Summary
En este artículo se describe la identificación del serotipo del virus adeno-asociado 3 (AAV3) como el vector más eficiente para orientar las células humanas del cáncer de hígado.
Abstract
Vectores recombinantes basados en un parvovirus patógeno no humanos, el virus adeno-asociado 2 (AAV2) se han desarrollado, y están actualmente en uso en una serie de ensayos clínicos de terapia génica. Más recientemente, una serie de nuevos serotipos de AAV también se han aislado, que se ha demostrado que la exposición selectiva de tejidos tropismo en varios modelos animales grandes y pequeños 1. De los 10 serotipos más comúnmente utilizado AAV, AAV3 es por lejos la menos eficiente en la transducción de células y tejidos in vitro, así como in vivo.
Sin embargo, en nuestros estudios publicados recientemente, hemos documentado que AAV3 vectores transducir cáncer de hígado humano - hepatoblastoma (HB) y el carcinoma hepatocelular (CHC) - las líneas de células extremadamente eficiente porque utiliza AAV3 receptor del factor de crecimiento de hepatocitos como un co-receptor celular para la unión y la entrada de estas células 2,3.
En este artículo se describen los pasos necesarios para lograr una alta eficiencia de transducción de células humanas de cáncer de hígado por recombinante AAV3 vectores portadores de un gen reportero. El uso de recombinantes AAV3 vectores portadores de un gen terapéutico puede llevar finalmente a la terapia génica potencial de cáncer de hígado en los seres humanos.
Protocol
1. Embalaje de virus recombinante del serotipo 3 adeno-asociados (rAAV3) Vectores
- Ir a la página web: " http://www.geguchadze.com/calc "y calcular la cantidad de ADN.
- Pre-mezcla de plásmidos pHelper (ayudante adenovirus), pACG2c3 (AAV ayudante) y pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vector) en medio sin FBS y antibióticos. El volumen total debe ser 8.750 l por diez 15 cm 2 placas.
- Añadir directamente 1.250 l de PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) en la solución de ADN en el Paso 1.2. Vortex la solución de ADN-PEI durante unos segundos.
- Incubar ADN-PEI solución para formar un complejo de 5 min a temperatura ambiente (TA).
- Añadir 1 ml de ADN-PEI solución por cada 15 cm 2 de placas.
- Quitar medio después de 4 horas, reemplazando con agua dulce 25 ml de medio completo 10% de SFB (C-DMEM).
- Setenta y dos horas después de la transfección, las células de raspar y se vierte en un tubo de 250 ml de centrífuga cónico.
- Giran a 3000 rpm, a 4 ° C durante 10 min. Elimínese el líquido sobrenadante.
- Vuelva a suspender el pellet de células en 5 ml de RB TMS Buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Traslado a un nuevo tubo de 15 mL cónico.
- Congelación en hielo seco y baño de etanol durante 10 minutos y descongelar a 37 ° C durante 10 min. Repita tres veces.
- Añadir 1 l de 4,8 M de MgCl 2 y 2 l de Benzonase (25 U / l, Novagen, Cat # 70.664-3). Agitar e incubar a 37 ° C durante 40 min.
- De girar a 4.000 rpm, a 4 ° C durante 40 minutos y recoger el sobrenadante (lisado clarificado).
- En un tubo de 13 ml centrífuga Quick-Seal (Beckman, Cat # 342413), la carga de gradiente iodixanol (OptiPrep, Cat # 1114542) de arriba a abajo: 2 ml de 15%, 2 ml de 25%, 1,5 ml de 40% y 1,5 ml de 60% iodixanol. Cargar el sobrenadante (Paso 1.12) en la parte superior del gradiente iodixanol. Llenar los tubos con RB Buffer TMS.
- Centrifugar a 75.000 rpm durante 1 hora a 16 ° C con rotor Beckman 90TI.
- Recoger la fracción iodixanol 40% mediante la inserción de una jeringa en el 40-60% de los límites.
- La transferencia de la fracción iodixanol 40% en un tubo cónico de 50 ml y completar hasta 40 ml con tampón A. (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5)
- Montar el equipo de filtración utilizando HiTrap Q HP columna (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Lavar la columna con el tampón siguiente: 25 ml de tampón A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5);, 25 ml de tampón B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml de tampón A 40 ml de muestra de virus en un Buffer, 50 ml de tampón A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5);, 20 ml de tampón C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5)
- Recoger C de búfer en un 20 concentradores ml Apolo (Orbital Biosciences). Se centrifuga a 3000 rpm, a 4 ° C durante 10 min.
- Deseche el filtrado y agregar 20 ml de PBS frío y centrifugar a 3.000 rpm, a 4 ° C durante 10 min.
- Deseche el filtrado y añadir 500 l de PBS frío. Lavar los vectores de la membrana y la transferencia de siliconado tubos Eppendorf y se congele en pequeñas alícuotas a -80 ° C.
2. Determinación de rAAV3 Los títulos vectoriales
- Descongele 10 l de agua purificada de virus en un tubo Eppendorf en hielo. Añadir 40 l de ddH 2 O.
