Summary
In dit artikel beschrijven we de identificatie van het adeno-geassocieerd virus serotype 3 (AAV3) als de meest efficiënte vector voor het richten van de menselijke lever kankercellen.
Abstract
Recombinante vectoren gebaseerd op een niet-pathogene menselijke parvovirus, hebben de adeno-geassocieerd virus 2 (AAV2) ontwikkeld, en zijn momenteel in gebruik in een aantal klinische proeven van gentherapie. Meer recent hebben een aantal extra AAV serotypen ook geïsoleerd, waarvan is aangetoond dat selectieve weefsel tropisme vertonen in diverse kleine en grote diermodellen 1. Van de 10 meest gebruikte AAV serotypes, AAV3 is verreweg de minst efficiënte in transduceren cellen en weefsels in vitro als in vivo.
Echter, in onze onlangs gepubliceerde studies, hebben we aangetoond dat AAV3 vectoren menselijke lever kanker transduceren - Hepatoblastoma (HB) en hepatocellulair carcinoom (HCC) - cellijnen zeer efficiënt, omdat AAV3 maakt gebruik van menselijke hepatocyt groeifactor receptor als een cellulaire co-receptor voor binding en opneming in deze cellen 2,3.
In dit artikel beschrijven we de stappen die nodig zijn om een hoog rendement transductie van menselijke lever kankercellen te bereiken door middel van recombinant AAV3 vectoren die een reportergen. Het gebruik van recombinant AAV3 vectoren die een therapeutisch gen kan uiteindelijk leiden tot de mogelijke gentherapie van lever kanker bij de mens.
Protocol
1. Verpakken van Recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 (rAAV3) vectoren
- Ga naar de website: " http://www.geguchadze.com/calc "en berekent het bedrag van DNA.
- Pre-mix plasmiden pHelper (adenovirus helper), pACG2c3 (AAV helper) en pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vector) in medium zonder FBS en antibiotica. Totale volume moet 8.750 ul voor tien 15 cm 2 platen worden.
- Voeg direct 1250 ul van PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) in de DNA-oplossing in stap 1.2. Vortex de DNA-PEI oplossing voor een paar seconden.
- Incubeer DNA-PEI oplossing voor een complex formulier voor 5 min bij kamertemperatuur (RT).
- Voeg 1 mL van DNA-PEI oplossing per 15 cm 2 plaat.
- Verwijder medium na 4 uur, te vervangen met vers 25 ml compleet medium +10% FBS (C-DMEM).
- Tweeënzeventig uur na transfectie, schrapen cellen en giet het in een 250 ml konische centrifugebuis.
- Draaien op 3000 rpm, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Giet af supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 5 ml van de RB TMS buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Transfer naar een nieuwe 15 ml conische buis.
- Freeze in droog ijs-ethanol bad gedurende 10 min en ontdooien bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Herhaal dit drie keer.
- Voeg 1 ul van 4,8 M MgCl 2 en 2 pi van Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70.664-3). Vortex en incubeer bij 37 ° C gedurende 40 minuten.
- Spin down bij 4.000 toeren per minuut, bij 4 ° C gedurende 40 min en verzamel de supernatant (geklaarde lysaat).
- In een 13 mL Quick-Seal centrifugebuis (Beckman, Cat # 342413), load iodixanol gradiënt (OptiPrep, Cat # 1114542) van boven naar beneden: 2 ml van 15%, 2 ml van 25%, 1,5 ml van 40% en 1,5 ml van 60% iodixanol. Laad de supernatant (Stap 1.12) op de top van iodixanol verloop. Vul de buizen met RB TMS Buffer.
- Centrifugeer bij 75.000 rpm gedurende 1 uur bij 16 ° C met behulp van Beckman 90Ti rotor.
- Verzamel de 40% iodixanol fractie door het invoegen van een spuit op 40-60% grens.
- Breng de 40% iodixanol fractie in een 50 ml conische buis en tot 40 ml te maken met buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5).
