Summary
이 문서에서는, 우리는 인간 간암 세포를 타겟팅하는 가장 효율적인 벡터로 adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 (AAV3)의 신분증을 설명합니다.
Abstract
비 병원성 인간 파르 보 바이러스에 따라 재조합 벡터는, adeno - 관련 바이러스 2 (AAV2)가 개발하고, 유전자 치료 임상 실험의 여러 사용 현재되었습니다. 최근 추가 AAV의 serotypes의 숫자도 다양한 크고 작은 동물 모델 1 조직 tropism 선택을 전시 게재된 보유하고있는, 고립되었습니다. 10 가장 일반적으로 사용되는 AAV의 serotypes의 AAV3는 체외에서뿐만 아니라 생체내의 세포와 조직을 transducing에 의해 지금까지 가장 효율적입니다.
AAV3는 바인딩을위한 공동 수용체 세포로 인간 hepatocyte 성장 인자 수용체를 이용하기 때문에 매우 효과적으로 세포 라인 - hepatoblastoma (HB)와 간세포암 (HCC) - 그러나, 우리가 최근에 출판된 연구에, 우리는 AAV3 벡터 인간 간암 transduce 것을 문서화해야 이러한 세포 2,3에서 항목.
이 문서에서는, 우리는 기자의 유전자를 운반 재조합 벡터로 AAV3 인간 간암 세포의 고효율 전달을 달성하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 치료 유전자를 운반 재조합 AAV3 벡터의 사용은 결국 인간의 간 암의 가능성 유전자 치료가 발생할 수 있습니다.
Protocol
1. 재조합 Adeno - 관련 바이러스 혈청형 3 (rAAV3) 벡터의 포장
- 웹사이트로 이동 : " http://www.geguchadze.com/calc "과 DNA의 양을 계산합니다.
- FBS와 항생제없이 중간에 미리 혼합 plasmids pHelper (아데노 바이러스 도우미), pACG2c3 (AAV 도우미) 및 pdsAAV - CB - EGFP (rAAV 벡터). 총 볼륨 열 15cm 두 접시를 위해 8750 μL해야합니다.
- 단계 1.2 DNA 솔루션으로 PEI의 직접 1,250 μL를 (0.1 % M / V, Polysciences, 고양이 # 23966, 산도 4.5) 추가합니다. 몇 초 동안 소용돌이 DNA - PEI 솔루션입니다.
- 실온 (RT)에서 5 분 복잡한 형태로 품어 DNA - PEI 솔루션입니다.
- 15cm 2 판 당 DNA - PEI 솔루션 1 ML을 추가합니다.
- 신선한 25 ML 완벽한 매체로 대체, 4 시간 후 배지를 제거 10% FBS (C - DMEM).
- 세븐티 이시간 이후 transfection, 긁어 세포와 250 ML 원뿔 원심 튜브에 부어.
- 4 3,000 rpm으로 회전, ° 10 분 C. 뜨는을 하거라.
- 다시 중지 RB TMS 버퍼 (50 MM 트리스 - HCL, 150 MM NaCl, 산도 8.0) 5 ML에있는 세포 펠릿. 새로운 15 ML 원뿔 관을 전송합니다.
- 37 10 분 및 해동을위한 드라이 아이스 - 에탄올 욕조에 고정 ° C 10 분. 세 번 반복합니다.
- 4.8 M MgCl 2 단계 중 1 μL 및 Benzonase 2 μL (25 U / μL, Novagen, 고양이 # 70664-3)을 추가합니다. 37 소용돌이와 부화 ° 40 분 C.
- 40 분 ° 4, 4000 RPM에서 C를 스핀 다운 및 (lysate를 명확히) 표면에 뜨는를 수집합니다.
- 15 %의 두 ML, 25 % 2 ML, 40 %의 1.5 ML 후 13 ML 빠른 시일 원심 분리기 튜브 (베크 고양이 # 342413), 아래로 위로부터 하중 iodixanol 기울기 (OptiPrep, 고양이 # 1114542)에서 60 % iodixanol 1.5 ML. iodixanol 그라디언트의 상단에 뜨는 (1.12 단계)를로드합니다. RB TMS 버퍼로 튜브를 입력합니다.
- 16에서 1 시간 동안 75,000 rpm으로 원심 분리기 ° C 베크맨 90Ti의 로터를 사용합니다.
