Summary
生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアルタイムに可視化することができます。
Abstract
イメージングは、生物学的プロセスを監視するために使用することができる貴重な技術です。特に、癌細胞、幹細胞、特異的な免疫細胞の種類、ウイルス性病原体、寄生虫や細菌の存在は1-2動物の生活の中でリアルタイムで追跡することができる。病原体の研究への生物発光イメージングのアプリケーションは、図3-4動物モデルにおける感染症の分析のための従来の戦略に比べて利点があります。感染症は病原体の位置と量を決定するために安楽死を必要とせず、時間をかけて個々の動物の中で可視化することができる。光イメージングは、包括的なすべての組織や器官の検査ではなく、以前に感染していることが知られているサイトのサンプリングが可能。さらに、特定の組織への接種の精度は、事前に直接失敗した実験全体を通して接種前方に動物を運ぶために決定することができます。イメージングは、各動物を個々に続くことを可能にするので、動物との間のばらつきは、してコントロールすることができます。イメージングは、非常にために3〜4病原体の負荷を決定するために組織をサンプリングすることなく、多数の時点からデータを取得する機能が必要な動物数を削減する可能性があります。
このプロトコルは、ルシフェラーゼを発現する細菌の組換え株のために生物発光イメージングを使用して、生きた動物での感染を可視化する方法を説明します。コメツキ ムシ（CBRLuc）とホタルルシフェラーゼ（FFluc）は、基板5月6日としてルシフェリンを利用する。 CBRlucとFFluc両方によって生成される光は、生きている動物モデル7-9の光学的イメージングのためのこれらのルシフェラーゼの優れた記者を作り、500〜700 nmまでの広い波長を持っています。 600 nmのより大きい光の波長はヘモグロビンによる吸収を避けるためと、そのため、効率的に哺乳動物の組織を通過する必要があるため、これは主にです。ルシフェラーゼは、遺伝子的に光信号10を生成するバクテリアに導入する。マウスは、リアルタイムで感染症のモニタリングを可能にするために気管内生物発光細菌を接種した肺です。ルシフェリンの注入後、画像がIVISイメージングシステムを用いて取得されます。撮像中に、マウスはXGI - 8ガスAnethesiaシステムを使用してイソフルランで麻酔する。画像をローカライズすると、それぞれ、細菌感染の部位（複数可）と数字を表す信号源を、定量化するために分析することができます。イメージング後、CFU決定は、細菌の存在を確認するためにホモジナイズした組織で行われている。細菌のいくつかの投与量は、発光して細菌数を関連付けるために使用されます。イメージングは、抗菌性化合物およびワクチンの有効性の病因と評価の研究に適用することができます。
Protocol
1。気管内挿管による肺感染症
- マウスの重量を測定し、必要に応じて、マークが容易な識別のための耳で行うことができます。
- 腹腔内接種でケタミン（マウス体重1gあたり100μgの）とキシラジン（マウス体重1gあたり10μg）を有するマウスを麻酔。
- 完全に麻酔まで、ケージの中で場所のマウス。ペダル反射を確認するには、足のパッドを絞る。マウスは、減少または無反射反応を表示する必要があります。
- その後ろに横たわって挿管のスタンドの上にマウスを置きます。
- 挿管のスタンドにゴムバンドを修正してから、マウスの上顎の下に置きます。挿管のスタンドに足と腕を固定するテープを使用してください。
- 静かにピンセットを使って口から出てトゥーゲ移動。
- 口のoctoscopeの内側に鏡を挿入し、喉頭の開口部が見えるようになるまで中咽頭に見える。
- catetherハブまで気管にcathetherで覆われて、事前のガイドワイヤーは、歯になります。ガイドワイヤを外します。胸の拡大を観察し、適切な挿管を確認するためにcathetherに空気を入れて。
- 1 mLの注射器を使用してcathetherを通して細菌（画像では我々が我々の研究室で構築されたコメツキムシ赤色ルシフェラーゼ（CBRLuc）を発現する菌カルメットゲラン（BCG）を使用するように、しかしいかなる発光菌株を使用することができます）溶液50μLを注入する。
- ケージにマウスを置いて、麻酔から回復する際、それを観察。
2。動物の麻酔および生物発光イメージングのための準備
マウスは、XGI - 8ガスAneshesiaシステムを使用してイソフルランで麻酔する。
- XGI - 8麻酔システムを操作する前に、各チャコールフィルターのキャニスターの重量を測定し、その上に体重と日付を書き込む。重量は、初期重量の上に50グラムの場合は、新しいキャニスターと交換してください。