- Monteer de filtratie waarbij gebruik wordt gemaakt HiTrap Q HP kolom (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Was de kolom met de volgende buffer: 25 ml buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 25 ml buffer B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml buffer A; 40 ml van het virus monster in Buffer A, 50 ml buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 20 ml buffer C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5);
- Verzamel Buffer C in een 20 mL Apollo Concentrators (Orbital Biosciences). Centrifugeer bij 3.000 tpm, bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Gooi de doorstroming en voeg 20 ml koud PBS en centrifugeer bij 3.000 toeren per minuut, bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
- Gooi de doorstroming en voeg 500 ul van gekoeld PBS. Was de vectoren af van het membraan en overdracht aan siliconen behandeld Eppendorf buizen en op te slaan bevroren in kleine porties bij -80 ° C.
2. Bepaling van de rAAV3 Vector Titers
- Dooi 10 pi van gezuiverd virus in een Eppendorf buis op ijs. Voeg 40 ul van DDH 2 O.
- Voeg 0,2 ul van Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Neem 50 ul van plasmide standaard (0.2 ng / ul) in een ander eppendorfbuisje.
- Voeg 50 ul van 100 mM NaOH in elke buis en incubeer in 65 ° C gedurende 30 minuten.
- Onmiddellijk Chill op ijs gedurende minstens 5 minuten.
- Snijd overdracht membraan (Millipore, Cat # INYC00010) volgens Bio-Dot Filter Paper (Bio-Rad, Cat # 1620161). Spoel membraan in 10x SSC met drie filter papieren voor 20 minuten.
- Stel slot blot SF Apparatuur (Bio-Dot, Cat # 170 tot 6.542). Verbinding maken met een vacuüm kolf en voeg 100 ul van 10x SSC tot slot blot apparatuur.
- Voeg 100 ul van 20x SSC en 1 pi van 6x laden kleurstof aan elk van de monsters in stap 2.5.
- Belasting 100 pi van elk monster op het membraan in de sleuf blot apparaat.
- Voeg nog een 100 ul van 10x SSC in elk van de monsters.
- Herhaal de stappen 2.9 en 2.10 tot alle monster gaat door het membraan.
- Demonteer de sleuf blot apparaat en verwijder het membraan. Zet het in de Inspector Linker SL-1000 UV Crosslinker. Schakel "Energie", "Optimaal Crosslink" (show 1200) en druk op "Start".
- Kook 1 ml zalmsperma (SS) DNA (Fisher, Cat # NC9753983) gedurende 5 minuten. Chill op ijs gedurende minstens 5 minuten.
- De voorbereiding van de pre-hybridisatie-oplossing door het mengen van 27,5 mL van DDH 2 O, 15 ml 20x SSC, 5 ml van de oplossing 50x Denhardt's, 1,25 ml 20% SDS, 0,25 ml polyA en 1 ml van SS DNA van stap 2.13.
- Hang de membraan in 25 ml van de pre-hybridisatie-oplossing in een bedekte glazen cilinder en incubeer bij 65 ° C in een hybridisatie kamer 's nachts.
- Verdunnen 50 ng DNA-sjablonen in 10 uL van DDH 2 O. Koken bij 100 ° C gedurende 5 min en chillen op het ijs onmiddellijk gedurende minstens 5 minuten.
- Centrifugeer bij 3.000 tpm bij RT gedurende 1 minuut. Voeg 2 ul van 10 mM 3 dNTPs (gebrek aan dCTP), 2 pi van Hexanucleotide Mix (Roche, Cat # 11277081001), 1 ul van Klenow (Roche, Cat # 11008404001) en 5 pi van α -32 P-dCTP. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Centrifuge G-50 kolommen (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) bij 3.000 tpm gedurende 2 minuten. belasting de sonde in stap 2,17 in de kolom. Centrifugeer bij 3.000 tpm gedurende 2 min en het verzamelen van de doorstroming.