- 40-60% 경계에 주사기를 삽입하여 40 % iodixanol 분율를 수집합니다.
- 한 50 ML 원뿔 관에서 40 % iodixanol 분율을 전송하고 버퍼 40 ML까지하게 (20 MM 트리스, 15 MM NaCl, 산도 8.5).
- HiTrap Q HP 열 (GE 헬스케어, 고양이 # 17-1154-01)를 사용하여 여과 장치 조립. 다음 버퍼로 컬럼을 씻어 : 버퍼의 25 ML (20 MM 트리스, 15 MM NaCl, 산도 8.5), 버퍼 B (10 MM 트리스, 500 MM NaCl, 산도 8.5) 25 ML, 버퍼의 50 ML; 버퍼에서 바이러스 샘플의 40 ML, 버퍼 50 ML (20 MM 트리스, 15 MM NaCl, 산도 8.5), 버퍼 C (20 MM 트리스, 175 MM NaCl, 산도 8.5) 20 ML;
- 20 ML 아폴로 Concentrators (올비털 Biosciences)에 버퍼 C를 수집합니다. 4 3,000 rpm으로 원심 분리기, ° C 10 분.
- 흐름 -을 통해을 취소하고 4, 3000 RPM 20 냉장 PBS의 ML과 원심 분리기를 추가 ° C, 10 분.
- 흐름 -을 통해를 버리고 차가운 PBS 500 μL를 추가합니다. -80에서 작은 aliquots에 얼어 붙 어서 실리콘 - 대우 Eppendorf 튜브 및 저장하는 멤브레인 및 전송 ° C.에서 벡터를 씻어
2. rAAV3 벡터 Titers의 결정
- 얼음 Eppendorf 튜브에 바이러스를 정화 10 μL를 녹여. ddH 2 O. 40 μL 추가
- Benzonase의 0.2 μL (25 U / μL, Novagen, 고양이 # 70664)을 추가하고 37 품어 ° C를 1 시간.
- 다른 Eppendorf 튜브에 플라스미드 표준 (0.2 NG / μL) 50 μL를 가져가라.
- 65 각 튜브와 부화 ° C 30 분 100 MM NaOH 50 μL를 추가합니다.
- 적어도 5 분 즉시 얼음 칠.
- 바이오 점 여과지 (바이오 - 래드, 고양이 # 1620161)에 따라 전송 막 (Millipore, 고양이 # INYC00010)을 잘라 버릴거야. 20 분 세 여과지와 10X SSC의 막을 린스.
- 슬롯 얼룩 SF 장치 (바이오 점, 고양이 # 170-6542)를 설정합니다. 진공 플라스크에 연결하고 슬롯 얼룩 장치에 10X SSC 100 μL를 추가합니다.
- 단계 2.5의 샘플 각 20x SSC 100 μL와 배의 로딩 색소 1 μL를 추가합니다.
- 슬롯 얼룩 장치에서 막에 각 시료 100 μL를로드합니다.
- 샘플의 각으로 10X SSC의 또 다른 100 μL를 추가합니다.
- 모든 예제는 세포막을 통해 될 때까지 단계 2.9와 2.10를 반복합니다.
- 슬롯 얼룩 장치를 분해하여 세포막을 제거하십시오. 경감 링커 SL - 1000 자외선 Crosslinker으로 넣어요. "에너지"를 켭니다 "최적 Crosslink"(쇼 1200) 및 "시작"푸시.
- 연어 정자의 종기 일 ML (SS) DNA (피셔, 고양이 # NC9753983) 5 분. 적어도 5 분 얼음 칠.
- ddH 2 O, 15 ML의 27.5 ML을 혼합하여 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션을 준비 20x SSC, 50x Denhardt의 솔루션 5 ML, 20 % SDS의 1.25 ML, PolyA의 0.25 ML과 단계 2.13에서 SS DNA 1 ML.
- ° 하이브리드화 챔버에서 C 야간 65 덮인 유리 실린더와 부화에 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션의 25 ML에 멤브레인을 일시 중지합니다.
- ddH 2 O 10 μL의 50 NG DNA 템플릿을 희석. 100 삶아 ° C 이상에서 5 분 즉시 얼음에 5 분 및 진정하십시오.