- 気化器のイソフルランのレベルをチェックし、必要に応じて記入してください。
- XGI - 8麻酔システムの前面に排気ポンプの電源を入れ、8 LPM（minuiteリットル）に設定します。
- 高圧ボンベからの酸素供給をオンにし、55 PSIGに設定します。
- XGI - 8麻酔システムの前面にトグル酸素（緑）をオンにします。
- ガス流量のレベルを設定するには、イメージングチャンバーにガス流量をオンにします。 0.25 LPMに設定してから、ガス流量をオフにしてください。
- ガス流量のレベルを設定するには、麻酔導入チャンバーにガス流量をオンにします。 1.5 LPMに設定してから、ガス流量をオフにしてください。
- 気化器と2から2.5パーセントに設定してイソフルランをオンにします。イソフルランレベルが使用されている動物や体重の数に応じて調整することができます。
- 誘導室にマウスを置き、蓋を閉じます。誘導室へのガスの流れをオンにします。 5室の場所をマウス - 10 minuitesは、彼らが完全に麻酔されるまで。
- 撮像中にマウスの目を保護し、麻酔マニホールドのノーズコーンのいずれかでの撮像室内でマウスを配置する目に光軟膏を適用します。隣接する動物の被験者に光の反射を防ぐために、マウスとの間の光バッフルを使用してください。
- 腹腔内接種によるルシフェリン（150μgの/体重1g）注入。
3。生物発光イメージング
- リビングのイメージングソフトウェアを起動します。
- システムが初期化されていない場合、IVISイメージングシステムを初期化する。
- IVIS取得コントロールパネルでのシーケンスのセットアップをクリックして、イメージングのためのパラメータを設定します。
イメージングモードでの発光と写真を選択してください。 DLIT 3次元再構成を実施するためのオプションを希望する場合は、イメージシーケンスの一部として、写真の発光性と構造的な光の画像を選択します。
0.5秒から10分まで露光時間を設定します。
サンプルの予想される明るさに基づいて、ビニングとF /停止を設定します。
光の特定波長を取得することを計画していない限り、開こうとするフィルタブロックおよび排出にフィルタ励起を設定します。 DLIT 3D憲法の場合には、ソースの正確な局在を可能にするために波長の異なる複数の発光フィルターを設定します。
マウスまたは動物の地域イメージを作成する数に応じてDにからFOVを設定します。 4月5日マウスのために1マウス、2-3マウスのためのC、およびDのAとBを選択します。 - シーケンスの設定を追加するには、買収の[コントロールパネル]の[イメージウィザードで[追加]をクリックします。
- 取得をクリックして、撮像シーケンスを開始します。
DLIT 3D構造の場合には、蛍光画像は、異なる波長の複数の発光フィルター用に取得されます。写真と構造化された光の画像も取得されます。 - 買収時に画像と画像のレベルのパネルを編集するには、表示されます。後で倍で画像の簡単なトラッキングを保証して画像を保存する編集画像内の各実験のため、可能な限り詳細な情報を入力します。
- IVISイメージングチャンバーからマウスをReRemoveとそのケージに戻す。からの回復を観察マウスを確保するために感覚が大幅に手順により影響されなかった。彼らは完全に麻酔（通常1〜2分）から回復するまでの動物は、常に監視する必要があります。
肺の中の細菌の定量4。ex vivoでのイメージングおよびCFU分析
- 安楽死の直前に、イメージングのためのと同様の方法でルシフェリン腹腔内でマウスを注入する。
- ルシフェリンの投与後に100 mg / kgをpentobarbitol 5分の腹腔内注射によってマウスを安楽死させる。
- 滅菌ピンセットやハサミを用いて滅菌ペトリ-皿のマウスと場所から肺を外植片。
- 場所シャーレイメージングチャンバーの外植臓器を含むと全体のマウスの場合と同じ方法で生物発光画像を取得する。
- イメージング後、滅菌ピンセットを用いてペトリ皿から植臓器を削除し、1mLのPBS中でホモジナイズする。
- 適切な選択培地で希釈し、プレートの組織を作る。ホモジナイズした組織は、それが必要でなければ、再メッキのために-80℃で保存することができます。また、ホモジナイズした組織は、定量PCRによって細菌数を定量化するRNAまたはDNAの抽出に使用することができます。
5。発光イメージングの解析
- "リビングイメージングソフトウェア"を起動し、画像ファイルを参照します。
- 画像を調整する"ツールパレット"を使用してください。個別のカラースケールの補正/フィルタ処理の設定と最小/最大を変更するために調整し、画像をクリックする。