- Tellen radioactiviteit. Kook de sonde bij 100 ° C gedurende 5 min en chillen op het ijs onmiddellijk gedurende minstens 5 minuten.
- Voeg de sonde (6x10 5 cpm / ml) in de pre-hybridisatie-oplossing met een membraan.
- Incubeer overnacht bij 65 ° C in een hybridisatie kamer.
- Gooi de hybridisatie-oplossing en spoel het membraan in 2x SSC +0.1% SDS bij RT gedurende 15 minuten.
- Gooi de oplossing en spoel het membraan in 0.1x SSC +0.1% SDS bij 65 ° C gedurende 30 minuten.
- Gooi de oplossing en spoel het membraan in 0.1x SSC bij RT kort.
- Expose de film bij -80 ° C gedurende 6 uur en de ontwikkeling van de film. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 1.
3. rAAV3 Vector-gemedieerde transductie en Transgene expressie in menselijke lever kankercellen
- Zaad 1x10 4 cellen (ofwel Huh7 of Hep293TT) in elke well van de 96-well plaat. Incubeer in een bevochtigde CO 2 incubator voor ten minste 18 uur.
- Verwijder medium uit de 96-well plaat.
- Twee keer wassen cellen met 50 ul van medium zonder FBS en antibiotica en te verwijderen.
- Voeg 50 ul van medium zonder FBS en antibiotica en rAAV vectoren in 5000 VGS / cel.
- Incubeer de platen in de CO 2-incubator gedurende 4 uur.
- Gooi het medium. Twee keer wassen cellen met 50 ul van compleet medium en te verwijderen.
- Voeg 150 ul van C-DMEM aan elk putje en incubeer de plaat in CO 2 incubator gedurende 72 uur, en visualiseer de EGFP expressie met behulp van een fluorescentie microscoop (DMI 4000B, Leica Microsystems).
- Beelden uit de drie bronnen van virus-geïnfecteerde cellen worden kwantitatief geanalyseerd door ImageJ analyse software (NIH, Bethesda, MD, USA).
- Transgen expressie wordt beoordeeld als de totale oppervlakte van groene fluorescentie (pixel 2) per gezichtsveld. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 2.
- Transgen expressie kan ook worden bepaald door middel van flowcytometrie.
4. Representatieve resultaten:
Naar aanleiding van het protocol hierboven beschreven, kan een efficiënt genereren AAV-serotype vectoren. De typische opbrengst is ~ 500 pi met ~ 10 11 VGS / ul van gezuiverde vector voorraad. De zuiverheid van de vector voorraad wordt bepaald door het vergelijken van hybridisatie signalen op kwantitatieve DNA slot blots, met en zonder Benzonase spijsvertering. Gezuiverd rAAV3 vectoren transduceren menselijke lever kanker - Hepatoblastoma (HB) en hepatocellulair carcinoom (HCC) - cellijnen efficiënt.
Figuur 1. Kwantitatieve DNA slot-blot-analyse voor het bepalen van de titers van rAAV3 vectoren. Tweevoudige verdunningen van gezuiverde virale voorraden, verteerd met Benzonase (bovenste rij) werden geanalyseerd op kwantitatieve DNA slot blots met 32 P-gelabelde EGFP-specifieke DNA-probe. De titer van AAV3 vector werd bepaald door vergelijking met een ng (middelste rij) of 10 ng (onderste rij) van AAV-EGFP-plasmide normen geladen op het membraan. De nummers komen overeen met DNA-kopieën.
Figuur 2. Recombinant AAV vector-gemedieerde transgen-expressie in menselijke leverkanker cellen. Hep293TT cellen, een recent opgericht menselijke Hepatoblastoma cellijn 4, werden ofwel mock-geïnfecteerde (linker paneel), of getransduceerd met 5000 VGS / cel van een van beide scAAV2-EGFP of scAAV3-EGFP vectoren bij 37 ° C gedurende 2 uur. Transgenexpressie werd gevisualiseerd 72 uur na transductie met behulp van een fluorescentie microscoop.
