Summary
I denna artikel beskriver vi identifieringen av Adeno-associerad serotyp 3 (AAV3) som den mest effektiva vektorn för inriktning mänskliga celler levercancer.
Abstract
Rekombinanta vektorer baserade på ett icke-patogena mänskliga Parvovirus har Adeno-associerade virus 2 (AAV2) utvecklats och används för närvarande i ett antal kliniska genterapi försök. På senare tid har ett antal ytterligare AAV serotyper även isolerats, som har visat att ställa ut selektivt vävnad-tropism hos olika små och stora djurmodeller 1. Av de 10 vanligaste AAV serotyper är AAV3 i särklass minst effektiva i transducing celler och vävnader in vitro och in vivo.
Men i våra nyligen publicerade studier har vi dokumenterat att AAV3 vektorer transduce mänskliga levercancer - hepatoblastoma (HB) och hepatocellulär cancer (HCC) - cellinjer extremt effektivt eftersom AAV3 använder mänskliga hepatocyte receptor tillväxtfaktor som en cellulär co-receptor för bindning och införande i dessa celler 2,3.
I denna artikel beskriver vi de åtgärder som krävs för att uppnå hög effektivitet transduktion av mänskliga celler levercancer med hjälp av rekombinant AAV3 vektorer som bär en reporter gen. Användning av rekombinanta AAV3 vektorer som bär en terapeutisk gen kan så småningom leda till att potentiella genterapi av lever cancer hos människor.
Protocol
1. Packning av Rekombinant Adeno-associerad serotyp 3 (rAAV3) Vektorer
- Gå till webbsidan: " http://www.geguchadze.com/calc "och beräkna mängden DNA.
- Förblandning plasmider pHelper (Adenovirus hjälpare), pACG2c3 (AAV hjälpare) och pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vektor) i medium utan FBS och antibiotika. Total volym bör vara 8750 mikroliter för tio 15 cm 2 plattor.
- Lägg direkt 1250 mikroliter av PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23.966, pH 4,5) i DNA-lösning i steg 1,2. Vortexa DNA-Pei lösning för några sekunder.
- Inkubera DNA-Pei lösning för att bilda ett komplex i 5 minuter i rumstemperatur (RT).
- Tillsätt 1 mL av DNA-Pei lösning per 15 cm 2 tallrik.
- Ta bort mediet efter 4 timmar, ersätts med färska 25 ml klar medelstora 10% FBS (C-DMEM).
- Sjuttiotvå timmar efter transfektion, celler skrapa och häll i en 250 ml koniskt centrifugrör.
- Spin vid 3000 rpm, vid 4 ° C i 10 min. Häll bort supernatanten.
- Återsuspendera cellpelleten i 5 ml RB TMS Buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Förflyttas till en ny 15 ml koniska rör.
- Frys i torris-etanol badet i 10 min och tina vid 37 ° C i 10 min. Upprepa tre gånger.
- Tillsätt 1 mikroliter av 4,8 M MgCl 2 och 2 mikroliter av bensonas (25 E / mikroliter, Novagen, Cat # 70.664-3). Vortexa och inkubera i 37 ° C i 40 min.
- Spinn ner vid 4.000 rpm vid 4 ° C i 40 min och samla in supernatanten (förtydligas lysat).
- I en 13 ml Quick-Seal centrifugrör (Beckman, Cat # 342.413), ladda iodixanol lutning (OptiPrep, Cat # 1.114.542) från topp till botten: 2 ml 15%, 2 ml 25%, 1,5 ml på 40% och 1,5 mL av 60% iodixanol. Ladda supernatanten (steg 1,12) på toppen av iodixanol lutning. Fyll rören med RB TMS buffert.
- Centrifugera vid 75.000 rpm under 1 timme vid 16 ° C med Beckman 90Ti rotorn.
- Samla 40% iodixanol bråkdel genom att föra in en spruta på 40-60% gränsen.
- Överför 40% iodixanol fraktionen i en 50 ml koniska rör och späd till 40 ml med buffert A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5).
- Montera filtreringsapparaten med HiTrap Q HP kolumn (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Tvätta kolonnen med följande buffert: 25 ml buffert A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 25 ml buffert B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml buffert A; 40 ml av virusexempel i buffert A, 50 ml buffert A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 20 ml buffert C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5);
- Samla buffert C i en 20 ml Apollo anrikningsverk (Orbital Biosciences). Centrifugera vid 3000 rpm vid 4 ° C i 10 min.
- Kassera genomströmning och tillsätt 20 ml kyld PBS och centrifugera vid 3000 rpm vid 4 ° C i 10 min.
- Kassera genomströmning och tillsätt 500 mikroliter av kylda PBS. Tvätta vektorerna bort från membranet och transfer till silikon-behandlade Eppendorf-rör och förvaras nedfryst i små alikvoter vid -80 ° C.
2. Fastställande av rAAV3 Vector antikroppnivåer
- Tina 10 mikroliter av renat virus i ett Eppendorf-rör på is. Tillsätt 40 mikroliter av DDH 2 O.
