Summary
ライム病の調査研究は、多くの場合、病原体ボレリアブルグドルフェリ、通常は数週間かかるプロセスに感染したダニの発生を必要とする。ここでは、時間内で達成可能なマイクロインジェクションベースのダニの感染症の手順を示しています。我々はまた、ダニの中でB.ブルグドルフェリのin situ局在のための免疫蛍光法を示しています。
Abstract
ライム病はダニ媒介げっ歯類の感染サイクル1で自然に維持されるスピロヘータの病原体ボレリアブルグドルフェリ 、感染によって引き起こされる。ダニ媒介性マウスモデル2は、実験室でライム病を研究するために開発されました。素朴なダニはB.に感染することができますが、 ブルグドルフェリは、感染マウスにそれらを供給することにより、脱皮のプロセスが完了するまでに数ヶ月に数週間かかる。したがって、このようなマイクロインジェクションベースの手続きとして、より迅速かつ効率的なダニの感染のテクニック、、の開発は、ライム病3,4の研究のための重要なツールです。手順は時間が感染したダニを生成するために必要とし、ダニのコホートにおけるスピロヘータの等量の配信を制御できます。これは、B.の世代としては特に重要です。マウスを使って自然な給餌法によるブルグドルフェリ感染したダニは葉ダニの間で病原体の負担の変動で100％の感染率と潜在的に結果を確実に失敗します。さらに、マイクロインジェクションは、B.とダニに感染するために使用することができます。 ブルグドルフェリは、弱毒株は、マウスでは感染を確立できないため、自然にダニ5によって取得できない場合には隔離。この手法はまた、例えば、特異的な抗体または二重のRNA 6座礁、ダニに他の生物学的、さまざまな素材を提供するために使用することができます。この記事では、Bをin vitroで成長にと若ダニのマイクロインジェクションのデモンストレーションを行いますブルグドルフェリ 。我々はまた、共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いてダニの腸内のライム病の病原体の局在化のための方法を説明します。
Protocol
1。若虫マダニ属のマイクロインジェクションscapularisダニ
1。準備針
- 加熱とガラスマイクロピペットプラー装置（成茂）に1mmのガラス毛細管（世界の精密機器を）引いて、いくつかのマイクロインジェクションの針を作製する。慎重に壊れやすいキャピラリーチューブを取り外します。
- ストアは、ペトリ皿の中で粘着テープで針を（先端を上に向けた状態で）引っ張った。
2。 B.の準備ブルグドルフェリ
- B.を育てるmL当たり約10 7の細胞の濃度でまで、BSK文化メディア7のブルグドルフェリ 。スピロヘータはPetroff - Hausser計数室（Hausser科学）を使用して暗視野顕微鏡下でカウントされます。
- ペレットB.室温で10分間、3,000 xgで遠心分離によってブルグドルフェリ 。
- 上清を除去し、完全に優しくmL当たり10 9細胞の最終濃度に200μL滅菌マイクロチップを通過することによってBSK培地でペレットを再懸濁します。細胞は、高い細胞密度で再懸濁させ、そして、細胞懸濁液は直ちにマイクロインジェクションのために一緒に凝集を使用する必要があります可能性があるため。
3。準備ティック
- スライドガラス上に透明な、両面テープを置きます。
- 粘着マット上での作業、慎重に小さなブラシを使用してコンテナから若ダニを除去する。
- 同じ方向を向いて、粘着テープで注入されるダニの必要数、腹側を上に置きます。
4。注入ティック
- B.の5μLをロードする20μLmicroloaderピペットチップ（エッペンドルフ）を使用してプルキャピラリー針にブルグドルフェリの文化。閉じ込められた空気の泡のために針を点検し、必要に応じて、細菌培養で針をリロードします。
- 解剖双眼顕微鏡下の目盛りを表示し、ダニの肛門開口部分に焦点を合わせる。ゆっくりと直径がマイクロインジェクションの針を形成し、ダニの肛門開口部のそれよりわずかに小さいチューブを打開するためにキャピラリー針の先端に触れる。非適切な針先でダニを注入しようとするが、注入されたダニの傷害および可能な死の原因として、この手順は重要です。
- 解剖双眼顕微鏡下に固定化したダニを置き、二つの可動肛門のプレートで覆われている肛門絞り、焦点を当てる。細かい鉗子を使用して、軽く触れると肛門開口の近くに任意の領域に非常に穏やかな圧力を適用する。これは、肛門板と腸に接続している肛門細孔の開口部の分離が可能になります。肛門板の強制的な開口部を通って肛門の開口部にわずかに針の先端を慎重に挿入します。ガラスの先端が直腸に接続する半透明の後腸を損傷する可能性があるため、針挿入は最小限に抑える必要があります。自動化されたフットコントロール（エッペンドルフ）を搭載したマイクロインジェクターを使用して、Bを注入する次のパラメータを使用して、 ブルグドルフェリのソリューション：1,000ヘクトパスカル（hPaの）射出圧力、0.2秒噴射時間と8 hPaの補償圧力。それぞれの目盛りは、単回注射を受け取ります。