Discussion
Recombinante vectoren gebaseerd op een niet-pathogene menselijke parvovirus, het adeno-associated virus (AAV) zijn ontwikkeld, en zijn momenteel in gebruik in een aantal klinische proeven van gentherapie 5. Eerder, van de 10 meest gebruikte AAV serotypen, heeft de transductie efficiëntie van AAV3 vectoren in het algemeen gemeld te zijn bijzonder laag, zowel in vitro als in vivo 1. Echter, onze recente observatie dat AAV3 vectoren transduceren menselijke lever kanker cellijnen buitengewoon goed, als kwantitatief bepaald door middel van flowcytometrie 2, en dat AAV3 maakt gebruik van de menselijke hepatocyt groeifactor receptor (hHGFR) als een cellulaire co-receptor voor de binding en opname in deze 3 cellen, raden een selectieve weefsel-tropisme van AAV3 voor de menselijke levercellen in het algemeen, en menselijke lever-kankercellen in het bijzonder. Echter, ook omdat AAV3 vectoren transduceren normale menselijke hepatocyten efficiënt 2, zouden hun potentieel gebruik in kanker gentherapie toepassing in vivo worden negatief beïnvloed. Een mogelijke strategie om dit potentiële probleem te omzeilen bestaat transcriptionele-targeting van kankercellen door het identificeren van een genproduct dat selectief wordt geproduceerd door de tumor, maar niet door normale hepatocyten. Zo hebben eerdere studies aangetoond dat de serum niveaus van α-foetoproteïne (AFP) worden gebruikt als een specifieke marker voor het bijhouden van de aanwezigheid, progressie en / of herhaling van bepaalde soorten kanker van de lever, omdat de normale hepatocyten produceren in het algemeen zeer kleine hoeveelheden van dit eiwit. Inderdaad, hebben we gebruik gemaakt AAV3 vectoren die de AFP promotor transgen-expressie doel in leverkanker cellen, maar niet in normale hepatocyten 2, en studies zijn momenteel aan de gang om de effectiviteit van deze aanpak te testen in een muis xenograft model van leverkanker. In onze aanvullende onderzoeken, hebben we geconstateerd dat de transductie efficiëntie van de verschillende AAV vectoren serotype kan aanzienlijk worden versterkt door plaats-gerichte mutagenese van het oppervlak belicht tyrosine residuen in de virale capsiden 6-14. Sinds 6 van de 7 oppervlak blootgestelde tyrosines zijn ook geconserveerd in AAV3, hebben wij controlewerkzaamheden uitgevoerd plaats-gerichte mutagenese van deze residuen en merkte op dat de transductie efficiëntie van de tyrosine-mutant AAV3 vectoren aanzienlijk is verbeterd in menselijke lever kankercellen (ongepubliceerde gegevens). Studies zijn momenteel ook gewerkt aan de veiligheid en werkzaamheid van de tyrosine-mutant AAV3 vectoren in de muis xenotransplantaatmodellen voor menselijke Hepatoblastoma en hepatocellulair carcinoom te evalueren en indien succesvol, de optimale tyrosine-mutant AAV3 serotype vectoren kunnen blijken te zijn nuttig voor het richten van menselijke lever kanker voor de potentiële gentherapie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Drs. R. Jude Samulski en Xiao Xiao voor hun vriendelijke gaven van recombinant AAV3 en AAV-EGFP plasmiden, respectievelijk, en dr. Gail Tomlinson voor het verstrekken van ruim Hep293TT cellen. Dit onderzoek werd mede ondersteund door de GGD te verlenen subsidie R01 HL-076901, R01 HL-097088, en de P01 DK-058327 (Project 1) van de National Institutes of Health (AS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Salmon sperm DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H. Jr, Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r, Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , Forthcoming (2011).
