Summary
Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.
Abstract
Imaging is een waardevolle techniek die gebruikt kan worden om biologische processen te controleren. In het bijzonder, kan de aanwezigheid van kankercellen, stamcellen, specifieke immuun soorten cellen, virale pathogenen, parasieten en bacteriën worden gevolgd in real-time in levende dieren 1-2. Toepassing van de bioluminescentie beeldvorming aan de studie van pathogenen heeft voordelen ten opzichte van conventionele strategieën voor de analyse van infecties in diermodellen 3-4. Infecties kunnen gevisualiseerd worden binnen individuele dieren na verloop van tijd, zonder dat euthanasie op de locatie en hoeveelheid van de ziekteverwekker te bepalen. Optische beeldvorming maakt uitgebreid onderzoek van alle weefsels en organen, in plaats van bemonstering van de sites die eerder bekend te zijn besmet. Daarnaast kan de nauwkeurigheid van de enting in specifieke weefsels direct worden bepaald voor de verdere uitvoering van dieren die zonder succes werden ingeënt in het hele experiment. Variabiliteit tussen de dieren kunnen worden gecontroleerd voor, omdat imaging maakt het mogelijk elk dier afzonderlijk worden gevolgd. Imaging heeft het potentieel om grote behoefte aantal dieren te verminderen vanwege de mogelijkheid om gegevens uit tal van tijd punten te verkrijgen zonder dat u afgenomen weefsels te bepalen pathogeen laden 3-4.
Dit protocol beschrijft methoden om infecties in levende dieren met behulp van bioluminescentie beeldvorming voor recombinante stammen van bacteriën te drukken luciferase te visualiseren. De klik kever (CBRLuc) en vuurvlieg luciferases (FFluc) gebruiken luciferine als een substraat 5-6. Het licht geproduceerd door zowel CBRluc en FFluc heeft een breed golflengte van 500 nm tot 700 nm, waardoor deze luciferases uitstekende verslaggevers voor de optische beeldvorming in het leven diermodellen 7-9. Dit komt vooral doordat golflengten van het licht groter is dan 600 nm zijn verplicht om absorptie te voorkomen door hemoglobine, en dus efficiënt reizen door weefsel van zoogdieren. Luciferase is genetisch ingebracht in de bacteriën om te lichtsignaal 10 te produceren. Muizen worden pulmonale geënt met bacteriën bioluminescente intratracheaal de monitoring van infecties in real time mogelijk te maken. Na luciferine injectie, worden de beelden verkregen met behulp van de IVIS Imaging System. Tijdens de beeldvorming, muizen verdoofd met isofluraan met behulp van een XGI-8 Gas Anethesia System. Beelden kunnen worden geanalyseerd om te lokaliseren en het signaal bron, die de bacteriële infectie site (s) en het nummer staat voor respectievelijk kwantificeren. Na de beeldvorming, is CFU bepaling uitgevoerd op gehomogeniseerd weefsel om de aanwezigheid van bacteriën te bevestigen. Meerdere doses van bacteriën worden gebruikt om bacteriële aantallen correleren met luminescentie. Beeldvorming kan worden toegepast op studie van de pathogenese en de evaluatie van de werkzaamheid van antibacteriële verbindingen en vaccins.
Protocol
1. Longinfectie door intratracheale intubatie
- Weeg muizen en, optioneel, markeringen kan worden gemaakt op de oren voor gemakkelijke identificatie.
- Verdoven van de muizen met ketamine (100 pg per gram muis gewicht) en xylazine (10 pg per gram van muis gewicht) door intraperitoneale inenting.
- Plaats muizen in kooien tot volledig verdoofd. Knijp de pads van hun voeten te trappen reflex te controleren. Muizen getoond moet worden verminderd of geen reflex reactie.
- Plaats de muis op de intubatie stand liggend op zijn rug.
- Fix een rubberen band om intubatie staan en dan plaats onder de bovenste snijtanden van de muis. Gebruik tape om armen en benen op de intubatie stand te lossen.
- Beweeg tougue uit de mond met behulp van pincet.
- Plaats speculum met octoscope binnenkant van de mond en kijk naar oropharynx tot strottenhoofd opening zichtbaar is.