- 1 분에 대한 RT에서 3,000 rpm으로 원심 분리기. 10 MM 3 dNTPs 2 μL (dCTP를 부족), Hexanucleotide 믹스 2 μL (로체, 고양이 # 11277081001) Klenow 1 μL (로체, 고양이 # 11008404001)와 α -32 P - dCTP 5 μL를 추가합니다. 37 ° C 10 분 알을 품다.
- 2 분 3,000 RPM에서 G - 50 열 (GE 헬스케어, 고양이 # 27-5330-01) 원심 분리기. 열에 단계 2.17에서 프로브를로드합니다. 2 분 3,000 rpm으로 원심 분리기와 흐름을 통해 수집합니다.
- 방사능 백작. ° C 즉시 얼음에 5 분 및 진정에 대한 최소한 5 분 100에 프로브를 끓여.
- 막과 사전 하이브 리다이 제이션 솔루션에 프로브를 (6x10 5 CPM / ML) 추가합니다.
- 하이브리드화 챔버 65 ° C에서 밤새 품어.
- 하이브 리다이 제이션 솔루션을 무시하고 15 분 RT에서 2X SSC 0.1 % SDS에서 막을 린스.
- 솔루션을 버리고 ° C 30 분 65 0.1x SSC 0.1 % SDS에서 막을 린스.
- 솔루션을 삭제하고 알티 간략에서 0.1x SSC에서 막을 린스.
- 6 시간 -80 ° C에서 필름을 노출하고 필름을 개발합니다. 전형 결과는 그림 1에 표시됩니다.
3. rAAV3 벡터 - 중재 전달 및 인간 간암 세포에 Transgene 표현
- 96 - 웰 플레이트의 각 우물에 씨앗 1x10 4 셀 (Huh7 또는 Hep293TT 중). 최소한 18 시간 동안 humidified CO 2 인큐베이터에서 부화.
- 96 - 웰 플레이트에서 매체를 제거합니다.
- FBS와 항생제없이 중간 50 μL로 두 번 세포를 씻고 제거합니다.
- 5000 vgs / 휴대폰 FBS와 항생제와 rAAV 벡터 않고 중간의 50 μL를 추가합니다.
- 4 시간 동안 CO 2 배양기에서 번호판을 품어.
- 매체 폐기하십시오. 전체 매체 50 μL로 두 번 세포를 씻고 제거합니다.
- 각 잘하는 C - DMEM 150 μL를 추가하고 72 시간 CO 2 배양기에서 접시를 부화하고, 형광 현미경을 사용하여 EGFP 식을 시각화 (DMI 4000B을, Leica 마이크로 시스템즈).
- 바이러스에 감염된 세포의 세 웰스의 이미지는 ImageJ 분석 소프트웨어 (NIH, 베데스다, MD, 미국)에 의해 양적 분석하고 있습니다.
- Transgene 표현은 영상 분야마다 녹색 형광의 총면적 (픽셀 2)로 평가됩니다. 전형 결과는 그림 2에 표시됩니다.
- Transgene 표현도 유동세포계측법에 의해 결정하실 수 있습니다.
4. 대표 결과 :
위에서 설명한 프로토콜에 따라, 하나는 효율적으로 AAV의 혈청형 벡터를 생성할 수 있습니다. 전형적인 수확량은 500 μL ~ 10 11 vgs 포함 / 벡터 주식을 정화의 μL. 벡터 주식의 순도가와 양적 DNA 슬롯 blots에서 하이브 리다이 제이션 신호를 비교하여하고 Benzonase는 소화하지 않고 결정됩니다. 효율적으로 세포 라인 - hepatoblastoma (HB)와 간세포암 (HCC) - rAAV3 벡터 transduce 인간 간암을 정화.
그림 1. rAAV3 벡터의 titers을 결정하는 정량 DNA 슬롯 얼룩 분석. Benzonase (맨 윗줄)과 소화 바이러스 주식, 정화의 2 배 dilutions는 32 P - 라벨 EGFP 특정 DNA 프로브와 양적 DNA 슬롯 blots에서 분석했다. AAV3 벡터의 titer는 1 NG (중앙 행) 또는 멤브레인에 로드된 AAV - EGFP 플라스미드 기준 10 NG (하단 행)과 비교에 의해 결정되었다. 숫자는 DNA 사본과 일치합니다.
