Summary
Estudos de pesquisa a doença de Lyme muitas vezes exigem a geração de carrapatos infectados com o patógeno Borrelia burgdorferi, um processo que normalmente leva várias semanas. Aqui nós demonstramos uma microinjeção baseado procedimento de infecção do carrapato que pode ser realizado em poucas horas. Nós também demonstramos um método de imunofluorescência para na localização in situ de B. burgdorferi dentro de carrapatos.
Abstract
A doença de Lyme é causada por infecção com o patógeno espiroqueta Borrelia burgdorferi, que é mantido na natureza por um ciclo de infecção do carrapato roedor-1. Um modelo murino carrapatos 2 foi desenvolvido para estudar a doença de Lyme no laboratório. Enquanto carrapatos ingênuo pode ser infectado com B. burgdorferi, alimentando-os em camundongos infectados, o processo de muda leva várias semanas ou meses para ser concluído. Portanto, o desenvolvimento de técnicas de assinalar mais rápida e eficiente a infecção, como um procedimento de microinjeção de base, é uma importante ferramenta para o estudo da doença de Lyme 3,4. O procedimento requer apenas algumas horas para gerar os carrapatos infectados e permite o controle sobre a entrega de quantidades iguais de espiroquetas em uma coorte de carrapatos. Isto é particularmente importante como a geração de B. carrapatos infectados por burgdorferi o processo de alimentação natural, utilizando camundongos não consegue garantir a taxa de infecção de 100% e, potencialmente, resulta em variação de carga de patógenos entre os carrapatos alimentados. Além disso, a microinjeção pode ser usado para infectar carrapatos com B. burgdorferi isolados em casos em que uma cepa atenuada é incapaz de estabelecer a infecção em camundongos e, portanto, não pode ser adquirida naturalmente por carrapatos 5. Esta técnica também pode ser usado para fornecer uma variedade de outros materiais biológicos em carrapatos, por exemplo, anticorpos específicos ou dupla stranded RNA 6. Neste artigo, vamos demonstrar a microinjeção de carrapatos ninfal com in vitro-grown B. burgdorferi. Iremos também descrever um método para a localização de patógenos a doença de Lyme no intestino tick usando microscopia confocal de imunofluorescência.
Protocol
1. Microinjeção de carrapatos Ixodes scapularis ninfal
1. Agulhas preparar
- Fabricar agulhas microinjeção várias aquecendo e puxando um milímetro tubos capilares de vidro (Instrumentos de Precisão World) em um dispositivo de vidro extrator micropipeta (Narishige). Remova cuidadosamente os tubos frágeis capilares.
- Loja puxado agulhas (com a ponta voltada para cima) em fita adesiva em uma placa de Petri.
2. Preparando B. burgdorferi
- Crescer B. burgdorferi em BSK cultura de mídia 7 até a uma concentração de cerca de 10 7 células por ml. Espiroquetas são contados em um microscópio de campo escuro pelo uso de uma Petroff-Hausser contagem câmara (Hausser científica).
- Pelota B. burgdorferi por centrifugação a 3000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e completamente ressuspender o sedimento em BSK media suavemente passando de 200 mL MICROTIP estéril para uma concentração final de 10 9 células por mL. Uma vez que as células são ressuspendidas em alta densidade celular, e pode se acumular, a suspensão celular deve ser usado para microinjeção imediatamente.
3. Carrapatos preparar
- Lugar claro, fita adesiva dupla face em uma lâmina de vidro.
- Trabalhando em uma esteira, retire cuidadosamente os carrapatos ninfal do recipiente com uma escova pequena.
- Colocar o número necessário de carrapatos a ser injetado na fita adesiva, lado ventral para cima, de frente para a mesma direção.
4. Carrapatos injetando
- Carga de 5 mL da B. burgdorferi cultura para dentro da agulha capilar utilizando puxado a 20 mL microloader pipeta ponta (Eppendorf). Inspecionar a agulha para bolhas de ar aprisionadas e recarregar a agulha com a cultura bacteriana, se necessário.