- Advance voerdraad bedekt met cathether in de luchtpijp tot catether hub is bij de snijtanden. Verwijder de voerdraad. Doe lucht in cathether tot aan de borst groei te observeren en te corrigeren intubatie te bevestigen.
- Injecteer 50 ul van bacteriële (in de getoonde afbeeldingen gebruikten we Bacillus Calmette Guerin (BCG) te drukken klikt u kever rood luciferase (CBRLuc), gebouwd in ons laboratorium, maar elke lichtgevende bacteriële stam kan worden gebruikt)-oplossing door middel van cathether met behulp van een 1 ml spuit.
- Plaats de muis in een kooi en observeren tijdens het herstel van anesthesie.
2. Dier verdoving en voorbereiding voor het Bioluminescentie Imaging
Muizen worden verdoofd met isofluraan het gebruik van de XGI-8 Gas Aneshesia System.
- Voordat u de XGI-8 anesthesie-systeem, wegen elk koolstoffilter bus en schrijf het gewicht en de datum erop. Als het gewicht is 50 gram over van het oorspronkelijke gewicht, vervang deze door een nieuwe bus.
- Controleer het isofluraan niveau in de verdamper en vul deze indien nodig.
- Zet de evacuatie pomp aan de voorkant van de XGI-8 anesthesie systeem en ingesteld op 8 lpm (liter per minuite).
- Zet de zuurstoftoevoer van de hoge druk cilinder en zet deze op 55 psig.
- Zet de zuurstof schakelen (groen) aan de voorzijde van de XGI-8 anesthesie-systeem.
- Zet de gastoevoer naar de beeldvorming kamer om het niveau van de gasstroom in te stellen. Ingesteld op 0,25 lpm en zet de gasstroom.
- Zet de gasstroom naar de anesthesie inductie kamer tot het niveau van de gasstroom in te stellen. Ingesteld op 1,5 lpm en zet gasstroom.
- Zet de isofluraan met de verdamper en ingesteld op 2-2,5 procent. De isofluraan niveau kan worden aangepast afhankelijk van het aantal dieren dat wordt gebruikt en gewicht.
- Plaats muizen in de inductie kamer en sluit het deksel. Zet de gastoevoer aan inductie kamer. Plaats muizen in de kamer voor 5 - 10 minuites tot ze volledig verdoven.
- Van toepassing zijn optische zalf op de ogen om de muis ogen te beschermen tijdens beeldvorming en de muizen in de beeldvorming kamer in een van de neus kegels op de anesthesie spruitstuk. Gebruik lichte baffle tussen muizen om de reflectie van het licht te voorkomen dat op aangrenzende dier onderwerpen.
- Injecteren luciferine (150 ug / gram lichaamsgewicht) door intraperitoneale inenting.
3. Bioluminescentie beeldvorming
- Start de Living Imaging Software.
- Als het systeem niet geïnitialiseerd, initialiseren van de IVIS Imaging systeem.
- Stel de parameters voor beeldverwerking door te klikken op volgorde setup in IVIS overname bedieningspaneel.
Selecteer luminescentie en foto in de Imaging-modus. Als de optie uit te voeren DLIT 3D reconstructie gewenst is, selecteer fotografische, luminescente en structurele licht beelden als deel van het beeld sequentie.
De belichting tijd van 0,5 sec tot 10 minuten.
Stel binning en F / stop op basis van de verwachte helderheid van het monster.
Stel excitatiefilter te blokkeren en emissie-filter te openen, tenzij van plan om alleen bepaalde golflengten van het licht te verwerven. In het geval van DLIT 3D-grondwet, die meerdere emissie filters van verschillende golflengten om nauwkeurige lokalisatie van de bron mogelijk te maken.
Set FOV van A naar D, afhankelijk van het aantal muizen of het gebied van dier worden afgebeeld. Selecteer A en B voor een muis, C voor 2-3 muizen, en D voor 4-5 muizen. - Klik op toevoegen in de Image Wizard in de Overname Control Panel om de reeks setup toe te voegen.
- Begin imaging volgorde door te klikken op verwerven.
