Summary
Lyme रोग अनुसंधान अध्ययन अक्सर रोगज़नक़ Borrelia burgdorferi, एक प्रक्रिया है कि आमतौर पर कई सप्ताह लगते के साथ संक्रमित ticks की पीढ़ी की आवश्यकता है. यहाँ हम एक टिक microinjection आधारित संक्रमण प्रक्रिया है कि घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है प्रदर्शित करता है. हम भी ticks भीतर बी burgdorferi के स्वस्थानी स्थानीयकरण में एक के लिए immunofluorescence विधि का प्रदर्शन.
Abstract
Lyme रोग spirochete रोगज़नक़ Borrelia burgdorferi, जो प्रकृति में संक्रमण टिकटिक कृंतक एक चक्र के द्वारा बनाए रखा है के साथ संक्रमण के कारण होता है. एक टिक जनित murine 2 मॉडल Lyme रोग प्रयोगशाला में अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. जबकि भोले ticks बी से संक्रमित किया जा सकता है है burgdorferi उन्हें संक्रमित चूहों पर खिला द्वारा कई हफ्तों molting प्रक्रिया महीने के लिए पूरा करने के लिए लेता है . इसलिए, एक microinjection आधारित प्रक्रिया के रूप में और अधिक तेजी से और कुशल टिकटिक संक्रमण तकनीक, के विकास Lyme रोग 3,4 के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है. प्रक्रिया केवल घंटे संक्रमित ticks उत्पन्न करने के लिए की आवश्यकता है और ticks की एक पलटन में spirochetes के बराबर मात्रा में के वितरण पर नियंत्रण की अनुमति देता है. यह विशेष रूप से बी की पीढ़ी के रूप में महत्वपूर्ण है burgdorferi प्राकृतिक खिला चूहों प्रक्रिया का उपयोग कर के द्वारा संक्रमित ticks खिलाया ticks के बीच 100% संक्रमण दर और रोगज़नक़ बोझ से भिन्नता में संभावित परिणाम को सुनिश्चित करने में विफल रहता है. इसके अलावा, microinjection बी के साथ ticks संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है burgdorferi मामलों में जहां एक तनु तनाव चूहों में संक्रमण की स्थापना करने में असमर्थ है और इस तरह स्वाभाविक रूप से 5 ticks द्वारा नहीं प्राप्त किया जा सकता में आइसोलेट्स. इस तकनीक को भी ticks में अन्य जैविक सामग्री की एक किस्म देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, विशिष्ट एंटीबॉडी या डबल 6 शाही सेना फंसे. इस अनुच्छेद में, हम साथ में बी इन विट्रो हो nymphal ticks के microinjection प्रदर्शन करेंगे burgdorferi. हम भी टिकटिक confocal immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग पेट में Lyme रोग रोगजनकों के स्थानीयकरण के लिए एक विधि का वर्णन करेंगे.
Protocol
1. Nymphal Ixodes scapularis Ticks के Microinjection
1. तैयारी सुई
- हीटिंग और कांच micropipette डांड़ी डिवाइस (Narishige) में 1 मिमी गिलास केशिका ट्यूब (विश्व परिशुद्धता उपकरण) खींच से कई microinjection सुइयों बनाना. ध्यान नाजुक केशिका ट्यूब हटा दें.
- स्टोर एक पेट्री डिश में चिपकने वाला टेप पर सुइयों (टिप ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ) खींच लिया.
2. बी की तैयारी burgdorferi
- बी आगे बढ़ें BSK संस्कृति मीडिया 7 में burgdorferi एमएल प्रति 10 के बारे में 7 कोशिकाओं के एक एकाग्रता से कम जब तक. Spirochetes एक अंधेरे क्षेत्र खुर्दबीन के तहत एक Petroff Hausser गिनती कक्ष (Hausser वैज्ञानिक) के उपयोग से गिने जाते हैं.