- マイクロインジェクションの後、ダニは注射前の状態と同じように動作する必要があります。例えば、ダニは、刺激に応答してクロールする必要があります。
- 我々は通常、ダニは24 °、16時間/ 8時間とC /暗光周期療法、湿度95％に設定した環境室に48時間で回復することができます。チャンバーが使用できない場合は、注入されたダニは、正規のデシケーター室として、密閉容器内で湿った状態で室温で保存することができます。必要に応じてマウスの摂食のために使用される前に、ダニの回復時間も数時間に短縮することができます。
（2）B.共焦点免疫蛍光顕微鏡によるブルグドルフェリのローカライゼーション
1。解剖ティック
- リン酸の液滴を配置するには、顕微鏡のためのポリ- L -リジンコートしたスライド（シグマ）で解剖し、別のクリーンなガラススライド上に生理食塩水（PBS）を。両面粘着テープで別のスライドガラスを準備する。
- 小さなブラシを使って両面粘着テープで容器と場所からダニを取り除く。
- 解剖顕微鏡でダニを表示し、フォーカス。足の第一および第二の対の間にダニに鋭いカミソリの刃を置きます。しっかりと腹部へのアクセスを許可する2つの部分にダニをカット押し下げます。すぐに、水没PBSの液滴の腹部。
- 非常に微細な鉗子を使用して、カットのサイトの周りに背と腹外骨格をつかむ。慎重に茶色っぽい色の腸憩室を公開するダニから持ち上げ、背側シールドを引き出します。すべての回でPBSの下に解剖ダニを保つように注意してください。
- 半透明の唾液腺のパンdlesは、腸の前方領域の両側に配置され、必要に応じて、この時点で削除することができます。鉗子との場所に残っている外骨格を持って慎重に腹部から腸を引き出します。
- 優しくどんなトラップの組織（例えば、気管を）除去することにより腸をきれいに。
- 微細な鉗子の先端を使用して、すぐにポリ- L -リジンスライドガラス上でPBSの液滴でダニの腸を転送する。微細な刃を使用してより小さな部分に腸を切り離したり、軽く細かい鉗子の先端を押す。慎重に腸組織の周りに余分なPBSを吸引除去する。
- 腸の組織は、室温で風乾する。
- 10分間アセトンに浸してダニの腸を修正。室温で風乾する。スライドは、気密容器内に-20℃で数ヶ月のために、この手順で保存することができます。
2。染色
- ティッシュペーパーを使用して、組織の周りに余分な水分を除去し、PAP -ペンなど疎水性のバリアーのライニング装置によって乾燥ダニの腸の周りに円を描く。これにより、その後のインキュベーションステップの間に染色液を保持するのに役立ちます。
- 室温で30分間つまたはブロッキングバッファーの数滴（0.05％PBSのTween - 20、5％ヤギ血清）でダニの腸をカバーしています。ブロッキングのために使用される血清は、抗体の宿主動物のソースによって異なります。スライドが前方にこの点から乾燥させないでください。
- ゆっくりブロッキングバッファーを吸引除去する。適切なプライマリおよび/または二次抗体溶液と腸をインキュベートします。我々は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）を使用-アンチラベル B室温で1時間ブロッキングバッファーで100倍希釈でブルグドルフェリ抗体（Kirkegaard＆ペリーラボラトリーズ）。光への曝露を制限するためにアルミホイルで容器を覆う。
- 穏やかな吸引によって抗体溶液を取り外します。 4などのラベルティック組織、'、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）またはヨウ化プロピジウムの蛍光色素で腸をインキュベートする。我々は通常、5分間PBSで20μg/ mLのヨウ化プロピジウム（Sigma）を使用してください。室温で。
- 0.05％のTween - 20 PBSにて3回洗浄する。
- このようなSlowfade（Invitrogen社）などの褪色防止試薬を含む緩衝グリセロールでスライドをマウントし、慎重にガラスのカバースリップでカバーしています。スライドは、気密容器内で4℃で数ヶ月ごとにこの手順℃で保存することができます。画像とローカライズB.共焦点顕微鏡下でブルグドルフェリ 。
3。代表的な結果