- 光強度の定量化のためのプルダウンリストで、ROIツールを使用してください。 ROIの形状、数およびサイズを選択してください。画像上に関心領域にROIのフレームをドラッグします。すべてのROIが同じサイズと形状であることを確認してください。 ROIの測定をクリックし、保存、コピーおよび/または定量的なデータをエクスポートする。
- DLIT 3D再構成の場合には、構造化された光の像を含む画像シーケンスをロードする。ツールプラットの表面形状をクリックします。プルダウンリストで、表面形状を生成するためのタブを再構築]をクリックします。表面の混乱は、ウィンドウに表示されます。
- ツールプラットのDLIT 3D再構築]を選択します。プルダウンリストでは、組織特性やソースのスペクトルを設定するには、[プロパティ]タブをクリックします。筋肉は、ほとんどの状況下で推奨されます。プルダウンリストでは、分析のための波長を選択するために分析タブをクリックします。パラメータタブをクリックし、デフォルトの値を確認するか、必要に応じてDLITパラメータを調整する。 3D解析を開始するためにタブを再構築]をクリックします。
- 3次元再構成が終了すると、3Dビューでは、3D再構成の結果が表示されます。光子密度、ボクセルとDLITアルゴリズムパラメータの解析データを表示するには、結果のタブをクリックします。
- 保存して/または数値とデータファイルに3D再分析の結果をエクスポートする。
6。代表的な結果：
非感染マウスのコントロールと一緒に生物発光細菌に感染したマウスの生物発光画像を図1に示されています。生物発光細菌に感染したマウスの肺は、肺（図1）から有意な信号を生成する。発光強度は、ROI内の全光束（関心のある領域）（図2）として定量化されます。光強度の定量的データは、信号が生物発光細菌から生産されており、ネガティブコントロールと比較することができることを確認するために、肺から得られた細菌のコロニー形成単位（CFU）のために正規化されています。信号の位置と強度はさらに、マウスの表面11の断層撮影法に基づいて、発光源のDLIT 3次元復元によって分析することができます。これらの分析は、生成される生物発光シグナルの定量化とローカライズを可能にする。感染マウスの発光源の3D再構成の結果は、光がマウスの肺（図3）から生産されていることを示しています。その発光確認の結果、マウスの肺のex vivoでのイメージは、むしろいくつかの他の密接に並置された組織または器官（図2C）よりも、肺から放出される。
図1。 CBRlucでタグ付けされた生物発光細菌による肺感染マウスの発光イメージング。非感染コントロールマウスは左側にであり、2つの感染マウスが右側にあります。マウスは、気管内経路を経由してCBRluc（N = 2）を発現する細菌に感染していた。背、腹、左側と右側：ルシフェリンの注射後10分は、発光の画像は4ポジションで10分間を取得した。
図2。 CBRlucを表現する細菌に感染したマウスからの定量的な光強度（A、B）ROI分析と背側と腹側の位置におけるROIからの光の定量化全光束の発光イメージを、それぞれ。非感染マウスは左側に、もう2つに感染したマウスは右側にあります。発光画像は、肺oから取得したFマウス感染していないとCBRlux（N = 2）に感染している。肺の周りの光強度は、ROIの分析により定量した。 C）（肺の下部にある二組）感染していない（上）と感染マウスからの肺の ex vivo での画像が。その後、買収された安楽死と画像の前にルシフェリンを5 miniutsを注入した。定量値は、CFUに正規化されます。
図3。肺感染マウスからの生物発光源の3次元再構成（複数可）。マウスは、気管内注入によるCBRlucを表現する細菌を感染させた。イメージシーケンスは540〜700 nmまでのシリアル波長の異なる発光フィルターを用いて取得された。イメージシーケンスは、構造化されたIMAGが含まれている動物の被験体における発光源のための3D再構成のために使用されていました。左と右、背面、前面：A）マウスのための断層撮影は、異なる位置に表示されます。光源は、再建によって決定される肺内に配置されているボクセル（3Dマウス内の赤いボックス）として表示されます。 B）実測データとシミュレーションデータのフォトンdensiyマップが。測定値とシミュレートされた光子の密度曲線を比較すると、再建の質の情報を提供しています。同様の測定値とシミュレートされた光子の密度で良好な品質の再構成結果。
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Discussion