- गोली बी कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,000 XG पर centrifugation द्वारा burgdorferi .
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और पूरी तरह से धीरे से एक 200 μL बाँझ microtip के माध्यम से एमएल प्रति 10 9 कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता से गुजर रहा BSK मीडिया में गोली resuspend. चूंकि उच्च घनत्व सेल में कोशिकाओं resuspended हैं, और पेड़ों का झुरमुट, सेल निलंबन किया जाना चाहिए सकता है microinjection के लिए तुरंत इस्तेमाल किया.
3. तैयारी ticks
- एक गिलास स्लाइड पर स्पष्ट, चिपकने वाला डबल पक्षीय टेप रखें.
- एक चिपचिपा चटाई पर कार्य करना, ध्यान से एक छोटे से ब्रश का उपयोग कर कंटेनर से nymphal ticks हटा दें.
- Ticks के अपेक्षित संख्या प्लेस चिपकने वाली टेप, उदर पक्ष पर इंजेक्शन जा ऊपर, एक ही दिशा का सामना करना पड़ रहा है.
4. इंजेक्शन ticks
- लोड बी के 5 μL burgdorferi खींच केशिका सुई का उपयोग कर एक 20 μL microloader विंदुक टिप (Eppendorf) में संस्कृति. फंस हवाई बुलबुले के लिए सुई का निरीक्षण किया और बैक्टीरियल संस्कृति के साथ सुई पुनः लोड, यदि आवश्यक.
- विदारक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के तहत टिक देखें और टिकटिक गुदा एपर्चर क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित. धीरे केशिका सुई की नोक को छूने के क्रम में ट्यूब जहां व्यास टिकटिक गुदा एपर्चर तुलना में थोड़ा छोटा है, microinjection सुई बनाने को तोड़ने. यह कदम महत्वपूर्ण है के रूप में किसी भी गैर उपयुक्त सुई टिप के साथ ticks इंजेक्षन करने की कोशिश इंजेक्शन टिक की चोट और संभव मौत का कारण बनता है.
- विदारक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के तहत immobilized ticks प्लेस और गुदा एपर्चर है, जो दो चल गुदा प्लेटों द्वारा कवर किया जाता है पर ध्यान केंद्रित. ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे से स्पर्श और गुदा एपर्चर के पास किसी भी क्षेत्र के लिए बहुत ही हल्के दबाव लागू. इस गुदा प्लेटों और गुदा ताकना है कि पेट को जोड़ता के उद्घाटन की जुदाई की अनुमति देगा. ध्यान से सुई की नोक थोड़ा गुदा प्लेटों के लिए मजबूर खोलने के माध्यम से गुदा एपर्चर में सम्मिलित. सुई प्रविष्टि एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए के रूप में गिलास टिप अर्द्धपारदर्शी hindgut कि मलाशय को जोड़ता खराब कर सकती हैं. एक स्वचालित पैर नियंत्रण (Eppendorf) के साथ सुसज्जित microinjector का प्रयोग, बी इंजेक्षन १,००० hectopascals (एचपीए) इंजेक्शन दबाव, 0.2 सेकंड इंजेक्शन समय और 8 इंच मुआवजा दबाव: burgdorferi निम्न पैरामीटर का उपयोग समाधान . प्रत्येक टिक एक इंजेक्शन प्राप्त करता है.
- Microinjection के बाद, ticks पूर्व इंजेक्शन राज्य के लिए समान व्यवहार करना चाहिए. उदाहरण के लिए, टिकटिक उत्तेजनाओं के जवाब में क्रॉल करना चाहिए.
- हम आम तौर पर ticks 48 घंटे के लिए एक पर्यावरण कक्ष में 24 पर सेट ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं ° 16 घंटे / / प्रकाश अंधेरे photoperiod आहार 8 घंटे और 95% आर्द्रता के साथ सी. यदि एक कक्ष उपलब्ध नहीं है, इंजेक्शन ticks एक हवा तंग कंटेनर के भीतर नम स्थितियों, जैसे एक नियमित desiccator चैम्बर में कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है. यदि आवश्यक हो, ticks की वसूली समय भी कुछ घंटों के लिए छोटा किया जा सकता है पहले चूहों पर खिलाने के लिए इस्तेमाल किया.
