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Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

Published: March 22, 2011 doi: 10.3791/2538
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Cellular and Molecular Therapy, University of Florida

Summary

Dans cet article, nous décrivons l'identification du virus adéno-associé de sérotype 3 (AAV3) comme le vecteur le plus efficace pour cibler les cellules humaines de cancer du foie.

Abstract

Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus non-pathogènes humains, le virus adéno-associé 2 (AAV2) ont été développés et sont actuellement en usage dans un certain nombre d'essais cliniques de thérapie génique. Plus récemment, un certain nombre de sérotypes AAV supplémentaires ont également été isolées, qui ont été montrés à l'exposition sélective des tissus tropisme dans divers modèles animaux petits et grands 1. Parmi les 10 sérotypes les plus couramment utilisés AAV, AAV3 est de loin la moins efficace dans la transduction de cellules et de tissus in vitro ainsi que in vivo.

Cependant, dans nos études publiées récemment, nous avons documenté que AAV3 vecteurs transduire un cancer du foie humain - hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC) - lignées cellulaires de manière extrêmement efficace, car AAV3 utilise des récepteurs humains facteur de croissance des hépatocytes comme un co-récepteur cellulaire pour la liaison et l'entrée dans ces cellules 2,3.

Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour atteindre de haute efficacité de transduction des cellules humaines de cancer du foie par recombinaison AAV3 vecteurs portant un gène rapporteur. L'utilisation de recombinants AAV3 vecteurs portant un gène thérapeutique peut éventuellement conduire à la thérapie génique potentiel de cancers du foie chez les humains.

Protocol

1. Emballage de virus recombinants adéno-associé de sérotype 3 (rAAV3) Vecteurs

  1. Allez sur le site: " http://www.geguchadze.com/calc "et de calculer la quantité d'ADN.
  2. Pré-mélange plasmides pHelper (aide adénovirus), pACG2c3 (AAV helper) et pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vecteur) dans un milieu sans SVF et des antibiotiques. Le volume total devrait être 8750 uL de dix à 15 cm 2 plaques.
  3. Ajouter directement 1250 uL de PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) dans la solution d'ADN à l'étape 1.2. Vortex la solution d'ADN-Prince-Édouard pendant quelques secondes.
  4. Incuber l'ADN-Prince-Édouard solution pour former un complexe de 5 min à température ambiante (RT).
  5. Ajouter 1 mL de l'ADN-Prince-Édouard solution par 15 cm 2 plaques.
  6. Retirer moyenne après 4 heures, en remplaçant avec des produits frais 25 ml de milieu complet 10% de FBS (C-DMEM).
  7. Soixante-douze heures après transfection, les cellules gratter et verser dans un tube de 250 ml à centrifuger conique.
  8. Centrifuger à 3000 rpm à 4 ° C pendant 10 min. Verser le liquide surnageant.
  9. Re-suspendre le culot cellulaire dans 5 ml de RB TMS tampon (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, pH 8,0). Transfert à un nouveau 15 ml tube conique.
  10. Congeler dans la glace sèche-éthanol de bain pendant 10 minutes et le dégel à 37 ° C pendant 10 min. Répétez trois fois.
  11. Ajouter 1 ul de 4,8 M MgCl 2 et 2 pi de Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664-3). Vortex et laisser incuber à 37 ° C pendant 40 min.
  12. Isoler à 4000 rpm à 4 ° C pendant 40 minutes et recueillir le surnageant (lysat clarifié).
  13. Dans un tube de 13 ml à centrifuger Quick-Seal (Beckman, Cat # 342413), la charge iodixanol gradient (OptiPrep, Cat # 1114542) de haut en bas: 2 mL de 15%, 2 ml de 25%, 1,5 mL de 40% et 1,5 ml de iodixanol 60%. Chargez le surnageant (étape 1.12) sur le haut de la pente iodixanol. Remplir les tubes avec RB TMS Tampon.
  14. Centrifuger à 75000 rpm pendant 1 heure à 16 ° C en utilisant Beckman 90TI rotor.
  15. Recueillir la fraction iodixanol 40% en insérant une seringue à la limite de 40-60%.
  16. Transfert de la fraction iodixanol 40% en un tube conique 50 ml et porter à 40 ml avec le tampon A. (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5)
  17. Assembler l'appareil de filtration à l'aide HiTrap Q HP colonne (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Laver la colonne avec le tampon suivant: 25 ml de tampon A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5);; 25 ml de tampon B (Tris 10 mM, NaCl 500 mM, pH 8,5), 50 ml de tampon A 40 ml d'échantillon de virus dans le tampon A, 50 ml de tampon A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5);; 20 ml de tampon C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5)
  18. Recueillir C dans un tampon concentrateurs 20 mL d'Apollo (Orbital Biosciences). Centrifuger à 3000 rpm à 4 ° C pendant 10 min.
  19. Jeter l'effluent à travers et ajouter 20 ml de PBS et centrifuger refroidi à 3.000 tpm, à 4 ° C pendant 10 min.
  20. Jeter l'effluent à travers et ajouter 500 ul de PBS refroidi. Lavez les vecteurs hors de la membrane et le transfert d'traité à la silicone et de stocker des tubes Eppendorf congelés dans de petites aliquotes à -80 ° C.