- Ver o carrapato sob o microscópio binocular de dissecação e foco na área do carrapato abertura anal. Toque na ponta da agulha capilar, a fim de quebrar o tubo onde o diâmetro é ligeiramente menor do que a de abertura anal do carrapato, formando a agulha microinjeção. Esta etapa é fundamental como qualquer tentativa de injetar carrapatos com uma ponta de agulha não adequada provoca a morte de lesões e possíveis do carrapato injetado.
- Coloque os carrapatos imobilizado sob o microscópio binocular de dissecação e concentrar-se na abertura anal, que é coberta por duas placas móveis anal. Utilizando uma pinça fina, tocar suavemente e aplicar uma pressão muito leve para qualquer área perto da abertura anal. Isto permitirá que a separação das placas anal e abertura de poros anal que se conecta ao intestino. Insira cuidadosamente a ponta da agulha um pouco para a abertura anal através da abertura forçada das placas anal. Inserção da agulha deve ser mantida a um mínimo como a ponta de vidro podem danificar o intestino posterior semitransparente que se conecta ao reto. Usando um microinjetor equipado com pedal automático (Eppendorf), injetar B. burgdorferi solução usando os seguintes parâmetros: 1.000 hectopascais (hPa) pressão de injeção, tempo de injeção 0,2 segundos e 8 de compensação de pressão hPa. Cada carrapato recebe uma única injeção.
- Após a microinjeção, os carrapatos devem se comportar semelhante ao estado pré-injeção. Por exemplo, o carrapato deve rastejar em resposta a estímulos.
- Nós geralmente permitem que os carrapatos se recuperar por 48 horas em uma câmara ambiental fixado em 24 ° C com 16 horas / 8 horas luz / escuridão regime de fotoperíodo e umidade de 95%. Se uma câmara não estiver disponível, carrapatos injetada pode ser armazenado em temperatura ambiente em condições de umidade dentro de um recipiente hermético, como uma câmara de dessecador regular. Se necessário, o tempo de recuperação dos carrapatos também poderia ser reduzido para algumas horas antes utilizado para a alimentação em camundongos.
2. B. burgdorferi localização por Microscopia Confocal de imunofluorescência
1. Carrapatos dissecar
- Coloque uma gota de solução fisiológica tamponada (PBS) em uma lâmina de vidro limpa para dissecção e outro em um slide poli-L-lisina revestido (Sigma) para microscopia. Prepare outra lâmina de vidro com fita dupla face adesiva.
- Remover o carrapato do recipiente e coloque em fita dupla face adesiva, utilizando uma escova pequena.
- Ver e foco do carrapato no microscópio de dissecação. Coloque uma lâmina afiada sobre o carrapato entre os pares de primeiro e segundo de pernas. Pressione firmemente o corte do carrapato em duas partes permitindo o acesso ao abdômen. Submergir imediatamente, o abdome em uma gota de PBS.
- Usando uma pinça muito fina, pegue o exoesqueleto dorsal e ventral em torno do local do corte. Cuidadosamente puxe o escudo dorsal para cima e longe do carrapato expondo os divertículos intestinais acastanhadas. Tenha cuidado para manter os carrapatos dissecando sob a PBS em todos os momentos.
- A semi-translúcido bun glândula salivarspindles estão localizados em ambos os lados da região anterior do intestino, e pode ser removido neste momento, se desejar. Segurando o exoesqueleto restantes no lugar com uma pinça, puxe cuidadosamente o intestino para fora do abdômen.
- Limpar delicadamente o intestino, removendo quaisquer tecidos preso (por exemplo, traquéia).
- Usando a ponta de uma pinça fina, transferir rapidamente o intestino carrapato em uma gota de PBS numa lâmina de vidro poli-L-lisina. Separar os intestinos em pedaços menores usando lâminas finas ou pressionando suavemente com a ponta de uma pinça fina. Aspirar cuidadosamente PBS excesso de tecidos ao redor do intestino.
- Permitir que os tecidos do intestino para o ar seco à temperatura ambiente.
- Corrigir o intestino carrapato por submersão em acetona por 10 minutos. Deixar secar ao ar em temperatura ambiente. Lâminas podem ser armazenados nesta etapa por meses a -20 ° C em um recipiente hermético.
2. Coloração
- Usando lenço de papel, remova o excesso de umidade em torno do tecido e desenhar um círculo ao redor do intestino carrapato secas por um pap pen-ou qualquer outro dispositivo de revestimento hidrofóbica barreira. Isso ajudará a manter a soluções de coloração durante as etapas de incubação subseqüentes.
- Cobrir o intestino carrapato com uma ou algumas gotas de tampão de bloqueio (0,05% Tween-20, soro de cabra 5% em PBS) por 30 minutos em temperatura ambiente. O soro utilizado para o bloqueio depende da fonte de animal hospedeiro para o anticorpo. Não permita que o slide para secar a partir deste ponto em diante.
- Lentamente, aspirar o tampão de bloqueio. Incubar o intestino com primário adequado e / ou soluções anticorpo secundário. Usamos isotiocianato de fluoresceína (FITC) - rotulado anti-B. burgdorferi anticorpos (Kirkegaard & Perry Laboratories) na diluição de 1:100 em tampão de bloqueio por 1 hora à temperatura ambiente. Cubra o recipiente com papel alumínio para limitar a exposição à luz.
- Remover a solução de anticorpos através de ligeira aspiração. Incubar o intestino com uma tinta fluorescente para os tecidos rótulo carrapato, tais como 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ou iodeto de propídio. Normalmente usamos 20 mg / mL de iodeto de propídio (Sigma) em PBS por 5 min. à temperatura ambiente.
- Lavar 3 vezes com 0,05% Tween-20 em PBS.
- Montar o slide em glicerol tamponado contendo um reagente Antifade como Slowfade (Invitrogen) e cuidadosamente cobrir com uma lamela de vidro. Lâminas podem ser armazenados nesta etapa por alguns meses a 4 ° C dentro de um recipiente hermético. Imagem e localizar B. burgdorferi sob um microscópio confocal.
3. Resultados representante
Posição de um carrapato ninfal de microinjeção e uma imagem representando B. burgdorferi localização no intestino carrapato é apresentado na Figura 1.
Figura 1. Microinjeção e localização de B. burgdorferi no intestino do carrapato.
(A) vista ventral de uma ninfa I. carrapato scapularis posicionado para microinjeção. Anal abertura (seta) com agulha inserida microinjeção (seta) é mostrado sob a ampliação na inserção. A pinça fina é usado para aplicar pressão suave para o corpo, o que permitiu a separação das placas anal e abertura do poro anal para microinjeção. A agulha é preenchido com uma solução de Coomassie azul brilhante para melhorar a visibilidade. (B) Os resultados representativos das imagens de imunofluorescência confocal de B. burgdorferi dentro do intestino do carrapato. Região anterior de um divertículo do intestino é mostrado. Núcleos intestino e espiroquetas (seta) são rotulados com iodeto de propídio (cor vermelha) ou FITC-conjugado anti-B. burgdorferi (cor verde), respectivamente. Bar = 20 mM.
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Discussion
Aqui demonstramos um procedimento baseado microinjeção de infecção rápida e eficaz de carrapatos Ixodes ninfal com o agente patogénico B. burgdorferi. Descrevemos também um procedimento confocal de imunofluorescência para a detecção de B. burgdorferi no intestino carrapato in situ. Embora a nossa demonstração envolve gut ninfal, procedimentos semelhantes são também aplicáveis para outros estágios de desenvolvimento dos carrapatos, como larva ou adulto 8,9. No entanto, devido à sua menor dimensão, a técnica pode ser relativamente difícil para utilização em larvas, mas deve ser bem aplicável para uso em carrapatos adultos. Outros métodos de infecção artificial de carrapatos com B. burgdorferi foram desenvolvidas, tais como a alimentação através de tubos capilares de vidro de 10 ou por imersão em meio de cultura 11. Estes métodos são eficientes, simples e relativamente barato. No entanto, esses procedimentos dependem de transferência relativamente descontrolada de B. burgdorferi em carrapatos individual e, portanto, potencialmente são limitados na geração de coortes de carrapatos infestados com cargas iguais patógeno. A deficiência último poderia ser substancialmente superada por mais procedimentos de entrega controlada, como microinjeção. Em nosso laboratório, nós rotineiramente empregam este procedimento para transferência de B. burgdorferi em carrapatos com as taxas de infecção de cerca de 100%, ea maioria dos carrapatos sobrevivem ao procedimento. Carrapatos injetada pode ser mantido em laboratório por várias semanas a meses, ou imediatamente autorizada a engorge em ratos e transmitir B. infecção burgdorferi. A eficiência e cinética de B. burgdorferi transmissão de carrapatos microinjeção são semelhantes ao de carrapatos naturalmente infectados e, portanto, os procedimentos de infecção artificial carrapato são susceptíveis de ajudar em nossos esforços para estudar carrapatos borreliose de Lyme. Além disso, as técnicas de microinjeção similares também têm sido aplicados para fins experimentais relacionadas, por exemplo, RNA de interferência mediada por manipulação genética de carrapatos 6,9,12.