これらのプロトコルは、通常、高品質の画像につながる次のようですが、それは、イメージングの研究から、正確で一貫性のあるデータを得るためにいくつかの主要な問題を考慮することが重要です。発光画像は、信号が背景の上にあるとカメラが飽和されていないことを保証するために600〜60,000カウントを持っていることを取得しておく必要があります。得られた信号は600m以内であれば露光条件は、数を増やすに調整する必要があります。得られた信号が60,000を超えている場合は、カメラが一部の地域で飽和している。カメラが飽和している場合、定量化は、それはまだ可能ですが、飽和領域で試みられ、非飽和領域で、時には必要なことではありません。地域を再建するためのマスクに使用されている領域内に含まれる飽和したときに加えて、3次元再構成を正確に行うことができます。露光時間の調整は、画像取得だけでなく、撮像領域の変更や動物の位置のためのビニングとF /ストップは、得られた信号を制御し、データの定量分析を許可することができます。従って、多くの実験では、画像の少なくとも1組の定量的な分析を可能にするために必要な限度内であることを保証するために複数の露光条件下でconsistentlyのイメージ動物に便利です。
任意のレポーター遺伝子の発現がイメージングに使用される組換え体株でフィットネスへの潜在的な影響を評価するためのパイロットスタディを実施することが必要なこと、病原性に影響を与えることができる覚えておくことが重要です。それは、細菌における外来遺伝子の発現を必要とするので、これは、生物発光イメージングの限界の一つです。これは、多くの場合、その影響で異なる場合があります複数の発光レポーター系の代謝又は審査への影響を軽減するために、レポーター遺伝子の発現レベルの滴定を検討する細菌種のために適切なコドン使用頻度を使用する最適化された構文を使用することによって克服することができるフィットネスで。
感染性病原体によるイメージング研究のもう一つの主要な変数は、撮像され、エージェントによって生成される信号のレベルです。 インビトロと比較して、動物における各エージェントの検出のしきい値に違いがあるので、それは、パイロットスタディは、より広範な実験を実施する前に、エージェントの数を最適化するために、複数の感染用量を使用することをお勧めします。生物発光レポーター自身も、生成された信号のレベルができるだけ高くなることを保証するために、転写、翻訳および低毒性のために最適化する必要があります。記者の最適化は、in vitroで 、ほとんどの場合で行うことができますが、発光の波長は、またそれが重要な直接の動物に別の記者を評価すること、哺乳動物の組織に浸透し、最適なレポーターによって生成能力の光に影響を与えます。各動物は動物の間で変動の大きい取り引きのため制御する、個々に続くことができますが、それはまだ決定されるグループ間の統計的有意性を可能にするために十分な動物を含める必要があります。通常、動物の数は4になります - 1群6、多くの場合に観察されるグループの間に2倍と低いの違いを可能にする。最後に、適切な組織へと正確なエージェントの数の配信の接種経路と精度は、動物の間の全体的なばらつきを減らすことによって、一貫性のある結果を確保するために役立ちます。
生成される生物発光のスペクトル特性はまた、 インビボでの画像の感染する能力に影響を与える重要な要因です。哺乳類の組織では、波長の光より小さい600ナノメートルは、主に哺乳動物の組織の主要成分、ヘモグロビンによって吸収されています。生物発光の波長のための浸透の深さが大幅に600ナノメートル8,12より長い波長のために増加する。 CBRlucとFFluc両方でも7月8日 、肺、肝臓などの深部組織に、in vivoイメージングのためのほぼ理想的な記者これらのルシフェラーゼを作る、600以上の波長を含む広い波長で発光を生じる。
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Disclosures
動物研究は、テキサスA＆M大学の動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。
Acknowledgments
著者らはこの研究を通して貴重な議論と支援をCirillo研究室のメンバーに感謝。我々は、博士ジョシュアヒルとこのプロトコルの撮影時の支援のための博士はジェームズサミュエルの研究室に感謝。この作品は、国立衛生研究所から、ビル＆メリンダゲイツ財団と助成金AI47866から助成金48523によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathether (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | ||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
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