2. बी Confocal immunofluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा burgdorferi स्थानीयकरण
1. विदारक ticks
- फॉस्फेट की एक छोटी बूंद प्लेस माइक्रोस्कोपी के लिए एक पाली एल lysine लेपित स्लाइड (सिग्मा) पर एक विच्छेदन और एक अन्य के लिए एक साफ कांच की स्लाइड पर खारा (पीबीएस ) buffered. डबल पक्षीय चिपकने वाला टेप के साथ एक गिलास स्लाइड तैयार.
- कंटेनर और दो तरफा चिपकने वाला टेप पर जगह एक छोटे से ब्रश का उपयोग कर से टिकटिक निकालें.
- देखें और विच्छेदन माइक्रोस्कोप में टिक ध्यान केंद्रित. पैरों के पहले और दूसरे जोड़े के बीच टिक पर एक तेज धार रखें. नीचे प्रेस दृढ़ता से दो पेट के लिए उपयोग की अनुमति टुकड़ों में टिक काटने. तत्काल, पीबीएस की एक छोटी बूंद में पेट डूब.
- बहुत ठीक संदंश का प्रयोग, कटौती की साइट के आसपास पृष्ठीय और उदर exoskeleton हड़पने. ध्यान पृष्ठीय ढाल खींच और भूरा रंग पेट diverticula उजागर टिकटिक से दूर. सभी समय पर पीबीएस के तहत विदारक ticks रखने के लिए सावधान रहें.
- अर्द्ध पारदर्शी लार ग्रंथि रोटीdles पेट के पूर्वकाल क्षेत्र के दोनों ओर स्थित हैं, और इस बिंदु पर हटाया जा सकता है, यदि वांछित. संदंश के साथ जगह में शेष exoskeleton होल्डिंग, ध्यान से पेट से पेट बाहर खींच.
- किसी भी फंस (उदाहरण के लिए, ट्रेकिआ) ऊतकों को हटाने के द्वारा धीरे पेट साफ.
- ठीक संदंश के टिप का उपयोग करना, जल्दी पीबीएस की एक छोटी बूंद में पाली एल Lysine एक गिलास स्लाइड पर टिक पेट हस्तांतरण. छोटे ठीक ब्लेड का उपयोग कर टुकड़ों में अलग पेट या धीरे ठीक संदंश के टिप के साथ दबाने. ध्यान से पेट के ऊतकों के आसपास अतिरिक्त पीबीएस aspirate.
- पेट के ऊतकों कमरे के तापमान पर शुष्क हवा करने की अनुमति दें.
- 10 मिनट के लिए एसीटोन में submerging द्वारा टिकटिक पेट ठीक. कमरे के तापमान पर शुष्क हवा की अनुमति दें. स्लाइड्स इस कदम पर महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है एक हवा तंग कंटेनर में -20 डिग्री सेल्सियस में.
2. धुंधला हो जाना
- टिशू पेपर का प्रयोग, ऊतक के आसपास अतिरिक्त नमी को हटा दें और पैप पेन या किसी भी हाइड्रोफोबिक बाधा अस्तर डिवाइस के द्वारा सूखे टिकटिक पेट के चारों ओर एक वृत्त खींचना. यह बाद ऊष्मायन चरणों के दौरान धुंधला समाधान को बनाए रखने में मदद मिलेगी.
- एक या एक से अवरुद्ध बफर की कुछ बूँदें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए (0.05% बीच-20, 5% पीबीएस में बकरी सीरम) के साथ टिक पेट कवर. सीरम रोकने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए मेजबान जानवर के स्रोत पर निर्भर करता है. स्लाइड इस बात से सूखे के लिए आगे की अनुमति न दें.