Microinjeção de estágios imaturos de carrapatos é um procedimento relativamente delicado. Assim, é importante para verificar se os carrapatos injetados com B. burgdorferi são saudáveis antes de prosseguir para o próximo conjunto de experimentos. Pós-injeção carrapatos que têm retraído e as pernas não respondem a estímulos, como o ar exalado ou tocar com um pincel, não deve ser utilizado nos experimentos posteriores. Estes são mais prováveis mortos ou à beira de morrer do trauma da injeção. Nós descobrimos que o tamanho da ponta da agulha e os parâmetros de injeção são os dois fatores críticos para o procedimento, como dicas agulha maior e volumes de injeção poderia romper a parede do intestino, resultando em mortalidade alta carrapato. Também é importante notar que as configurações de microinjeção aqui descritos são principalmente otimizado para injetar B. burgdorferi suspensas em BSK mídia. Outros materiais biológicos, tais como anticorpos ou soluções concentradas RNA, podem diferir na viscosidade do fluido. Para outros materiais, as configurações de microinjeção ótimo, principalmente a pressão de injeção e tempo de injeção, devem ser determinados empiricamente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Nós sinceramente agradecer aos membros do laboratório de Pal para a assistência com a preparação desta demonstração. Este estudo foi suportado por concessões PHS AI076684 e AI080615 do NIH / NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-4 | |
| Vertical glass puller | Narishige International | PC-10 | |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser Scientific | 3900 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Femtojet microinjector | Eppendorf | 920010504 | |
| Foot control FemtJet | Eppendorf | 920005098 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | Filter-sterilized |
References
- Steere, A. C., Coburn, J., Glickstein, L. The emergence of Lyme disease. J Clin Invest. 113, 1093-1101 (2004).
- Barthold, S. W., Diego, C., Philipp, M. T. Borrelia, Molecular Biology, Host Interaction and Pathogenesis. Samuels, D. S., Radolf, J. D. , Caister Academic Press. Chapter 14 353-405 (2010).
- Pal, U. OspC facilitates Borrelia burgdorferi invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest. 113, 220-230 (2004).
- Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. J Exp Med. 199, 641-648 (2004).
- Zhang, X., Yang, X., Kumar, M., Pal, U. BB0323 function is essential for Borrelia burgdorferi virulence and persistence through tick-rodent transmission cycle. J Infect Dis. 200, 1318-1330 (2009).
- Pal, U. TROSPA, an Ixodes scapularis receptor for Borrelia burgdorferi. Cell. 119, 457-468 (2004).
- Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med. 57, 521-525 (1984).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 1141-1146 (2004).
- Narasimhan, S. A tick antioxidant facilitates the Lyme disease agent's successful migration from the mammalian host to the arthropod vector. Cell Host Microbe. 2, 7-18 (2007).
- Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., DeSilva, A. Glass capillary tube feeding: a method for infecting nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 39, 285-292 (2002).
- Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J Med Entomol. 40, 364-370 (2003).
- Fuente, dela, Kocan, J., M, K., Almazan, C., Blouin, E. F. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