2. Détermination de rAAV3 Les titres Vecteur

  1. Dégeler 10 uL de virus purifié dans un tube Eppendorf sur la glace. Ajouter 40 uL de DDH 2 O.
  2. Ajouter 0,2 ul de Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664) et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
  3. Prenez 50 uL de standard plasmidique (0,2 ng / uL) dans un autre tube Eppendorf.
  4. Ajouter 50 ul de 100 mM NaOH dans chaque tube et incuber à 65 ° C pendant 30 min.
  5. Réfrigérer la glace immédiatement pendant au moins 5 min.
  6. Couper la membrane de transfert (Millipore, Cat # INYC00010) selon Bio-Dot Papier filtre (Bio-Rad, Cat # 1620161). Rincer la membrane en 10x SSC avec trois papiers filtres pendant 20 min.
  7. Set slot blot SF Appareillage (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Connectez-vous à une fiole à vide et ajouter 100 ul de 10x SSC aux appareils slot blot.
  8. Ajouter 100 ul de 20x SSC et 1 pl de colorant de chargement 6x à chacun des échantillons à l'étape 2.5.
  9. Charge 100 ul de chaque échantillon sur la membrane de l'appareil slot blot.
  10. Ajouter un autre uL 100 de 10x SSC dans chacun des échantillons.
  11. Répétez les étapes 2.9 et 2.10 jusqu'à ce que tous les échantillons va à travers la membrane.
  12. Démonter l'appareil et le slot blot retirer la membrane. Mettez-le en Linker inspecteur SL-1000 Crosslinker UV. Tourner sur "l'énergie", "Optimal Crosslink" (spectacle 1200) et pousser "Démarrer".
  13. Faire bouillir 1 ml de sperme de saumon (SS) ADN (Fisher, Cat # NC9753983) pendant 5 min. Réfrigérer la glace pendant au moins 5 min.
  14. Préparer la solution de pré-hybridation en mélangeant 27,5 ml de DDH 2 O, 15 ml de SSC 20x, 5 ml de solution 50x Denhardt, 1,25 mL de SDS 20%, 0,25 mL de Polya et 1 ml de SS ADN de l'étape 2.13.
  15. Suspendre la membrane dans 25 ml de solution de pré-hybridation dans un cylindre de verre bouché et incuber à 65 ° C dans une chambre d'hybridation pendant la nuit.
  16. Diluer 50 modèles ng d'ADN dans 10 ul de DDH 2 O. Faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur la glace immédiatement pendant au moins 5 min.
  17. Centrifuger à 3000 rpm à température ambiante pendant 1 min. Ajouter 2 ul de 10 mM dNTP 3 (manque dCTP), 2 pl de Mix hexanucléotide (Roche, Cat # 11277081001), 1 pl de Klenow (Roche, Cat # 11008404001) et 5 pi de α -32 P-dCTP. Incuber à 37 ° C pendant 10 min.
  18. Centrifugeuse G-50 colonnes (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) à 3000 rpm pendant 2 min. la charge de la sonde à l'étape 2.17 dans la colonne. Centrifuger à 3000 rpm pendant 2 min et recueillir les actions accréditives.
  19. Comptez radioactivité. Faire bouillir la sonde à 100 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur la glace immédiatement pendant au moins 5 min.
  20. Ajouter la sonde (6x10 5 cpm / ml) dans la solution de pré-hybridation avec la membrane.
  21. Incuber une nuit à 65 ° C dans une chambre d'hybridation.
  22. Jeter la solution d'hybridation et rincer la membrane dans 2x SSC 0,1% SDS à température ambiante pendant 15 min.
  23. Jeter la solution et rincer la membrane de 0,1 x SSC + 0,1% SDS à 65 ° C pendant 30 min.
  24. Jeter la solution et rincer la membrane de 0,1 x SSC à brève RT.
  25. Exposer le film à -80 ° C pendant 6 heures et de développer le film. Un résultat typique est montré dans la figure 1.

