Summary
생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.
Abstract
이미징은 생물 학적 과정을 모니터링하는 데 사용할 수있는 가치있는 기술입니다. 특히, 암 세포, 줄기 세포, 특정 면역 세포 유형, 바이러스 병원균, 기생충 및 박테리아의 존재는 동물 1-2 생활 내에서 실시간으로 따라 수 있습니다. 병원균의 연구에 bioluminescence 이미징의 응용 3-4 동물 모델에서 감염의 분석을 위해 기존의 전략에 비해 장점이 있습니다. 감염은 병원균의 위치와 수량을 결정하기 위해 안락사를하지 않고, 시간이 지남에 따라 각각의 동물 이내 시각하실 수 있습니다. 광학 이미징 오히려 이전에 감염된 것으로 알려져 사이트의 샘플링보다, 모든 조직과 기관의 종합적인 시험을 수 있습니다. 또한, 특정 조직에 접종의 정확성 직접 사전에 실패는 전체 실험에 걸쳐 주사했다 앞으로 동물을 운반하는 결정하실 수 있습니다. 이미지는 각 동물이 개별적으로 따라야하는 수 있기 때문에 동물 사이의 변화가에 대해 제어할 수 있습니다. 이미징 크게 때문에 3-4 병원체 부하를 확인하기 위해 샘플 조직하지 않고 많은 시간이 지점에서 데이터를 얻을 수있는 능력을 필요로 동물의 숫자를 줄일 수있는 잠재력이있다.
이 프로토콜은 루시페라제을 표현하는 박테리아의 재조합 변종에 대한 bioluminescence 이미징을 사용하여 살아있는 동물에 감염을 시각화하는 방법을 설명합니다. 클릭 벌레 (CBRLuc)와 반딧불 luciferases (FFluc)는 기판 5-6로 luciferin을 활용한다. CBRluc와 FFluc 모두에 의해 만들어진 빛이 살아있는 동물 모델 7-9에서 광학 이미징 이러한 luciferases 훌륭한 기자 만들기, 500 nm의 700 nm의 파장에 대한 광범있다. 600 NM보다 빛의 파장은 헤모글로빈에 의해 흡수를 방지하고, 따라서, 효율적으로 포유 동물 조직을 통과하는 데 필요한 때문에 주로이다. 루시페라제는 유전자 빛의 신호 10 생산하는 세균에 소개됩니다. 마우스 실시간으로 감염 모니터링을 허용하는 intratracheally 발광 생물 박테리아와 주사 폐 있습니다. luciferin 주입 후, 이미지가 IVIS 이미징 시스템을 사용하는 인수입니다. 이미징 동안 마우스 XGI - 8 가스 Anethesia 시스템을 사용하여 isoflurane과 anesthetized 있습니다. 이미지가 집중하고 각각의 세균 감염 사이트 (S)과 전화 번호를 나타내는 신호 소스를 수치 분석하실 수 있습니다. 이미징 후, CFU 결정은 박테리아의 존재를 확인하는 균질 조직에서 수행됩니다. 박테리아의 여러 복용은 발광과 세균 숫자를 상관 관계를 규정하는 데 사용됩니다. 이미징은 항균 화합물과 백신의 효능의 pathogenesis 및 평가 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. Intratracheal 삽관법 의한 폐 감염
- 마우스의 무게를하며, 선택, 마르크는 쉽게 식별이 귀에 만들 수 있습니다.
- intraperitoneal 접종하여 마취제 (마우스 중량 g 당 100 μg)과 xylazine (마우스 중량 g 당 10 μg)와 생쥐를 마취.
- 완전히 anesthetized까지 새장에 넣어 마우스. 페달 반응을 확인하기 위해 피트의 패드를 당겨요. 생쥐는 감소하거나 전혀 반사 반응이 표시되어야합니다.
- 그 누워 삽관법 스탠드에 마우스를 놓습니다.
- 삽관법 스탠드에 고무 밴드를 수정 후 마우스의 상단 incisors 아래로 놓으십시오. 다리와 삽관법 스탠드에 무기를 해결하기 위해 테이프를 사용하십시오.
- 부드럽게 집게를 사용하여 입 밖으로 tougue 이동합니다.
- 입 octoscope 내부와 검경를 삽입하고 후두의 오프닝을 볼 때까지 oropharynx 조사.
