ NaCl, рН 8,5), 25 мл буфера В (10 мМ Tris, 500 мМ NaCl, рН 8,5), 50 мл буфера; 40 мл вируса образца в буфер, 50 мл буфера (20 мМ трис, 15 мМ NaCl, рН 8,5), 20 мл буфера C (20 мМ Трис, 175 мМ NaCl, рН 8,5);
  18. Сбор буфера С в 20 мл Аполлон Концентраторы (Орбитальная Biosciences). Центрифуга при 3000 оборотах в минуту, при 4 ° С в течение 10 мин.
  19. Откажитесь от проточных и добавить 20 мл охлажденной PBS и центрифуге при 3000 оборотах в минуту, при 4 ° С в течение 10 мин.
  20. Откажитесь от проточных и добавить 500 мкл охлажденного PBS. Вымойте векторов от от мембраны и передача обработанной силиконовым Эппендорф труб и хранить замороженные в небольших аликвот при температуре -80 ° C.

2. Определение rAAV3 Титры векторные

  1. Оттепель 10 мкл очищенного вируса в пробирку Эппендорфа на льду. Добавить 40 мкл DDH 2 O.
  2. Добавить 0,2 мкл Benzonase (25 ед / мкл, Novagen, Cat # 70664) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
  3. Принимать по 50 мкл плазмидной стандартный (0,2 нг / мкл) в другую пробирку Эппендорфа.
  4. Добавить 50 мкл 100 мМ NaOH в каждую пробирку и инкубировать в 65 ° С в течение 30 мин.
  5. Холод на льду сразу же, по крайней мере 5 мин.
  6. Вырезать передачи мембраны (Millipore, Cat # INYC00010) в соответствии с Био-Dot фильтровальной бумаги (Bio-Rad, Cat # 1620161). Промойте мембрану в 10х SSC с тремя фильтровальной бумаги в течение 20 мин.
  7. Установите слот пятно SF аппарата (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Подключение к термос и добавить 100 мкл 10x SSC, чтобы аппарат пятно слот.
  8. Добавить 100 мкл 20x SSC и 1 мкл красителя 6x загрузки каждого из образцов в шаге 2.5.
  9. Нагрузка 100 мкл каждого образца на мембрану в аппарате пятно слот.
  10. Добавьте еще 100 мкл 10x SSC в каждом из образцов.
  11. Повторите шаги 2,9 и 2,10, пока все образцы проходит через мембрану.
  12. Разобрать аппарат слотом пятно и удалить мембрану. Положите его в инспекторе компоновщика SL-1000 UV Crosslinker. Включите "Энергия", "Оптимальное Crosslink" (шоу 1200) и нажмите кнопку "Пуск".
  13. Отварите 1 мл спермы лосося (SS) ДНК (Фишер, Cat # NC9753983) в течение 5 мин. Холод на льду в течение не менее 5 мин.
  14. Подготовка предварительной гибридизации решение путем смешивания 27,5 мл DDH 2 O, 15 мл 20-кратного SSC, 5 мл раствора 50x Денхардта, 1,25 мл 20% SDS, 0,25 мл Поля и 1 мл SS ДНК из Шаг 2.13.
  15. Приостановить мембраны в 25 мл раствора предварительно гибридизации в цилиндра с верхушкой из стекла и инкубировать при температуре 65 ° С в гибридизации камере на ночь.
  16. Развести 50 нг шаблоны ДНК в 10 мкл DDH 2 O. Варить при 100 ° С в течение 5 мин и охладить на льду сразу же, по крайней мере 5 мин.
  17. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 1 мин. Добавьте 2 мкл 10 мМ 3 дНТФ (отсутствие дЦТФ), 2 мкл гексануклеотид Mix (Roche, Cat # 11277081001), 1 мкл Кленова (Roche, Cat # 11008404001) и 5 мкл α -32 P-дЦТФ. Инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин.
  18. Центрифуга G-50 столбцы (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) при 3000 оборотов в минуту в течение 2 мин. нагрузки зонда в Шаг 2,17 в столбце. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 2 мин и собирать проточные.
  19. Граф радиоактивности. Отварите зонд при 100 ° С в течение 5 мин и охладить на льду сразу же, по крайней мере 5 мин.
  20. Добавить зонд (6х10 5 копий в минуту / мл) в предварительно гибридизации раствора с мембраной.
  21. Выдержите в течение ночи при 65 ° С в гибридизации камеры.
  22. Отменить решение гибридизации и промойте мембрану в 2х SSC 0,1% SDS при комнатной температуре в течение 15 мин.
  23. Отменить решение и промойте мембрану в 0.1x SSC 0,1% SDS при 65 ° С в течение 30 мин.
  24. Отменить решение и промойте мембрану в 0.1x SSC на кратко РТ.
  25. Expose пленки при -80 ° С в течение 6 часов и развивать фильма. Типичный результат показан на рисунке 1.