3. rAAV3 Vecteur médiée Transduction et l'expression du transgène dans les cellules humaines de cancer du foie

  1. Graine 1x10 4 cellules (soit Huh7 ou Hep293TT) dans chaque puits de plaque de 96 puits. Incuber dans un incubateur humidifié CO 2 pendant au moins 18 heures.
  2. Retirer de la plaque de support de 96 puits.
  3. Laver les cellules deux fois avec 50 ul de milieu sans SVF et des antibiotiques et à enlever.
  4. Ajouter 50 uL de milieu sans SVF et des antibiotiques et des vecteurs rAAV à 5000 vgs / cellule.
  5. Incuber les plaques dans l'incubateur CO 2 pendant 4 heures.
  6. Jeter la moyenne. Laver les cellules deux fois avec 50 ul de milieu complet et à enlever.
  7. Ajouter 150 pi de DMEM-C dans chaque puits et incuber la plaque dans incubateur à CO 2 pendant 72 heures, et de visualiser l'expression de l'EGFP en utilisant un microscope à fluorescence (DMI 4000B; Leica Microsystems).
  8. Images à partir de trois puits de cellules infectées sont analysées quantitativement par ImageJ logiciels d'analyse (NIH, Bethesda, MD, USA).
  9. L'expression du transgène est évalué comme surface totale de fluorescence verte (2 pixels) par le champ visuel. Un résultat typique est montré dans la figure 2.
  10. L'expression du transgène peut également être déterminée par cytométrie en flux.

4. Les résultats représentatifs:

En suivant le protocole décrit ci-dessus, on peut générer des vecteurs AAV de sérotype efficacement. Le rendement typique est d'environ 500 uL contenant ~ 10 11 vgs / uL d'purifiée stock de vecteur. La pureté du stock de vecteur est déterminé en comparant les signaux d'hybridation sur taches quantitatives emplacement de l'ADN, avec et sans la digestion Benzonase. Purifié rAAV3 vecteurs transduire un cancer du foie humain - hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC) - lignées cellulaires de façon efficace.

Figure 1
Figure 1. Quantitative ADN slot-blot pour déterminer les titres des rAAV3 vecteurs. Deux dilutions des stocks viraux purifiés, digérés avec Benzonase (rangée du haut) ont été analysés sur quantitatives taches slot d'ADN avec 32 P-étiquetés sonde d'ADN spécifique EGFP. Le titre du AAV3 vecteur a été déterminée par comparaison avec 1 ng (rangée du milieu) ou 10 ng (rangée du bas) de l'AAV-EGFP normes plasmide chargé sur la membrane. Les numéros correspondent aux copies d'ADN.

Figure 2
Figure 2. Vecteur AAV recombinant médiée par l'expression du transgène dans les cellules humaines de cancer du foie. Cellules Hep293TT, une création récente lignée humaine de cellules d'hépatoblastome 4, ont été soit (à gauche) maquette infectés, ou transduites avec 5000 vgs / cellule soit scAAV2-EGFP ou scAAV3-EGFP vecteurs à 37 ° C pendant 2 heures. L'expression du transgène a été visualisée 72 heures après la transduction utilisant un microscope à fluorescence.