- catether 허브까지 기관에 cathether으로 덮여 사전 가이드 와이어 incisors에 있습니다. 가이드 와이어를 제거합니다. 가슴 확장을 관찰하고 올바른 삽관법을 확인 cathether에 공기를 넣어.
- 세균의 50 μL를 1 ML의 주사기를 사용하여 cathether을 통해 솔루션 (우리 연구실에 지어진를 클릭 비틀 레드 루시페라제 (CBRLuc)를 표현 바실 Calmette 게린 (BCG)를 사용하지만, 어떤 발광 세균의 변형을 사용할 수 있습니다 표시된 이미지) 주사.
- 새장에 마우스를 대고 마취에서 회복하는 동안 그것을 관찰합니다.
2. 동물 Anesthetization 및 Bioluminescence 이미징을위한 준비
생쥐는 XGI - 8 가스 Aneshesia 시스템을 사용하여 isoflurane과 anesthetized 있습니다.
- XGI - 8 마취 시스템을 운영하기 전에, 각 숯 필터 용기를 무게와에있는 무게와 날짜를 써주세요. 무게 초기 무게 이상의 50g있다면, 새로운 용기로 교체하십시오.
- 기화기의 isoflurane 수준을 확인하고 필요한 경우 정보를 입력합니다.
- XGI - 8 마취 시스템의 전면에있는 피난 펌프를 켜고, 8 lpm (minuite 당 리터)로 설정합니다.
- 고압 실린더의 산소 공급 켜고 55 psig로 설정합니다.
- XGI - 8 마취 시스템의 전면에 토글 산소 (녹색)를 켭니다.
- 가스 흐름의 수준을 설정 이미징 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 0.25 lpm로 설정하고 가스 흐름을 해제하십시오.
- 가스 흐름의 수준을 설정하기 위해 마취 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 1.5 lpm로 설정하고 가스 흐름을 해제하십시오.
- 기화기 및 2-2.5 %로 설정된 isoflurane를 켭니다. isoflurane 수준은 사용중인 동물과 체중의 숫자에 따라 조정할 수 있습니다.
- 장소는 유도 챔버에 마우스 및 뚜껑을 닫습니다. 유도 챔버에 가스 흐름을 켜십시오. 5 챔버에 넣어 마우스 - 10 minuites 그들은 완전히 마취까지.
- 이미징 동안 마우스 눈을 보호하고 마취 매니폴드에 코 콘 중 하나에서 이미징 챔버에 쥐를 곳으로 눈 광학 연고를 적용하십시오. 인접 동물 과목에 빛의 반사를 방지하기 위해 마우스 사이의 가벼운 배플을 사용합니다.
- intraperitoneal 접종에 의해 luciferin을 (150 μg / 체중 g) 주입.
3. Bioluminescence 이미징
- 생활 이미징 소프트웨어를 시작합니다.
- 시스템이 초기화되지 않은 경우 IVIS 이미징 시스템을 초기화합니다.
- IVIS 수집 제어판의 순서 설정을 클릭하여 영상에 대한 매개 변수를 설정합니다.
이미징 모드에서 발광하고 사진을 선택합니다. DLIT 3D 재구성을 수행하는 옵션을 원하는 경우, 이미지 시퀀스의 일부로, 사진 발광 및 구조 밝은 이미지를 선택합니다.
0.5 초에서 10 분 거리에 노출 시간을 설정합니다.
비닝 및 F / 설정 샘플의 예상 밝기에 따라 중지합니다.
빛의 특정 파장를 얻기위한 계획하지 않는 한, 블록 및 오픈 필터 배기 필터 여기를 설정합니다. DLIT 3D 헌법의 경우, 소스의 정확한 현지화 수 있도록 서로 다른 파장의 여러 방출 필터를 설정합니다.
마우스 또는 동물의 지역 몇 군데로의 숫자에 따라 D로의 FOV를 설정합니다. 4-5 생쥐 1 마우스, 2-3 마우스에 대한 C 및 D에 대한 A와 B를 선택합니다. - 순서 설정을 추가 취득 제어판의 이미지 마법사에서 추가를 클릭합니다.
- 취득을 클릭하여 이미지 시퀀스를 시작합니다.
DLIT 3D 구조의 경우, 발광 이미지는 서로 다른 파장에서 여러 방출 필터 취득한 것입니다. 사진 및 구조 밝은 이미지도 인수한다. - 수집하는 동안 이미지 및 이미지 레벨 패널을 편집 표시됩니다. 편집에서 각 실험 나중에 시간에 이미지를 쉽게 추적을 보장하고 이미지를 저장하는 이미지에 대해 가능한 한 자세한 정보로 채웁니다.