- Añadir 0,2 l de Benzonase (25 U / l, Novagen, Cat # 70664) y se incuba a 37 ° C durante 1 hora.
- Tome 50 L de la norma plásmido (0,2 ng / mL) en otro tubo Eppendorf.
- Añadir 50 l de 100 mM NaOH en cada tubo y se incuban en 65 º C durante 30 min.
- Se enfría en hielo inmediatamente a por lo menos 5 min.
- Corte la membrana de transferencia (Millipore, Cat # INYC00010) de acuerdo con Bio-Dot Papel de filtro (Bio-Rad, Cat # 1620161). Enjuague la membrana en SSC 10x con tres papeles de filtro durante 20 minutos.
- Establecer ranura blot SF aparato (Bio-Dot, Cat # 170 a 6.542). Conectarse a un frasco vacío y añadir 100 ml de 10x SSC a los aparatos de slot blot.
- Añadir 100 L de 20x SSC y 1 L de colorante de carga 6x a cada una de las muestras en el Paso 2.5.
- Carga de 100 l de cada muestra en la membrana en el aparato de slot blot.
- Agregue otro 100 l de 10x SSC en cada una de las muestras.
- Repita los pasos 2.9 y 2.10 hasta que la muestra pasa a través de la membrana.
- Desmontar el aparato de slot blot y quitar la membrana. Lo puso en Enlazador Inspector SL-1000 Crosslinker UV. A su vez sobre "Energía", "óptima Crosslink" (show 1200) y pulsar "Start".
- Hervir 1 ml de esperma de salmón (SS) del ADN (Fisher, Cat # NC9753983) durante 5 min. Se enfría en hielo durante al menos 5 min.
- Prepare la solución pre-hibridación mediante la mezcla de 27,5 ml de ddH2O, 15 ml de 20x SSC, 5 ml de solución de 50x Denhardt, 1,25 ml de 20% SDS, 0,25 ml de Polya y 1 ml de SS de ADN a partir del paso 2.13.
- Suspender la membrana en 25 ml de solución de pre-hibridación en un cilindro de vidrio tapado y se incuba a 65 ° C en una cámara de hibridación noche a la mañana.
- Diluir 50 plantillas ng de DNA en 10 l de ddH2O. Hervir a 100 º C durante 5 minutos y enfriar en hielo inmediatamente a por lo menos 5 min.
- Se centrifuga a 3000 rpm a temperatura ambiente durante 1 min. Añadir 2 l de 10 mM dNTPs 3 (que carecen de dCTP), 2 l de la mezcla hexanucleótido (Roche, Cat # 11277081001), 1 l de Klenow (Roche, Cat # 11008404001) y 5 L de α -32 P-dCTP. Se incuba a 37 ° C durante 10 min.
- Centrifugadora G-50 columnas (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) a 3.000 rpm durante 2 min. carga de la sonda en el paso 2.17 en la columna. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y recoger el filtrado.
- Contar con la radiactividad. Hierva la sonda a 100 º C durante 5 minutos y enfriar en hielo inmediatamente a por lo menos 5 min.
- Añadir la sonda (6x10 5 cpm / ml) en la solución de pre-hibridación con la membrana.
- Incubar toda la noche a 65 ° C en una cámara de hibridación.
- Deseche la solución de hibridación y lavado de la membrana en 2x SSC 0,1% SDS a temperatura ambiente durante 15 min.
- Deseche la solución y enjuague de la membrana en 0,1 x SSC 0,1% SDS a 65 ° C durante 30 min.
- Deseche la solución y enjuague de la membrana en 0,1 x SSC a una breve RT.
- Exponer la película a -80 ° C durante 6 horas y desarrollar la película. Un resultado típico se muestra en la Figura 1.
3. rAAV3 vector-mediado de transducción y la expresión del transgén en células humanas de cáncer de hígado
- Semillas de 1x10 4 células (ya sea Huh7 o Hep293TT) en cada pocillo de placa de 96 pocillos. Incubar en un incubador humidificado de CO 2 durante al menos 18 horas.
- Quitar medio de la placa de 96 pocillos.
- Lavar las células dos veces con 50 l de medio sin FBS y antibióticos y eliminar.
- Añadir 50 l de medio sin FBS y antibióticos y vectores rAAV en 5000 VGS / celular.
- Incubar las placas en la incubadora de CO 2 durante 4 horas.
- Se elimina el medio. Lavar las células dos veces con 50 l de medio completo y se retire.
- Añadir 150 ml de DMEM-C a cada pocillo e incubar la placa en la incubadora de CO 2 durante 72 horas, y visualizar la expresión EGFP utilizando un microscopio de fluorescencia (DMI 4000B, Leica Microsystems).
- Imágenes de tres pozos de células infectadas por virus son analizados cuantitativamente por análisis de software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE.UU.).
- La expresión del transgen se evalúa como un área total de fluorescencia verde (pixel 2) por el campo visual. Un resultado típico se muestra en la Figura 2.