- धीरे धीरे अवरुद्ध बफर aspirate. उचित प्राथमिक और / या माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ पेट सेते हैं. विरोधी बी लेबल - हम fluorescein (FITC) आइसोथियोसाइनेट का उपयोग कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में एक 1:100 कमजोर पड़ने पर burgdorferi एंटीबॉडी (Kirkegaard और पेरी प्रयोगशालाओं). कंटेनर एल्यूमीनियम प्रकाश में निवेश की सीमा पन्नी के साथ कवर.
- कोमल आकांक्षा से एंटीबॉडी समाधान निकालें. लेबल 4 के रूप में टिक ऊतकों, के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई '(DAPI) ,6-diamidino-2 - phenylindole या propidium आयोडाइड के साथ पेट सेते हैं. हम आम तौर पर पीबीएस में 5 मिनट के लिए 20 μg / एमएल propidium आयोडाइड (सिग्मा) का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर.
- 0.05% पीबीएस में बीच-20 के साथ 3 बार धोएं.
- बफर ग्लिसरॉल में स्लाइड Slowfade (Invitrogen) के रूप में एक antifade अभिकर्मक युक्त पर्वत और ध्यान से एक गिलास coverslip के साथ कवर. स्लाइड एक हवा तंग कंटेनर के भीतर 4 पर कुछ महीनों के लिए इस कदम ° सी में संग्रहीत किया जा सकता है. छवि और बी स्थानीयकरण एक confocal खुर्दबीन के तहत burgdorferi .
3. प्रतिनिधि परिणाम
Microinjection के लिए एक nymphal टिक की स्थिति और एक छवि का प्रतिनिधित्व बी टिकटिक पेट में burgdorferi स्थानीयकरण चित्र 1 में प्रस्तुत किया है .
चित्रा 1. Microinjection और बी के स्थानीयकरण टिकटिक पेट में burgdorferi.
(ए) एक nymphal I. के ventral दृश्य scapularis टिकटिक microinjection के लिए तैनात है . गुदा डाला microinjection सुई (तीर) के साथ एपर्चर (arrowhead) इनसेट में आवर्धन के तहत दिखाया गया है. एक ठीक forcep शरीर है, जो गुदा प्लेटें और microinjection के लिए गुदा ताकना के उद्घाटन की जुदाई की अनुमति कोमल दबाव लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सुई Coomassie शानदार नीले के समाधान के लिए दृश्यता को बढ़ाने के साथ भरा है. (बी) बी confocal immunofluorescence इमेजिंग के प्रतिनिधि परिणाम टिकटिक पेट के भीतर burgdorferi. एक आंत diverticulum के पूर्वकाल क्षेत्र दिखाया है. आंत नाभिक और spirochetes (तीर) propidium (लाल रंग) आयोडाइड या FITC संयुग्मित विरोधी - बी के साथ लेबल रहे हैं (हरे रंग) क्रमशः burgdorferi,. बार = 20 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
यहाँ हम nymphal Ixodes ticks के तेजी से और कुशल संक्रमण के लिए जीवाणु रोगज़नक़ बी के साथ एक microinjection आधारित प्रक्रिया का प्रदर्शन burgdorferi. हम भी बी का पता लगाने के लिए एक confocal immunofluorescence प्रक्रिया का वर्णन बगल में टिक पेट में burgdorferi. हालांकि हमारे प्रदर्शन nymphal आंत शामिल है, इसी तरह की प्रक्रिया भी ticks के अन्य विकास जैसे, चरणों लार्वा या 8,9 वयस्कों के लिए लागू कर रहे हैं. हालांकि, अपने छोटे आकार के कारण, तकनीक अपेक्षाकृत लार्वा में उपयोग के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, लेकिन हो सकता है अच्छी तरह से वयस्क ticks में उपयोग के लिए लागू किया जाना चाहिए. बी के साथ ticks के कृत्रिम संक्रमण के अन्य तरीकों