マイクロインジェクションのための若ダニの位置A と B を表す画像ダニの腸内ブルグドルフェリの局在を図1に提示されます。
図1。マイクロインジェクションとBの局在ダニの腸内にブルグドルフェリ 。
幼虫I.の（A）腹ビューscapularisティックはマイクロインジェクションのために配置されます。挿入したマイクロインジェクションの針（矢印）と肛門絞り（矢じり）がはめ込みに倍率の下に表示されます。細かいforcepは肛門板とマイクロインジェクションのための肛門孔の開口部の分離を許可されて身体に優しい圧力を適用するために使用されます。針が視認性を高めるために、クマシーブリリアントブルー溶液で満たされている。（B）Bの共焦点免疫蛍光イメージングの代表結果ダニの腸内ブルグドルフェリ 。腸憩室の前方領域が表示されます。腸の核とスピロヘータが（矢印）、ヨウ化プロピジウム（赤色）またはFITC結合抗Bと表示されていますそれぞれブルグドルフェリ （緑色）、。バー= 20μmの。
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Discussion
ここでは、細菌性病原体Bと若虫マダニ属のダニの迅速かつ効率的な感染症のためにマイクロインジェクションベースの手順を示すブルグドルフェリ 。我々はまた、Bの検出のための共焦点蛍光抗体法の手順を説明します。 その場でダニの腸内ブルグドルフェリ 。私たちのデモでは、幼虫の腸を含むものの、同様の手順ではまた、幼虫、大人8,9のようなダニの他の発育段階、に適用できます。しかし、その小さいサイズのために、技術は、幼虫で使用するために比較的厳しいかもしれないが、大人チックで使用するためにも適用可能であるべきである。 B.とダニの人工的な感染の他の方法ブルグドルフェリは、このようなガラスキャピラリーチューブ10を介して供給として、または培養液11に浸漬によって、開発されている。これらのメソッドは、効率的で簡単かつ比較的安価である。しかし、これらの手順は、B.の比較的制御されていない転送に依存していますしたがって、個々のダニへのブルグドルフェリとは、潜在的に同じ病原体の負担がはびこっダニのコホートの生成に制限されています。後者の欠点は、実質的にマイクロインジェクションなどのより制御された送達手続き、によって克服することができます。当研究室では、我々は日常的にBに転送するためにこの手順を採用ほぼ100％の感染率とダニ、そしてほとんどのダニへのブルグドルフェリは、手順を生き残る。注入されたダニは数ヶ月に数週間のための実験室に保管、またはすぐにマウスを充血させるとBを送信するために許可することができますブルグドルフェリの感染症。 B.の効率性と動態マイクロインジェクションティックからブルグドルフェリの伝送は、自然感染したダニのそれと似ており、したがって、人工的なダニの感染症の手順は、ダニ媒介ライムボレリオ症を研究するための努力を支援する可能性があります。さらに、同様のマイクロインジェクション技術はまた、ダニ6,9,12のRNA干渉を介した遺伝子操作、例えば、関連する実験的な目的のために適用されています。
ダニの幼虫のマイクロインジェクションは、比較的繊細な手順です。ダニはB.を注入することを確認することが重要ですブルグドルフェリは、実験の次のセットに進む前に、健康的です。このような呼気またはブラシで触れるように足を撤回し、刺激に応答しないしているポスト注入ダニは、さらなる実験には使用しないでください。これらは、ほとんど死んだ可能性または射出外傷による死亡の危機に瀕しています。我々は、針の先端と注入パラメータのサイズが大きい針の先端と注入量などの手続きにおける重要な要素、であることを見出している潜在的に破裂高いダニの死亡率を伴う腸壁をできた。ここで説明するマイクロインジェクションの設定は主にBを注入するために最適化されていることに注意することも重要です。 ブルグドルフェリは BSK培地に懸濁した。そのような抗体や濃縮されたRNAのソリューションとして他の生物学的材料は、流体の粘度で異なる場合があります。他の材料については、主に最適なマイクロインジェクションの設定は、噴射圧力と噴射時間は、経験的に決定する必要があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは心からこのデモの準備の支援のためにパルの研究室のメンバーに感謝。この研究は、NIH / NIAIDからPHS助成AI076684とAI080615によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
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