- La expresión del transgen también puede ser determinada por citometría de flujo.
4. Los resultados representativos:
Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, se puede generar vectores AAV serotipo de manera eficiente. El rendimiento típico es de ~ 500 ~ l contiene 10 11 VGS / l de agua purificada de valores vectoriales. La pureza de las acciones vector se determina mediante la comparación de las señales de hibridación de ADN cuantitativa manchas ranura, con y sin digestión Benzonase. Purificada rAAV3 vectores cáncer de transducción de hígado humano - hepatoblastoma (HB) y el carcinoma hepatocelular (CHC) - las líneas celulares de manera eficiente.
Figura 1. ADN cuantitativa slot-blot para determinar los títulos de rAAV3 vectores. Diluciones de los stocks de virus purificado, digerido con Benzonase (fila superior) fueron analizadas en el cuantitativo manchas de ADN ranura con 32 P-etiquetados EGFP sonda específica de ADN. El título de AAV3 vector se determinó por comparación con 1 ng (fila central) o 10 ng (fila inferior) de AAV-EGFP normas plásmido cargado en la membrana. Los números corresponden a copias de ADN.
Figura 2. Recombinantes AAV vector mediada por la expresión del transgén en células humanas de cáncer de hígado. Hep293TT células, una recientemente creada línea celular humana hepatoblastoma 4, eran (izquierda) modelo de infectados, o transducidas con 5.000 VGS / celular de cualquiera de scAAV2-EGFP o vectores scAAV3-EGFP a 37 ° C durante 2 horas. La expresión del transgen se visualizó 72 horas después de transducción, utilizando un microscopio de fluorescencia.
Discussion
Vectores recombinantes basados en un parvovirus no patógenos humanos, el virus adeno-asociados (AAV) se han desarrollado, y están actualmente en uso en una serie de ensayos de terapia génica clínica 5. Anteriormente, de los 10 serotipos más comúnmente utilizado AAV, la eficiencia de transducción de AAV3 vectores, en general, se ha informado es particularmente bajo, tanto in vitro como in vivo 1. Sin embargo, nuestra reciente observación de que AAV3 vectores de transducción de hígado humano líneas celulares de cáncer muy bien, como se determina cuantitativamente por citometría de flujo 2, y que AAV3 utiliza el crecimiento de hepatocitos humanos receptor del factor (hHGFR) como co-receptor celular para la entrada de enlace y en estas las células 3, sugieren una selectiva del tejido tropismo de AAV3 de las células del hígado humano en general, y las células humanas del cáncer de hígado en particular. Sin embargo, desde AAV3 vectores también transducción de hepatocitos humanos normales eficiente 2, su uso potencial en la aplicación de la terapia génica contra el cáncer in vivo sería un impacto negativo. Una estrategia posible para evitar este problema potencial consiste en la transcripción de metas de las células cancerosas mediante la identificación de un producto génico que es selectivamente por el tumor, pero no por los hepatocitos normales. Por ejemplo, estudios previos han mostrado que los niveles séricos de α-fetoproteína (AFP) se utiliza como un marcador específico para el seguimiento de la presencia, la progresión y / o recurrencia de ciertos tipos de cánceres de hígado, ya que los hepatocitos normales generalmente producen cantidades muy pequeñas de esta proteína. De hecho, hemos utilizado AAV3 vectores que contienen el promotor de la AFP para dirigir la expresión del transgén en las células de cáncer de hígado, pero no en los hepatocitos normales 2, y los estudios están actualmente en marcha para probar la eficacia de este enfoque en un modelo murino xenoinjertos de cáncer de hígado. En nuestros estudios adicionales, se ha observado que la eficacia de transducción de diversos vectores AAV serotipo puede ser significativamente aumentada por mutagénesis dirigida de la superficie expuesta residuos de tirosina en las cápsidas virales 06.14. Desde el 6 de 7 en la superficie expuesta tirosinas también se conservan en AAV3, hemos llevado a cabo la mutagénesis dirigida de los residuos, y observó que la eficacia de la transducción de la tirosina-mutante AAV3 vectores es significativamente mayor en células humanas de cáncer de hígado (datos no publicados). Los estudios también están llevando a cabo para evaluar la seguridad y la eficacia de la tirosina-mutante AAV3 vectores en modelos de xenoinjerto de ratón para el hepatoblastoma y el carcinoma hepatocelular humano, y si tiene éxito, el óptimo de la tirosina-mutante vectores serotipo AAV3 puede resultar útil para orientar el hígado humano tipos de cáncer para la terapia génica potencial.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. R. Jude Samulski y Xiao Xiao para sus regalos de tipo recombinante AAV3 y plásmidos AAV-EGFP, respectivamente, y el Dr. Gail Tomlinson por su generosidad al proporcionar células Hep293TT. Esta investigación fue financiada en parte por el Servicio de Salud Pública otorga beca R01 HL-076901, R01 HL-097088, y P01 DK-058327 (Proyecto 1) de los Institutos Nacionales de Salud (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Salmon sperm DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , Forthcoming (2011).