burgdorferi गिलास केशिका 10 ट्यूबों के माध्यम से खिला के रूप में या संस्कृति में विसर्जन 11 मध्यम के द्वारा विकसित किया गया है,. इन तरीकों में कुशल, सरल और अपेक्षाकृत सस्ती हैं. हालांकि, इन प्रक्रियाओं बी के अपेक्षाकृत अनियंत्रित हस्तांतरण पर भरोसा करते हैं व्यक्तिगत ticks में burgdorferi और इस प्रकार संभावित बराबर रोगज़नक़ बोझ के साथ पीड़ित ticks के साथियों पैदा करने में सीमित कर रहे हैं. उत्तरार्द्ध कमी काफी अधिक microinjection जैसे नियंत्रित वितरण प्रक्रियाओं, के द्वारा दूर किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित हस्तांतरण बी करने के लिए इस प्रक्रिया को रोजगार burgdorferi प्रक्रिया लगभग 100% की संक्रमण दर के साथ ticks, और सबसे ticks में जीवित रहते हैं . इंजेक्ट ticks महीने के लिए कई हफ्तों के लिए प्रयोगशाला में रखा जा सकता है, या तुरंत चूहों पर लालच से खाना और बी संचारित करने की अनुमति दी burgdorferi संक्रमण. दक्षता और बी के कैनेटीक्स microinjected ticks से burgdorferi संचरण कि स्वाभाविक रूप से संक्रमित ticks के समान हैं, और इसलिए, कृत्रिम टिकटिक संक्रमण प्रक्रियाओं हमारे टिक जनित Lyme borreliosis अध्ययन के प्रयासों में सहायता करने की संभावना है. इसके अतिरिक्त, इसी तरह microinjection तकनीक भी संबंधित प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए लागू किया गया है, उदाहरण के लिए, शाही सेना के हस्तक्षेप की मध्यस्थता 6,9,12 ticks के आनुवंशिक हेरफेर .
Ticks की अपरिपक्व चरणों के Microinjection एक अपेक्षाकृत नाजुक प्रक्रिया है. इस प्रकार यह सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि ticks बी के साथ इंजेक्शन burgdorferi प्रयोगों के अगले सेट करने के लिए आगे बढ़ने से पहले स्वस्थ हैं. पोस्ट इंजेक्शन ticks कि पैर मुकर है और उत्तेजनाओं, जैसे सांस exhaled या एक ब्रश के साथ छू अनुत्तरदायी, आगे के प्रयोगों के लिए नहीं किया जाना चाहिए. इन सबसे मृत होने की संभावना या इंजेक्शन आघात से मरने की कगार पर हैं. हमने पाया है कि सुई टिप और इंजेक्शन मापदंडों के आकार प्रक्रिया में दो बड़ा सुई सुझावों और इंजेक्शन संस्करणों के रूप में महत्वपूर्ण कारकों संभावित उच्च टिकटिक मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप आंत की दीवार टूटना. यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि यहाँ वर्णित microinjection सेटिंग्स मुख्य रूप से बी इंजेक्शन के लिए अनुकूलित कर रहे हैं burgdorferi BSK मीडिया में निलंबित कर दिया. एंटीबॉडी या केंद्रित आरएनए समाधान के रूप में अन्य जैविक सामग्री, तरल पदार्थ दलदलापन में अलग हो सकता है. अन्य सामग्री के लिए इष्टतम microinjection सेटिंग्स, मुख्य रूप से इंजेक्शन के दबाव और इंजेक्शन समय, empirically निर्धारित किया की जरूरत है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम ईमानदारी से इस प्रदर्शन की तैयारी के साथ सहायता के लिए पाल प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. इस अध्ययन PHS AI076684 और अनुदान NIH / NIAID से AI080615 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
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