- IVIS 이미징 챔버에서 쥐를 ReRemove 그들의 연습장을 반환합니다. 회복을 준수마우스를 보장하기 위해 esthesia이 크게 절차에 의해 영향을받지 않았습니다. 그들은 완전히 마취 (대개 1-2 분)에서 복구까지 동물을 지속적으로 모니터링해야합니다.
4. 예 생체내 이미징 및 폐의 박테리아의 부량에 대한 CFU 분석
- 안락사에 직전, 화상에 대해 같은 방식으로 luciferin intraperitoneally와 쥐를 주사.
- luciferin 주입 후 100 MG / kg pentobarbitol 5 분의 intraperitoneal 주사하여 쥐를 안락사.
- 무균 집게와 가위를 사용하여 무균 배양 - 요리에 마우스 및 장소에서 폐가 Explant.
- 플레이스 배양 - 요리 영상 약실에 explanted 기관을 포함하여 전체 마우스 같은 방식으로 bioluminescence 이미지를 획득.
- 이미징 후, 멸균 집게를 사용하여 배양 접시에서 explanted 기관을 제거하고 1 ML PBS에서 균질.
- 적절한 선택 미디어에 dilutions 및 플레이트 조직을 만듭니다. 균질 조직은 그것이 필요해야 다시 도금을위한 -80 ° C를 저장할 수 있습니다. 또는 균질 조직은 RNA 또는 qPCR에 의해 박테리아 숫자를 정할 DNA 추출에 사용할 수 있습니다.
5. 발광 이미징 분석
- "생활 이미징 소프트웨어"를 시작하고 이미지 파일을 찾습니다.
- 이미지 조정 "도구 팔레트 '를 사용합니다. 이미지를 클릭 보정 / 설정 및 분 / 개인 색상 비늘을위한 최대 필터링을 수정할 수 조정합니다.
- 빛의 강도의 부량 위해 풀다운 목록에서 투자 수익 (ROI) 도구를 사용하십시오. 선택 투자 수익 (ROI) 모양, 번호와 크기입니다. 이미지의 관심 영역에 드래그 투자 수익 (ROI) 프레임. 모든 투자 수익 (ROI)가 동일한 크기와 모양 있도록. 클릭하여 투자 수익 (ROI) 측정 및 저장, 복사 및 / 또는 양적 데이터를 내보낼 수 있습니다.
- DLIT 3D reconstructions의 경우, 구조 밝은 이미지를 포함한 이미지 시퀀스를로드합니다. 플래트 도구의 표면 지형을 클릭합니다. 풀다운 목록에서 표면 지형을 생성 탭을 재구성을 클릭합니다. 표면 엉망 그러면 창에 나타납니다.
- 도구 플래트에 DLIT 3D 재구성을 선택합니다. 풀다운 목록에서 조직 속성과 소스 스펙트럼을 설정하는 속성 탭을 클릭합니다. 근육은 대부분의 상황에서 권장합니다. 풀다운 목록에서 분석 파장을 선택하기 위해 분석 탭을 클릭하십시오. 매개 변수 탭을 클릭하고 기본값을 확인하거나 필요한 경우 DLIT 매개 변수를 조정합니다. 3D 분석을 시작 탭을 재구성 클릭하십시오.
- 3D 재건이 완료되면, 3D보기 3D 재건의 결과를 표시합니다. 광자 밀도, voxels 및 DLIT 알고리즘 매개 변수에 대한 분석 데이터를 볼 결과 탭을 클릭합니다.
- 저장 및 / 또는 숫자 및 데이터 파일에 3D 재건 분석의 결과를 내보냅니다.