Discussion

Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus non pathogène pour l'homme, le virus adéno-associé (AAV) ont été développés et sont actuellement en usage dans un certain nombre d'essais cliniques de thérapie génique 5. Auparavant, les 10 sérotypes les plus couramment utilisés AAV, l'efficacité de la transduction des vecteurs AAV3 en général a été signalé comme étant particulièrement faible, tant in vitro et in vivo 1. Cependant, notre observation récente que AAV3 vecteurs transduire des lignées cellulaires de cancer du foie, excessivement bien, tel que déterminé quantitativement par deux cytométrie en flux, et que AAV3 utilise le récepteur hépatocytaire humaine du facteur de croissance (hHGFR) comme un co-récepteur cellulaire d'entrée obligatoire et dans ces cellules 3, suggèrent fortement une approche sélective des tissus tropisme du AAV3 des cellules hépatiques humaines en général, et des cellules humaines de cancer du foie en particulier. Toutefois, depuis AAV3 vecteurs aussi transduire efficacement les hépatocytes humains normaux 2, leur utilisation potentielle dans le traitement du cancer de demande de gène in vivo seraient affectées négativement. Une stratégie possible pour contourner ce problème potentiel transcriptionnel implique le ciblage des cellules cancéreuses en identifiant un produit génique qui est sélectivement produites par la tumeur, mais pas par les hépatocytes normaux. Par exemple, des études antérieures ont montré que les concentrations sériques de α-foetoprotéine (AFP) sont utilisés comme un marqueur spécifique pour le suivi de la présence, la progression et / ou à la réapparition de certains types de cancers du foie, puisque les hépatocytes normaux produisent généralement de très petites quantités cette protéine. En effet, nous avons utilisé AAV3 vecteurs contenant le promoteur AFP pour cibler l'expression du transgène dans les cellules de cancer du foie, mais pas dans les hépatocytes normaux 2, et des études sont actuellement en cours pour tester l'efficacité de cette approche dans un modèle murin de xénogreffe de cancer du foie. Dans nos études supplémentaires, nous avons observé que l'efficacité de transduction des différents vecteurs AAV de sérotype peut être considérablement augmentée par mutagenèse dirigée de la surface exposée résidus tyrosines dans les capsides virales 6-14. Depuis 6 sur 7 exposées à la surface tyrosines sont également conservées dans AAV3, nous avons effectué une mutagenèse dirigée de ces résidus ainsi observé que l'efficacité de transduction de la tyrosine-mutant AAV3 vecteurs est significativement accrue dans les cellules humaines de cancer du foie (données non publiées). Des études sont également en cours pour évaluer l'innocuité et l'efficacité de la tyrosine-AAV3 mutant vecteurs dans des modèles de xénogreffe de souris pour hépatoblastome humain et le carcinome hépatocellulaire, et en cas de succès, la tyrosine-optimale mutant vecteurs sérotype AAV3 peuvent se révéler utiles pour le ciblage du foie humain cancers de la thérapie génique potentielle.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Nous remercions les Drs. R. Jude Samulski et Xiao Xiao pour leurs dons en nature de recombinaison AAV3 et AAV-EGFP plasmides, respectivement, et le Dr Gail Tomlinson pour avoir généreusement fourni les cellules Hep293TT. Cette recherche a été financée en partie par Service de santé publique accorde bourse R01 HL-076901, R01 HL-097088, et P01 DK-058327 (Projet 1) de la National Institutes of Health (AS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Cellgro 10-0170CM
PEI Polysciences, Inc. 23966
Benzonase Novagen, EMD Millipore 70664-3
HiTrap Q HP column GE Healthcare 17-1154-01
Salmon sperm DNA Fisher Scientific NC9753983
Iodixanol gradient OptiPrep 1114542
G-50 Columns GE Healthcare 27-5330-01

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References

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