- Tillsätt 0,2 mikroliter av bensonas (25 E / mikroliter, Novagen, Cat # 70.664) och inkubera vid 37 ° C i 1 timme.
- Ta 50 mikroliter av plasmid-standarden (0,2 ng / l) i en annan Eppendorf-rör.
- Tillsätt 50 mikroliter av 100 mm NaOH i varje rör och inkubera i 65 ° C i 30 min.
- Chill på is omedelbart i minst 5 min.
- Klipp överföra membran (Millipore, Cat # INYC00010) enligt Bio-Dot Filtrerpapper (Bio-Rad, Cat # 1.620.161). Skölj membranet i 10x SSC med tre filter papper för 20 min.
- Ställ kortplats blot SF apparater (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Anslut till ett vakuum och tillsätt 100 mikroliter av 10x SSC till fack blot apparater.
- Tillsätt 100 mikroliter av 20x SSC och 1 mikroliter av 6x laddningsfärg till varje prov i steg 2,5.
- Belastning 100 mikroliter av varje prov på membranet i facket blot apparaten.
- Lägg till ytterligare 100 mikroliter av 10x SSC i varje prov.
- Upprepa steg 2,9 och 2,10 tills alla prov går igenom membranet.
- Isär apparaten facket blot och ta bort membranet. Lägg den i Inspektör Linker SL-1000 UV Crosslinker. Sätt på "Energi", "Optimal Crosslink" (show 1200) och tryck på "Start".
- Koka 1 mL lax spermier (SS) DNA (Fisher, Cat # NC9753983) i 5 minuter. Chill på is i minst 5 minuter.
- Förbered före hybridisering lösning genom att blanda 27,5 ml DDH 2 O, 15 ml 20x SSC, 5 ml 50x Denhardt lösning, 1,25 ml 20% SDS, 0,25 ml Polya och 1 ml SS DNA från steg 2,13.
- Häng membranet i 25 ml av pre-hybridisering lösning i ett tak glascylinder och inkubera vid 65 ° C i en hybridisering kammare över natten.
- Späd 50 ng DNA-mallar i 10 mikroliter av DDH 2 O. Koka vid 100 ° C i 5 min och chill på is omedelbart i minst 5 min.
- Centrifugera vid 3000 rpm vid RT i 1 minut. Tillsätt 2 mikroliter av 10 mm 3 dNTPs (saknas dCTP), 2 mikroliter av Hexanucleotide Mix (Roche, Cat # 11277081001), 1 ìl Klenow (Roche, Cat # 11008404001) och 5 mikroliter av α -32 P-dCTP. Inkubera vid 37 ° C i 10 min.
- Centrifugera G-50 kolumner (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) vid 3000 rpm i 2 min. belastning sonden i steg 2,17 i kolonnen. Centrifugera vid 3000 rpm i 2 minuter och samla genomströmning.
- Räkna radioaktivitet. Koka sonden vid 100 ° C i 5 min och chill på is omedelbart i minst 5 min.
- Lägg till givare (6x10 5 CPM / ml) i pre-hybridisering lösning med membran.
- Inkubera över natten vid 65 ° C i en hybridisering kammare.
- Kasta hybridisering lösningen och skölj membran i 2x SSC 0,1% SDS i RT i 15 min.
- Kassera lösningen och skölj membran i 0,1 x SSC 0,1% SDS vid 65 ° C i 30 min.
- Kassera lösningen och skölj membran i 0,1 x SSC vid RT-kort.
- Exponera filmen på -80 ° C i 6 timmar och utveckla filmen. Ett typiskt resultat visas i Figur 1.
3. rAAV3 Vector-medierad Transduction och transgens uttryck i mänskliga celler Levercancer
- Seed 1x10 4 celler (antingen Huh7 eller Hep293TT) i varje brunn på 96-brunnar. Inkubera i en fuktig CO 2 inkubator i minst 18 timmar.
- Ta bort mediet från den 96-brunnar.
- Tvätta cellerna två gånger med 50 mikroliter av medium utan FBS och antibiotika och ta bort.
- Tillsätt 50 mikroliter av medium utan FBS och antibiotika och rAAV vektorer på 5000 VGS / cell.
- Inkubera plattorna i CO 2-inkubator för 4 timmar.
- Kasta mediet. Tvätta cellerna två gånger med 50 mikroliter av kompletta medium och ta bort.
- Tillsätt 150 mikroliter av C-DMEM till varje brunn och inkubera plattan i CO 2-inkubator för 72 timmar, och visualisera EGFP uttryck med hjälp av en fluorescensmikroskop (DMI 4000B, Leica Microsystems).
- Bilder från tre brunnar virusinfekterade celler analyseras kvantitativt genom ImageJ analysprogram (NIH, Bethesda, MD, USA).
- Transgens uttryck bedöms som total yta på grön fluorescens (pixel 2) per synfält. En typisk Resultatet visas i figur 2.