3. rAAV3 Вектор-опосредованной трансдукции и экспрессии трансгена в клетках человека рак печени

  1. Семенной 1x10 4 ячейки (либо Huh7 или Hep293TT) в каждую лунку 96-луночного планшета. Инкубируйте в увлажненной CO 2 инкубаторе, по крайней мере 18 часов.
  2. Удаление среды из 96-луночного планшета.
  3. Вымойте клетки дважды с 50 мкл среды без FBS и антибиотиков и удалить.
  4. Добавить 50 мкл среды без FBS и антибиотиков и rAAV векторов в 5000 VGS / клетку.
  5. Инкубируйте пластин в CO 2 инкубаторе в течение 4 часов.
  6. Откажитесь от среды. Вымойте клетки дважды с 50 мкл полной среды и удалить.
  7. Добавить 150 мкл C-DMEM в каждую лунку и инкубировать пластины в CO 2 инкубаторе в течение 72 часов, и визуализировать EGFP выражения с помощью флуоресцентного микроскопа (DMI 4000B; Leica Microsystems).
  8. Изображения из трех скважин в инфицированные вирусом клетки, анализируются количественно ImageJ аналитического программного обеспечения (NIH, Bethesda, MD, США).
  9. Трансгенные выражение оценивается как общая площадь зеленой флуоресценции (пикселя 2) в поле зрения. Типичный результат показан на рисунке 2.
  10. Трансгенные выражение также может быть определена с помощью проточной цитометрии.

4. Представитель Результаты:

После протокола, описанные выше, можно генерировать векторов AAV серотипа эффективно. Типичный выход ~ 500 мкл, содержащей ~ 10 11 VGS / мкл очищенной вектор акций. Чистота вектор акции определяются путем сравнения сигналов гибридизации на количественных пятна слот ДНК, с и без Benzonase пищеварения. Очищенная rAAV3 векторов преобразовывать человека рак печени - злокачественная опухоль печени (HB) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) - клеточные линии эффективно.

Рисунок 1
Рисунок 1. Количественный ДНК слот-блот-анализ для определения титров rAAV3 векторов. Два раза разведения очищенной вирусной акции, переваривают Benzonase (верхний ряд), были проанализированы по количественным пятна слот ДНК с 32 Р-меченых EGFP-специфической ДНК-зонда. Титр AAV3 вектор определялся по сравнению с 1 нг (средний ряд) или 10 нг (нижний ряд) от AAV-EGFP плазмиды стандарты загружаются на мембране. Числа соответствуют ДНК-копий.

Рисунок 2
Рисунок 2. Рекомбинантного AAV вектор-опосредованного выражения трансгенов в клетках человека рак печени. Hep293TT клетки, недавно созданной линии клеток человека гепатобластомы 4, были либо макет-инфицированных (слева), или трансдуцированных с 5000 VGS / ячейки либо scAAV2-EGFP или scAAV3-EGFP векторов при температуре 37 ° С в течение 2 часов. Трансгенные выражение визуализируется 72 часов после трансдукции использованием флуоресцентного микроскопа.