그림 2. 재조합 AAV 인간 간암 세포에 벡터 중재 transgene 표현. Hep293TT 세포, 최근에 설립된 인간 hepatoblastoma 전지 라인 4, 중 모의에 감염된 (왼쪽 패널)되었다, 또는 2 시간 동안 37 ° C에서 scAAV2 - EGFP 또는 scAAV3 - EGFP 벡터 중 5,000 vgs / 세포와 transduced. Transgene 표현 72 시간 이후 도입은 형광 현미경을 사용하여 시각되었습니다.
Discussion
비 병원성 인간의 파르 보 바이러스, adeno - 관련 바이러스 (AAV)에 따라 재조합 벡터가 개발하고, 유전자 치료 임상 시험 5 여러 사용 현재되었습니다. 이전에는 10 개의 가장 일반적으로 사용되는 AAV의 serotypes의 일반적으로 AAV3 벡터의 전달 효율은 체외에서 생체내 1 두, 특히 낮은 것으로보고되었습니다. 그러나, 최근 관찰되는 AAV3로 유동세포계측법 2 양적 결정 매우 잘 벡터 transduce 인간 간암 세포 라인, 그 AAV3이에 바인딩 및 항목에 대한 공동 수용체 세포로 인간 hepatocyte 성장 인자 수용체 (hHGFR)를 활용 세포 3, 강하게 특히 일반적으로 인간의 간암 세포에 대한 AAV3의 선택 조직 tropism, 인간 간암 세포를 권장합니다. 그러나, 이후 AAV3 벡터는 또한 정상적인 인간 hepatocytes에게 효율적으로 2 transduce, 생체내에서 암 유전자 치료 응용 프로그램에서 자신의 잠재적인 사용에 부정적인 영향을 것입니다. 이 잠재적인 문제를 우회하는 한 가지 가능한 전략과 관련된 transcriptional 타겟팅 정상 hepatocytes에 의해 선택적으로 종양에 의해 생산되는 유전자 제품을 식별하여 암 세포하지만. 정상 hepatocytes은 일반적으로 매우 소량을 생산 이후 예를 들어, 이전의 연구 결과, α - 페토 프로테인 (AFP)의 혈청 수준이 존재, 진행 및 / 또는 간 암의 특정 유형의 reoccurrence를 추적하기위한 구체적인 표지로 사용하는 것으로 나타났습니다 이 단백질. 사실, 우리는 간암 세포에서 transgene 표현을 대상으로 AFP 프로 모터를 포함하는 AAV3 벡터를 사용한 있지만 정상적 hepatocytes 2, 연구의 현재 간암의 murine 이종 이식 모델에서이 접근 방식의 효능을 테스트하기 위해 진행되고 있습니다. 우리가 추가적인 연구에서 우리는 다양한 AAV의 혈청형 벡터의 전달 효율이 상당히 6-14 바이러스 capsids의 표면 노출 티로신 잔류의 사이트 이동 돌연변이 유발에 의해 증가된 수 있습니다 관찰했습니다. 6 7 표면 노출 tyrosines도 AAV3에 보존되어 있기 때문에, 우리는 이러한 잔류물의 사이트 감독 돌연변이 유발을 수행하고 티로신 - 돌연변이 AAV3 벡터의 전달 효율이 대폭 인간 간암 세포 (게시되지 않은 데이터)에 향상된 것을 관찰했습니다. 연구는 또한 인간 hepatoblastoma 및 간세포암에 대한 마우스 이종 이식 모델에서 티로신 - 돌연변이 AAV3 벡터의 안전성과 효능을 평가하기 위해 현재 진행되고 있으며, 성공적인 경우, 최적의 티로신 - 돌연변이 AAV3의 혈청형 벡터는 인간의 간을를 타겟팅하는 유용하다는 것을 증명하기 수 있습니다 잠재적인 유전자 치료에 대한 암.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 DRS 감사합니다. 넉넉한 Hep293TT 세포를 제공하는 재조합 AAV3 및 AAV - EGFP의 plasmids, 각각 박사 게일 톰린슨 그들의 종류의 선물 R. 주드 Samulski과 샤오 샤오. 이 연구는 국립 보건원에서 공중 보건 서비스 권한을 부여 부여 R01 HL - 076901, R01 HL - 097088, 및 P01 DK - 058327 (프로젝트 1) (로)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Salmon sperm DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
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