- Transgenen uttryck kan också bestämmas med flödescytometri.
4. Representativa resultat:
Efter det protokoll som beskrivs ovan kan en generera AAV serotyp vektorer effektivt. Den typiska avkastning är ~ 500 mikroliter innehåller ~ 10 11 VGS / mikroliter av renat vektor lager. Renheten av vektorn beståndet bestäms genom att jämföra hybridisering signaler på kvantitativa blots DNA-spår, med och utan bensonas matsmältning. Renat rAAV3 vektorer transduce mänskliga levercancer - hepatoblastoma (HB) och hepatocellulär cancer (HCC) - cellinjer effektivt.
Figur 1. Kvantitativa DNA slot-blot-analys för att bestämma titrar av rAAV3 vektorer. Två gånger utspädningar av renade virus lager, kokas med bensonas (övre raden) analyserades på kvantitativa blotting DNA-spår med 32 P-märkta EGFP-specifik DNA-prob. Den titer av AAV3 vektor bestämdes genom jämförelse med 1 ng (mellersta raden) eller 10 ng (nedersta raden) av AAV-EGFP plasmid standarder lastas på membranet. Siffrorna motsvarar DNA-kopior.
Figur 2. Rekombinant AAV vektor-medierad transgenen uttryck i mänskliga celler levercancer. Hep293TT celler, ett nyligen etablerat mänskliga hepatoblastoma cellinje 4, var antingen mock-smittade (till vänster), eller transduced med 5000 VGS / cell av antingen scAAV2-EGFP eller scAAV3-EGFP vektorer vid 37 ° C i 2 timmar. Transgenen uttryck visualiserades 72 timmar efter transduktion med ett fluorescensmikroskop.
Discussion
Rekombinanta vektorer baserade på ett icke-patogena mänskliga parvovirus, den Adeno-associerade virus (AAV) har utvecklats, och används för närvarande i ett antal genterapi kliniska prövningar 5. Tidigare av de 10 vanligaste AAV serotyper har transduktion effektivitet AAV3 vektorer i allmänhet rapporterats vara särskilt låg, både in vitro och in vivo 1. Men vår senaste observationen att AAV3 vektorer transduce mänskliga levercancer cellinjer utomordentligt väl, som bestäms kvantitativt genom flödescytometri 2 och att AAV3 utnyttjar den mänskliga hepatocyte receptorn growth factor (hHGFR) som en cellulär co-receptor för bindande och inträde i dessa celler 3, rekommenderar starkt ett selektivt vävnad-tropism för AAV3 för mänskliga leverceller i allmänhet, och mänskliga leverceller cancer i synnerhet. Men eftersom AAV3 vektorer även transduce normala humana hepatocyter effektivt 2, skulle deras potentiella användning i cancer genterapi ansökan in vivo påverkas negativt. En möjlig strategi för att kringgå detta potentiella problem handlar transkriptionell inriktning av cancerceller genom att identifiera en gen produkt som selektivt produceras av tumören, men inte av normala hepatocyter. Till exempel har tidigare studier visat att serumnivåerna av α-fetoprotein (AFP) används som en specifik markör för att spåra förekomsten, progression, och / eller återfall av vissa typer av lever-cancer, eftersom normala hepatocyter allmänhet producerar mycket små mängder av detta protein. Vi har faktiskt använt AAV3 vektorer som innehåller AFP initiativtagaren till målet transgenen uttryck i celler levercancer, men inte i normala hepatocyter 2, och studier pågår för att testa effekten av detta synsätt i en murin xenograft modell av levercancer. I våra ytterligare studier har vi konstaterat att det transduktion effektiviteten i olika AAV serotyp vektorer väsentligt kan utökas genom sajt riktad mutagenes av yta exponerad tyrosin rester i den virala capsids 6-14. Eftersom 6 av 7 yta exponerad tyrosines finns också bevarade i AAV3 har vi utfört site-directed mutagenes dessa restprodukter och konstaterade att transduktion effektivitet tyrosin-mutant AAV3 vektorer avsevärt förbättras i mänskliga celler levercancer (opublicerade data). Studier är också närvarande för att utvärdera säkerhet och effekt av tyrosin-mutant AAV3 vektorer i modeller mus xenograft för mänskliga hepatoblastoma och levercancer, och om det lyckas, kan den optimala tyrosin-mutant AAV3 serotyp vektorer visa sig vara användbara för att rikta människor lever cancer för potentiella genterapi.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. R. Jude Samulski och Xiao Xiao för deras vänliga gåvor av rekombinant AAV3 och AAV-EGFP plasmider, respektive, och Dr Gail Tomlinson för generöst att ge Hep293TT celler. Denna forskning stöds delvis av Public Health Service bevilja bidrag R01 HL-076.901, R01 HL-097.088, och P01 DK-058.327 (Projekt 1) från National Institutes of Health (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Salmon sperm DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , Forthcoming (2011).