In het geval van DLIT 3D-constructie, zal lichtgevende beelden worden verworven voor meerdere emissie filters bij verschillende golflengten. Fotografische en gestructureerd licht beelden zullen ook worden verkregen. - Tijdens overname van het imago en bewerken van foto niveaus panelen zullen zichtbaar zijn. Vul zo gedetailleerd mogelijke informatie voor elk experiment als u wijzigingen op afbeelding om gemakkelijk traceren van beelden op latere tijdstippen te waarborgen en sla uw beelden.
- ReRemove de muizen van IVIS beeldvorming kamer en breng ze terug naar hun kooien. Let op herstel van eenesthesia om muizen te waarborgen, werden niet significant beïnvloed door de procedure. Dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd totdat ze volledig herstellen van anesthesie (meestal 1-2 min.).
4. Ex vivo Imaging en CFU-analyse voor de kwantificering van bacteriën in de longen
- Injecteren muizen met luciferine intraperitoneaal op dezelfde wijze als voor de beeldvorming, net voor euthanasie.
- Euthanaseren de muizen door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg pentobarbitol 5 minuten na luciferine injectie.
- Explantatie de longen van de muizen en de plaats in de steriele petri-schalen met steriele pincet en een schaar.
- Plaats petri-schaaltje met geëxplanteerd orgel in de beeldvorming kamer en verwerven bioluminescentie beelden op dezelfde wijze als voor de hele muis.
- Na de beeldvorming, te verwijderen geëxplanteerde orgel uit petrischaal met behulp van steriele pincet en homogeniseren in 1 ml PBS.
- Maak verdunningen en plaat weefsel op de juiste selectieve media. Gehomogeniseerd weefsel kan worden opgeslagen -80 ° C voor re-plating zou het nodig zijn. Als alternatief kan gehomogeniseerd weefsel worden gebruikt voor RNA-of DNA-extractie van bacteriële aantallen te kwantificeren door qPCR.
5. Analyse van de Luminescentie Imaging
- Start "Living Imaging Software" en zoek de beeldbestanden.
- Gebruik "Tool Palette 'om beelden aan te passen. Klik op de afbeelding aanpassen om correctie / filter-instellingen en min / max voor individuele kleurschalen te wijzigen.
- Gebruik ROI tools in pulldown lijst voor de kwantificering van de lichtintensiteit. Selecteer ROI vorm, aantal en grootte. Sleep ROI frame regio van de rente op beeld. Zorg ervoor dat alle ROI dezelfde grootte en vorm. Klik op ROI meten en op te slaan, te kopiëren en / of export kwantitatieve gegevens.
- In het geval van DLIT 3D-reconstructies, load image sequence inclusief het gestructureerd licht beeld. Klik Surface topografie in de Tool Platte. In pulldown lijst, klikt u op het tabblad Reconstrueer aan de oppervlakte topografie te genereren. Een oppervlak puinhoop zal dan verschijnen in het venster.
- Selecteer DLIT 3D reconstructie in de Tool Platte. In pulldown lijst, klikt u op het tabblad Eigenschappen om weefsel eigenschappen en de bron spectrum in te stellen. Spier is aan te bevelen onder de meeste omstandigheden. In de pulldown lijst, klik op het tabblad Analyseren van de golflengte voor analyse te selecteren. Klik op het tabblad Parameter en bevestig standaardwaarden of aan te passen DLIT parameters indien nodig. Klik op het tabblad Reconstrueer om 3D-analyse te starten.
- Wanneer 3D-reconstructie is voltooid, zal de 3D-weergave van de resultaten van 3D-reconstructie. Klik op het tabblad resultaten voor analyse gegevens te bekijken voor foton dichtheid, voxels en DLIT algoritme parameters.
- Op te slaan en / of export van de resultaten van de 3D-reconstructie analyses in cijfers en gegevens-bestanden.