Discussion

Рекомбинантные векторы на основе непатогенных человека парвовирус, адено-связанный вирус (AAV) были разработаны и используются в настоящее время в ряде генной терапии клинических испытаний 5. Ранее, из 10 наиболее часто используемых серотипов AAV, трансдукции эффективность AAV3 векторов в целом, как сообщается, быть особенно низкими, как в пробирке и в естественных 1. Тем не менее, наши недавние наблюдения, что AAV3 векторов преобразовывать человека раковых клеток печени чрезвычайно хорошо, как это определено количественно с помощью проточной цитометрии 2, и что AAV3 использует человеческий фактор роста гепатоцитов рецепторов (hHGFR) в качестве со-клеточный рецептор для связывания и вступление в этих клетки 3, настоятельно рекомендуем селективные ткани тропизм AAV3 для человеческих клеток печени в целом, и человеческие клетки рака печени в частности. Однако, поскольку AAV3 векторов также преобразовывать нормальные человеческие гепатоциты эффективно 2, их потенциального использования в генной терапии рака применение в естественных условиях было бы негативное влияние. Одна из возможных стратегий, чтобы обойти эту потенциальную проблему предполагает транскрипционных таргетирования раковых клеток путем выявления генов продукт, который выборочно производства опухоли, но не нормальных гепатоцитов. Например, предыдущие исследования показали, что сывороточные уровни α-фетопротеин (АФП) используются в качестве специфического маркера для отслеживания присутствия, прогрессии, и / или повторение определенных видов рака печени, так как нормальных гепатоцитов в целом производит очень небольшое количество этого белка. В самом деле, мы использовали AAV3 векторов, содержащих промоутер AFP целевому экспрессии трансгена в клетках рака печени, но не в нормальных гепатоцитов 2, и исследования в настоящее время для проверки эффективности такого подхода в мышиной модели ксенотрансплантата рака печени. В нашем дополнительных исследований, мы заметили, что трансдукция эффективность различных серотипов векторов AAV может быть существенно увеличено путем сайт-направленного мутагенеза поверхности, подвергшихся воздействию остатков тирозина в вирусную капсиды 6-14. С 6 на 7 поверхности, подвергшихся воздействию тирозинов также сохраняется в AAV3, мы выполнили сайт-направленного мутагенеза этих остатков и отметил, что трансдукция эффективность тирозин-мутант AAV3 векторы существенно усиливается в человеческой печени, раковые клетки (неопубликованные данные). Исследования также в настоящее время для оценки безопасности и эффективности тирозин-мутант AAV3 векторов в модели мыши ксенотрансплантата для человека гепатобластомы и гепатоцеллюлярной карциномы, а в случае успеха, оптимальное тирозин-мутант векторов AAV3 серотипа может оказаться полезным для таргетинга печени человека рака для потенциальных генной терапии.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим доктора. Р. Джуд Samulski и Сяо Сяо за их добрые дары рекомбинантный AAV3 и AAV-EGFP плазмиды, соответственно, и д-р Гейл Томлинсон для предоставления щедро Hep293TT клеток. Работа выполнена при частичной поддержке общественного здравоохранения Службы R01 предоставлять гранты HL-076 901, R01 HL-097 088, а P01 DK-058327 (Проект 1) из Национальных институтов здравоохранения (АС).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro 10-0170CM
PEI Polysciences, Inc. 23966
Benzonase Novagen, EMD Millipore 70664-3
HiTrap Q HP column GE Healthcare 17-1154-01
Salmon sperm DNA Fisher Scientific NC9753983
Iodixanol gradient OptiPrep 1114542
G-50 Columns GE Healthcare 27-5330-01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
  2. Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
  3. Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
  4. Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
  5. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
  6. Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
  7. Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
  8. Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
  9. Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
  10. Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
  11. Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
  12. Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
  13. Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
  14. Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , Forthcoming (2011).

Tags

Медицина выпуск 49 адено-ассоциированные вирусы вирусные векторы перенос генов экспрессия генов рак печени генная терапия
Высокоэффективные трансдукция клеток рака печени с помощью рекомбинантной адено-ассоциированные вирус серотипа 3 Вектора
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ling, C., Lu, Y., Cheng, B.,… More

Ling, C., Lu, Y., Cheng, B., McGoogan, K. E., Gee, S. W., Ma, W., Li, B., Aslanidi, G. V., Srivastava, A. High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors . J. Vis. Exp. (49), e2538, doi:10.3791/2538 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter