Summary
इस अनुच्छेद में, हम एडिनो - जुड़े वायरस मानव यकृत कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए सबसे कुशल वेक्टर के रूप में 3 (AAV3) सीरोटाइप की पहचान का वर्णन करता है.
Abstract
पुनः संयोजक एक गैर रोगजनक मानव parvovirus पर आधारित वैक्टर, एडिनो - जुड़े वायरस (2 AAV2) विकसित किया गया है, और जीन थेरेपी के नैदानिक परीक्षणों के एक नंबर में वर्तमान में उपयोग में हैं. हाल ही में, अतिरिक्त AAV सीरमप्रकारों की एक संख्या भी अलग - थलग किया गया है, जो विभिन्न छोटे और बड़े जानवर एक मॉडल में ऊतक tropism चयनात्मक प्रदर्शन दिखाया गया है. 10 सबसे अधिक इस्तेमाल किया AAV सीरमप्रकारों, AAV3 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन विट्रो में vivo में कोशिकाओं और ऊतकों transducing में कुशल कम से कम दूर है.
हालांकि, हमारे हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन में, हम प्रलेखित है कि AAV3 वैक्टर मानव यकृत कैंसर transduce - hepatoblastoma (एचबी) और hepatocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) - सेल लाइनों अत्यंत कुशलता क्योंकि AAV3 बाइंडिंग के लिए सेलुलर सह रिसेप्टर के रूप में इस्तेमाल मानव hepatocyte वृद्धि कारक रिसेप्टर इन 2,3 कोशिकाओं में प्रवेश और.
इस अनुच्छेद में, हम पुनः संयोजक AAV3 एक पत्रकार जीन ले जाने वैक्टर द्वारा मानव यकृत कैंसर की कोशिकाओं के पारगमन उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन. रीकॉम्बीनैंट AAV3 एक चिकित्सकीय जीन ले जाने वैक्टर उपयोग अंततः मानव में जिगर के कैंसर के संभावित जीन थेरेपी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
Protocol
1. पुनः संयोजक एडिनो - जुड़े वायरस 3 सीरोटाइप (rAAV3) वैक्टर की पैकेजिंग
- वेबसाइट पर जाएँ: " http://www.geguchadze.com/calc "और डीएनए की मात्रा की गणना .
- पूर्व मिश्रण plasmids pHelper (Adenovirus सहायक), pACG2c3 (AAV सहायक) और pdsAAV सीबी-EGFP (rAAV वेक्टर) मध्यम में FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना. कुल मात्रा दस 15 सेमी 2 प्लेटों के लिए ८७५० μL होना चाहिए .
- 1.2 चरण में डीएनए समाधान में सीधे पी के 1250 μL (0.1% एम / वी, Polysciences, # बिल्ली 23966, पीएच 4.5) जोड़ें. भंवर डीएनए पी समाधान कुछ ही सेकंड के लिए.
- सेते डीएनए पी के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में 5 मिनट के लिए एक जटिल प्रपत्र समाधान.
- डीएनए पी 15 सेमी 2 प्लेट प्रति समाधान के 1 एमएल जोड़ें.
- 4 घंटे के बाद मध्यम निकालें, ताजा 25 एमएल पूरा मध्यम के साथ की जगह 10% FBS (सी DMEM).
- सत्तर दो घंटे बाद अभिकर्मक, परिमार्जन कोशिकाओं और एक 250 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब में डाल देना.
- 3000 rpm पर 4, स्पिन ° सी 10 मिनट के लिए. सतह पर तैरनेवाला डालो.
- पुनः निलंबित आरबी टीएमएस बफर (50 Tris - एचसीएल मिमी, 150 मिमी NaCl, 8.0 पीएच) के 5 एमएल में सेल गोली. एक नया 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण.
- 37 पर 10 मिनट और पिघलना के लिए सूखी बर्फ इथेनॉल स्नान में रुक ° सी 10 मिनट के लिए. तीन बार दोहराएँ.
- 4.8 एम 2 MgCl के 1 μL और Benzonase (25 यू / μL, Novagen, बिल्ली 70664-3 #) के 2 μL जोड़ें. भंवर और 37 में सेते ° सी 40 मिनट के लिए.
- नीचे स्पिन +४,००० rpm पर, 4 बजे ° C 40 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा (स्पष्ट lysate).
- : 15% 2 एमएल, 25% की 2 एमएल, 40% की 1.5 एमएल और एक 13 एमएल त्वरित सील अपकेंद्रित्र ट्यूब (Beckman, 342413 # बिल्ली), ऊपर से नीचे तक लोड iodixanol (OptiPrep, बिल्ली 1114542 #) ढाल 60% iodixanol की 1.5 एमएल. सतह पर तैरनेवाला (1.12 चरण) iodixanol ढाल के शीर्ष पर लोड. ट्यूबों आरबी टीएमएस बफर के साथ भरें.
- 16 पर 1 घंटे के लिए 75,000 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस के Beckman 90Ti रोटर का उपयोग.
- 40-60% की सीमा पर एक सिरिंज डालने से 40% iodixanol अंश लीजिए.
- एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 40% iodixanol अंश पर स्थानांतरण और 40 एमएल के लिए बफर के साथ (20 मिमी Tris, 15 मिमी NaCl, पीएच 8.5).
- निस्पंदन तंत्र HiTrap क्यू हिमाचल प्रदेश स्तंभ (जीई हेल्थकेयर, बिल्ली 17-1154-01 #) का उपयोग कर इकट्ठा. निम्नलिखित बफर के साथ स्तंभ धो: बफर के 25 एमएल (20 मिमी, Tris 15 मिमी NaCl, पीएच 8.5);; बफर बी (10 मिमी Tris, 500 मिमी NaCl, पीएच 8.5) के 25 एमएल, एक बफर के 50 एमएल बफर में 40 एमएल वायरस के नमूने के एक, बफर के 50 एमएल (20 मिमी, Tris 15 मिमी NaCl, पीएच 8.5);; बफर सी (20 मिमी Tris, 175 मिमी NaCl, पीएच 8.5) के 20 एमएल
- एक 20 एमएल अपोलो concentrators (कक्षीय बायोसाइंसेज) में बफर सी लीजिए. 3000 rpm पर 4 अपकेंद्रित्र, डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए.
- प्रवाह के माध्यम से त्यागें और ठंडा पीबीएस के 20 एमएल और अपकेंद्रित्र 3,000 rpm पर जोड़ने के लिए, 4 बजे ° C 10 मिनट के लिए.
- प्रवाह के माध्यम से त्यागें और ठंडा पीबीएस के 500 μL जोड़ें. वैक्टर झिल्ली और हस्तांतरण सिलिकॉन इलाज Eppendorf ट्यूब और दुकान में जमे हुए -80 पर छोटे aliquots डिग्री सेल्सियस से बंद धो
2. RAAV3 वेक्टर titers के निर्धारण
- एक Eppendorf ट्यूब में बर्फ पर वायरस शुद्ध 10 μL पहले गला लें. DDH 2 ओ के 40 μL जोड़ें
- Benzonase (25 यू / μL, Novagen, 70664 # कैट) के 0.2 μL जोड़ें और 37 पर सेते ° C 1 घंटे के लिए.
- अन्य Eppendorf ट्यूब में प्लाज्मिड मानक (0.2 एनजी / μL) के 50 μL ले लो.
- प्रत्येक ट्यूब और 65 में डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए सेते में 100 मिमी NaOH के 50 μL जोड़ें.
- कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर तुरंत चिल.
- जैव डॉट फ़िल्टर पेपर (जैव रेड, 1620161 # कैट) के अनुसार हस्तांतरण झिल्ली (Millipore, कैट INYC00010 #) काटें. 20 मिनट के लिए तीन फिल्टर कागजात के साथ 10x एसएससी में झिल्ली कुल्ला.
- स्लॉट दाग एस एफ उपकरण (जैव डॉट # बिल्ली 170-6542) सेट करें. एक वैक्यूम फ्लास्क से कनेक्ट और स्लॉट दाग तंत्र के लिए 10x एसएससी के 100 μL जोड़ें.
- 2.5 चरण में नमूने के प्रत्येक के लिए 20x एसएससी के 100 μL और 6x लोड हो रहा है डाई की एक μL जोड़ें.
- स्लॉट दाग तंत्र में झिल्ली पर प्रत्येक नमूने के 100 μL लोड.
- नमूने के प्रत्येक में 10x एसएससी का एक और 100 μL जोड़ें.
- 2.9 और 2.10 चरण दोहराएँ जब तक सभी नमूना झिल्ली के माध्यम से चला जाता है.
- स्लॉट दाग तंत्र जुदा और झिल्ली को हटा दें. यह निरीक्षक Linker SL-1000 यूवी Crosslinker में रखो. "ऊर्जा" पर बारी करने के लिए, "इष्टतम Crosslink" (1200 शो) और "प्रारंभ" धक्का.
- उबाल लें सामन शुक्राणु के 1 एमएल (एस एस) डीएनए (फिशर बिल्ली NC9753983 #) के 5 मिनट के लिए. कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर शांत रहो.
- DDH 2 हे, 15 की एमएल के 27.5 एमएल मिश्रण से पूर्व - संकरण समाधान तैयार एसएससी 20x, 50x है Denhardt समाधान के 5 एमएल, 20% एसडीएस 1.25 एमएल Pólya के 0.25 एमएल और 2.13 कदम से 1 एमएल एस एस डीएनए.
- एक छाया कांच और 65 ° सी एक संकरण कक्ष में रातोंरात पर सिलेंडर सेते में 25 पूर्व संकरण समाधान के एमएल में झिल्ली निलंबित.
- DDH 2 हे के 10 μL में 50 एनजी डीएनए टेम्पलेट्स पतला. 100 में उबाल लें डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट और बर्फ पर ठंड कम से कम 5 मिनट के लिए तुरंत.
- आरटी में 3,000 rpm पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. 2 μL 10 मिमी 3 dNTPs (dCTP कमी), Hexanucleotide मिक्स के 2 μL (Roche, 11277081001 # बिल्ली), 1 Klenow की μL (Roche, 11008404001 # कैट) और पी -32 - dCTP α 5 μL जोड़ें. 37 डिग्री 10 मिनट के लिए सी सेते हैं.
- 2 मिनट के लिए 3,000 rpm पर जी 50-स्तंभ (जीई हेल्थकेयर, कैट 27-5330-01 #) अपकेंद्रित्र. 2.17 चरण में स्तंभ में जांच लोड. 2 मिनट के लिए 3,000 rpm पर अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
- रेडियोधर्मिता की गणना. 100 पर कम से कम 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 5 मिनट और बर्फ पर ठंड के लिए तुरंत जांच उबाल लें.
- झिल्ली के साथ संकरण पूर्व समाधान की जांच जोड़ें (6x10 सीपीएम 5 / एमएल).
- एक संकरण कक्ष में 65 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं.
- संकरण समाधान त्यागें और आरटी पर 15 मिनट के लिए 2x एसएससी 0.1% एसडीएस में झिल्ली कुल्ला.
- समाधान त्यागें और 65 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए 0.1x एसएससी 0.1% एसडीएस में झिल्ली कुल्ला.
- समाधान त्यागें और आरटी संक्षेप में 0.1x एसएससी में झिल्ली कुल्ला.
- -80 ° सी में 6 घंटे के लिए फिल्म और फिल्म बेनकाब विकसित. एक ठेठ परिणाम चित्र 1 में दिखाया गया है.
3. rAAV3 वेक्टर की मध्यस्थता transduction और मानव यकृत कैंसर की कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति
- बीज 1x10 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में 4 कोशिकाओं (या तो Huh7 या Hep293TT). कम से कम 18 घंटे के लिए एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते हैं .
- 96 अच्छी तरह से थाली से मध्यम निकालें.
- कोशिकाओं FBS और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 50 μL माध्यम के साथ दो बार और धो हटायें.
- FBS और 5000 vgs / सेल पर एंटीबायोटिक दवाओं और rAAV वैक्टर बिना माध्यम के 50 μL जोड़ें.
- सीओ 2 इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए प्लेटों का सेते हैं .
- मध्यम त्यागें. कोशिकाओं को पूरा माध्यम के 50 μL के साथ दो बार और धो हटायें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से सी DMEM के 150 μL जोड़ें और 72 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं, और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग EGFP अभिव्यक्ति कल्पना (डीएमआई 4000B, Leica माइक्रोसिस्टम्स) .
- वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के तीन कुओं से छवियाँ मात्रात्मक ImageJ विश्लेषण सॉफ्टवेयर (NIH, Bethesda, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) के द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं.
- Transgene अभिव्यक्ति हरी प्रतिदीप्ति के दृश्य क्षेत्र के अनुसार कुल क्षेत्र (2 पिक्सेल) के रूप में मूल्यांकन किया है. एक ठेठ परिणाम चित्रा 2 में दिखाया गया है.
- Transgene अभिव्यक्ति भी प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद, एक AAV सीरोटाइप वैक्टर कुशलता से उत्पन्न कर सकते हैं. ठेठ उपज है ~~ 500 μL ~ vgs 11 10 युक्त / सदिश शेयर शुद्ध μL. वेक्टर शेयर की शुद्धता मात्रात्मक डीएनए स्लॉट blots पर संकरण संकेतों की तुलना के साथ, और Benzonase पाचन के बिना निर्धारित किया जाता है. (एचबी) hepatoblastoma और hepatocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) - सेल लाइनों कुशलतापूर्वक rAAV3 वैक्टर transduce मानव यकृत कैंसर शुद्ध.
चित्रा 1 rAAV3 वैक्टर titers का निर्धारण करने के लिए मात्रात्मक डीएनए विश्लेषण स्लॉट के दाग. मात्रात्मक डीएनए स्लॉट blots पर 32 पी लेबल डीएनए EGFP विशेष जांच के साथ वायरल स्टॉक, Benzonase (शीर्ष पंक्ति) के साथ पचा शुद्ध दो गुना dilutions विश्लेषण किया गया. AAV3 वेक्टर के टिटर 1 (मध्य पंक्ति) एनजी या AAV-EGFP प्लाज्मिड झिल्ली पर लोड मानकों के 10 एनजी (नीचे पंक्ति) के साथ तुलना से निर्धारित किया गया था. संख्या डीएनए प्रतियां के अनुरूप.
चित्रा 2. पुनः संयोजक AAV वेक्टर मध्यस्थता मानव यकृत कैंसर की कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति . Hep293TT कोशिकाओं, एक हाल ही में स्थापित मानव hepatoblastoma सेल 4 लाइन, या तो पैनल (बाएँ) नकली संक्रमित थे, या 2 घंटे के लिए 37 ° C पर या तो scAAV2 EGFP या scAAV3-EGFP वैक्टर के 5,000 / vgs सेल के साथ transduced . Transgene अभिव्यक्ति 72 के बाद पारगमन घंटे एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने के लिए कल्पना.
Discussion
पुनः संयोजक गैर रोगजनक मानव parvovirus, एडिनो - जुड़े वायरस (AAV) पर आधारित वैक्टर विकसित किया गया है, और जीन थेरेपी के नैदानिक परीक्षण 5 का एक संख्या में उपयोग वर्तमान में कर रहे हैं. इससे पहले, 10 सबसे अधिक इस्तेमाल किया AAV सीरमप्रकारों के सामान्य में AAV3 वैक्टर पारगमन क्षमता दोनों इन विट्रो में और vivo में 1, विशेष रूप से कम सूचित किया गया है. हालांकि, हमारे हाल ही के अवलोकन है कि AAV3 transduce मानव यकृत कैंसर कोशिका लाइनों को बेहद अच्छी तरह वैक्टर, के रूप में प्रवाह cytometry 2 द्वारा मात्रात्मक निर्धारित है, और कि AAV3 बंधन और इन में प्रवेश के लिए एक सेलुलर सह रिसेप्टर के रूप में मानव hepatocyte वृद्धि कारक रिसेप्टर (hHGFR) का इस्तेमाल 3 कोशिकाओं, दृढ़ता से विशेष रूप से सामान्य में मानव जिगर की कोशिकाओं के लिए एक चयनात्मक AAV3 के ऊतक tropism, और मानव यकृत कैंसर की कोशिकाओं का सुझाव देते हैं. हालांकि, बाद से AAV3 वैक्टर भी सामान्य मानव hepatocytes 2 कुशलता transduce, उनके vivo में कैंसर जीन थेरेपी आवेदन में संभावित उपयोग नकारात्मक असर पड़ा होगा. एक संभावित रणनीति इस संभावित समस्या को दरकिनार शामिल transcriptional लक्ष्यीकरण है कि चुनिंदा ट्यूमर द्वारा निर्मित है एक जीन उत्पाद की पहचान के द्वारा कैंसर की कोशिकाओं की सामान्य hepatocytes से नहीं बल्कि. उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि α fetoprotein (एएफपी) के सीरम स्तर उपस्थिति, प्रगति, और / या जिगर के कैंसर के कुछ प्रकार के reoccurrence पर नज़र रखने के लिए एक विशिष्ट मार्कर के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं, क्योंकि सामान्य hepatocytes आम तौर पर की बहुत छोटी मात्रा का उत्पादन इस प्रोटीन. दरअसल, हम AAV3 एएफपी प्रमोटर युक्त यकृत कैंसर की कोशिकाओं में transgene अभिव्यक्ति लक्ष्य वैक्टर का इस्तेमाल किया है, लेकिन सामान्य 2 hepatocytes, और अध्ययन में नहीं वर्तमान में कर रहे हैं यकृत कैंसर का एक murine xenograft मॉडल में इस दृष्टिकोण की प्रभावकारिता का परीक्षण चल रहा. हमारे अतिरिक्त अध्ययन में, हम देखा है कि विभिन्न AAV सीरोटाइप वैक्टर के पारगमन क्षमता काफी साइट निर्देशित 6-14 वायरल capsids में सतह उजागर tyrosine अवशेषों के mutagenesis के द्वारा संवर्धित किया जा सकता है है . चूंकि 6 7 की सतह उजागर tyrosines भी AAV3 में संरक्षित कर रहे हैं, हम साइट निर्देशित इन अवशेषों के mutagenesis प्रदर्शन किया है और कहा है कि tyrosine उत्परिवर्ती AAV3 वैक्टर पारगमन क्षमता मानव यकृत कैंसर की कोशिकाओं (अप्रकाशित डेटा) में काफी बढ़ाया है. अध्ययनों से यह भी वर्तमान और tyrosine उत्परिवर्ती मानव hepatoblastoma और hepatocellular कार्सिनोमा के लिए माउस xenograft मॉडल में AAV3 वैक्टर की सुरक्षा और प्रभावकारिता का मूल्यांकन चल रहा है, और अगर सफल, इष्टतम tyrosine उत्परिवर्ती AAV3 सीरोटाइप वैक्टर मानव यकृत को लक्षित करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है संभावित जीन थेरेपी के लिए कैंसर.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम डीआरएस धन्यवाद. आर जूदास Samulski और रीकॉम्बीनैंट AAV3 और AAV-EGFP plasmids, क्रमशः, और डॉ. गैल Tomlinson की उदारता Hep293TT कोशिकाओं प्रदान करने के लिए अपने तरह के तोहफे के लिए जिओ जिओ. इस शोध में भाग सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा अनुदान अनुदान HL-076,901 R01, R01 HL 097,088, और P01 डी.के. +०५८३२७ (परियोजना 1) राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से (के लिए के रूप में) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | |
| PEI | Polysciences, Inc. | 23966 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | 70664-3 | |
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | |
| Salmon sperm DNA | Fisher Scientific | NC9753983 | |
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | |
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
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