6. Representatieve resultaten:
De bioluminescentie beelden van muizen geïnfecteerd met bioluminescente bacteriën, samen met een niet-geïnfecteerde besturing van de muis zijn weergegeven in figuur 1. De muizen die besmet zijn met pulmonale bioluminescente bacteriën produceren significant signaal van de longen (figuur 1). Luminescentie-intensiteit wordt gekwantificeerd als de totale flux binnen een ROI (regio van belanghebbende) (figuur 2). De kwantitatieve gegevens voor licht-intensiteit is genormaliseerd voor kolonievormende eenheden (CFU) van bacteriën afkomstig van de longen om te bevestigen dat het signaal wordt geproduceerd uit de lichtgevende bacteriën en kan vergeleken worden met negatieve controle. De locatie en de intensiteit van het signaal kan verder worden geanalyseerd door DLIT 3D reconstructie van de luminescentie bron op basis van tomografie van de muis oppervlak 11. Deze analyses laten kwantificering en lokalisatie van de geproduceerde lichtgevende signaal. De resultaten van de 3D-reconstructie van een lichtgevende bron in geïnfecteerde muizen toont aan dat het licht wordt geproduceerd uit de longen van de muis (figuur 3). De ex vivo beelden van de resulterende muis longen te bevestigen dat luminescentie wordt uitgestoten uit de longen, in plaats van dan sommige andere nauw naast elkaar weefsel of orgaan (figuur 2C).
Figuur 1. Luminescentie beeldvorming van pulmonale geïnfecteerde muizen met lichtgevende bacteriën getagd met CBRluc. Onbesmette controle muis is aan de linkerkant en twee geïnfecteerde muizen aan de rechterkant. Muizen werden besmet met bacteriën uiten CBRluc (n = 2) via de intratracheaal route. 10 minuten na luciferine injectie werden luminescentie beelden die gedurende 10 min bij 4 posities: rug-, buik, links en rechts.
Figuur 2. De kwantitatieve lichtintensiteit van muizen geïnfecteerd met bacteriën uiten CBRluc. (A, B) Luminescentie beelden van ROI-analyse en de gekwantificeerde totale flux van het licht van ROI in dorsale en ventrale posities, respectievelijk. Niet-geïnfecteerde muizen zijn aan de linkerzijde en twee geïnfecteerde muizen aan de rechterkant. Luminescentie beelden werden overgenomen van de longen of niet-geïnfecteerde muizen en geïnfecteerd met CBRlux (n = 2). De lichtintensiteit rond de longen werd gekwantificeerd door ROI-analyse. C) ex vivo beelden van de longen van niet-geïnfecteerde (boven) en geïnfecteerde (onderste twee sets van de longen) muizen. Luciferine werd geïnjecteerd 5 miniuts voor van de euthanasie en de beelden werden vervolgens overgenomen. De gekwantificeerde waarden zijn genormaliseerd naar CFU.
Figuur 3. De 3D-reconstructie van bioluminescentie bron (nen) van een long geïnfecteerd muis. De muis was besmet met bacteriën te drukken CBRluc intratracheale injectie. Het beeld sequentie werd verkregen met behulp van verschillende filters emissie van seriële golflengtes van 540 nm tot 700 nm. Een beeld sequentie werd gebruikt voor de 3D-reconstructie voor luminescentie bron in dier onderwerpen die een gestructureerde imag bevatte. A) De tomografie voor de muis is te zien in verschillende posities: voor, achter, links en rechts. Lichtbronnen worden weergegeven als voxels (rode vakjes in 3D-muis), die zich binnen de longen, zoals bepaald door de wederopbouw. B) Photon densiy kaart van gemeten en gesimuleerde data. Het vergelijken van de gemeten en gesimuleerde foton dichtheid rondingen geven de informatie van de kwaliteit van de wederopbouw. Goede kwaliteit reconstructies resulteren in vergelijkbare gemeten en gesimuleerde foton dichtheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel het volgen van deze protocollen zal meestal resulteren in hoge kwaliteit beelden, is het belangrijk om een paar belangrijke punten te overwegen om accurate en consistente gegevens uit beeldvormend onderzoek te verkrijgen. Luminescentie afbeeldingen moeten worden verworven die telt van 600 tot 60.000 om ervoor te zorgen dat het signaal boven de achtergrond en de camera is niet verzadigd. Indien de verkregen signaal is minder dan 600 de blootstelling voorwaarden moeten worden aangepast aan de tellingen te verhogen. Indien de verkregen signaal is meer dan 60.000 van de camera is verzadigd in sommige regio's. Wanneer de camera verzadigd is, moet kwantificering niet worden geprobeerd in verzadigde gebieden, ook al is het nog steeds mogelijk en soms noodzakelijk in de niet-verzadigde gebieden. Bovendien kunnen 3D-reconstructie niet nauwkeurig worden uitgevoerd bij verzadiging een regio is opgenomen binnen de regio wordt gebruikt voor het masker voor de wederopbouw. De aanpassing van de belichtingstijd, kan binning en F / stop voor het imago van overname, alsmede wijziging van de imaging-regio of dier positieregeling het verkregen signaal en laat kwantitatieve analyse van gegevens. Dus in veel experimenten is het nuttig om consequent imago dieren onder meervoudige belichting voorwaarden om ervoor te zorgen dat ten minste een van de afbeeldingen worden binnen de voorgeschreven grenswaarden een kwantitatieve analyse mogelijk te maken.
Het is belangrijk te onthouden dat expressie van een reportergen kan invloed hebben op de virulentie, waardoor het noodzakelijk is voor het uitvoeren van pilot-studies naar mogelijke effecten op de conditie te bepalen in recombinanten stammen die worden gebruikt voor de beeldvorming. Dit is een van de beperkingen van bioluminescent beeldvorming, want het vereist expressie van vreemde genen in de bacterie. Dit kan vaak worden verholpen door het gebruik van geoptimaliseerde constructies die de juiste codongebruik te gebruiken voor de soorten bacteriën te bestuderen, titratie van meningsuiting niveaus voor reportergenen om de impact op het metabolisme of het onderzoek van meerdere luminescente reporter systemen die kunnen verschillen in hun impact te verminderen op fitness.
Een andere primaire variabele voor beeldvorming studies met infectieuze agentia is het niveau van het signaal geproduceerd door de agent in beeld wordt gebracht. Aangezien er verschillen zijn in de drempel van de detectie van elke agent bij dieren ten opzichte van in vitro, is het aanbevolen dat pilot-studies met behulp van meerdere besmettelijke doses vooraf te optimaliseren middel nummers aan het uitvoeren van meer uitgebreide experimenten. De bioluminescente verslaggevers zelf moet ook worden geoptimaliseerd voor de transcriptie, vertaling en een lage toxiciteit, om ervoor te zorgen dat het niveau van de geproduceerde signaal wordt zo hoog mogelijk. Optimalisatie van verslaggevers kan worden bereikt in de meeste gevallen in vitro, maar de golflengte van het licht-emissie zal ook invloed hebben op de mogelijkheid licht geproduceerd door een optimale verslaggevers weefsel van zoogdieren door te dringen, waardoor het belangrijk om ook te evalueren verschillende verslaggevers direct bij dieren. Hoewel elk dier kan individueel worden gevolgd, dat regelt voor een groot deel van de variabiliteit tussen de dieren, is het nog steeds nodig om voldoende dieren omvatten om statistische significantie tussen groepen worden bepaald. Normaal gesproken, zou het aantal dieren worden 4 - 6 per groep, waardoor de verschillen zo laag als twee-voudig tussen groepen in acht te nemen in veel gevallen. Ten slotte zal de inoculatie route en nauwkeurigheid van levering aan de juiste weefsels en van de precieze aantallen middel helpen om consistente resultaten te waarborgen door vermindering van de totale variabiliteit tussen de dieren.
De spectrale eigenschappen van de geproduceerde bioluminescentie is ook een belangrijke factor die de mogelijkheid om beeld infecties in vivo. In zoogdierweefsels, zijn het licht van een golflengte kleiner dan 600 nm grotendeels geabsorbeerd door hemoglobine, een belangrijke component van weefsel van zoogdieren. De diepte van de penetratie voor bioluminescentie golflengten neemt drastisch toe voor golflengten langer dan 600 nm 8,12. Zowel CBRluc en FFluc produceren bioluminescentie met een brede golflengte, waaronder meer dan 600 nm, waardoor deze luciferases bijna ideale verslaggevers voor in vivo beeldvorming, zelfs in de diepe weefsels waaronder longen en de lever 7-8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Texas A & M University in te stellen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de Cirillo laboratorium leden voor waardevolle discussies en hulp in deze studie. Wij danken dr. Joshua Hill en het laboratorium van Dr James Samuel voor hulp bij het tijdens de opnames van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door subsidie 48.523 van de Bill & Melinda Gates Foundation en het verlenen van AI47866 van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathether (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | ||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