6. 대표 결과 :
감염되지 않은 마우스 컨트롤과 함께 발광 생물 박테리아에 감염된 생쥐의 bioluminescence 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 발광 생물 박테리아에 감염된 쥐 폐는 폐 (그림 1)에서 중요한 신호를 생산하고 있습니다. 발광 강도는 투자 수익 (ROI) 내에 총 유량 (관심 영역의) (그림 2)로 계량입니다. 빛의 강도에 대한 정량적 데이터는 신호가 발광 생물 박테리아에서 생산하고 대조군에 비해 수 있는지 확인하기 위해 폐에서 얻은 박테리아의 콜로니 형성 단위 (CFU)에 대한 표준입니다. 신호의 위치와 강도는 더욱 마우스 표면에 11 tomography에 따라 발광 소스의 DLIT 3 차원 재구성하여 분석하실 수 있습니다. 이러한 분석은 부량 및 생산 발광 생물 신호의 지방화를 허용합니다. 감염된 생쥐에서 발광 소스 3D 재건의 결과는 표시등이 마우스의 폐 (그림 3)에서 생산 보여줍니다. 그 발광 확인 결과 마우스 폐의 전직 생체내 이미지는 오히려 다른 밀접하게 juxtaposed 조직 또는 기관 (그림 2C)보다, 폐에서 배출됩니다.
그림 1. CBRluc 태그 발광 생물 박테리아와 폐 감염 마우스의 발광 이미징. 감염되지 않은 컨트롤 마우스 왼쪽에 두 감염된 생쥐는 오른쪽에 있습니다. 생쥐는 intratracheal 경로를 통해 CBRluc (N에게 = 2)을 표현하는 박테리아에 감염되었습니다. 지느러미, 복부, 왼쪽 및 오른쪽 : luciferin 주입 후 10 분, 발광 이미지는 4 순위 10 분 취득했다.
그림 2. CBRluc을 표현하는 박테리아에 감염된 생쥐에서 양적 빛의 강도. (A, B) 투자 수익 (ROI) 분석 및 지느러미 및 복부 위치에서 투자 수익 (ROI)에서 빛의 계량 총 자속의 발광 이미지, 각각. 감염되지 않은 마우스는 왼쪽에있는 두 감염된 생쥐는 오른쪽에 있습니다. 발광 이미지는 폐 O로부터 얻은되었습니다F 쥐를 감염되지 않은 그리고 CBRlux 감염 (N = 2). 폐 주변의 빛의 강도는 투자 수익 (ROI) 분석에 의해 계량했다. C) 감염되지 않은 (위) 및 감염 (아래 폐 두 세트)를 생쥐의 폐의 전직의 생체내 이미지. 다음 인수했다 안락사와 이미지의 전 Luciferin 5 miniuts을 주입했다. 계량 값은 CFU으로 표준 수 있습니다.
그림 3. 폐 감염 마우스 bioluminescence 소스 (S)의 3D 재구성은. 마우스 intratracheal 주사로 CBRluc을 표현하는 박테리아에 감염되었습니다. 이미지 시퀀스는 540 nm의 700 nm의 파장에 일련의 다른 방출 필터를 사용하여 인수되었다. 이미지 시퀀스 구조 imag가 포함된 동물 과목에서 발광 소스 3D reconstitution 사용되었다. A) 마우스에 대한 tomography은 다른 위치에 표시됩니다 : 앞, 뒤로, 왼쪽 및 오른쪽. 광원은 재건축에 의해 결정으로 폐 내에 위치하고 있습니다 voxels (3D 마우스 이내에 빨간색 상자)로 표시됩니다. 측정 및 시뮬레이션 데이터의 B) 광자 densiy지도. 측정 및 시뮬레이션 광자 밀도 곡선은 재건의 품질 정보를 제공하는 비교. 유사한 측정 및 시뮬레이션 광자 밀도의 양질의 reconstructions 결과.
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Discussion
이러한 프로토콜을 다음과 같은 일반적으로 고품질 이미지를 얻을 수 있지만, 그것은 영상 연구에서 정확하고 일관된 데이터를 얻기 위해 몇 가지 주요 문제를 고려하는 것이 중요합니다. 발광 이미지는 신호가 배경 위에되고 카메라가 포화되지 않도록하기 위해 600 60000로 카운트를 갖고 취득해야합니다. 얻은 신호 미만 600 경우 노출 조건은 카운트를 증가 조정해야합니다. 얻은 신호가 60,000 이상의 경우 카메라는 일부 지역에서 포화 수 있습니다. 카메라가 포화되면, 부량은 아직 가능하지만, 포화 지역의 시도와 비 포화 지역에 따라 때로는 필요 없을 것입니다. 지역이 재건을위한 마스크에 사용되고있는 지역 내에 포함되어있는 포화 때 또한, 3 차원 재구성 정확하게 진행하실 수 없습니다. 노출 시간의 조정, 비닝 및 F / 정지 영상 취득뿐만 아니라 이미징 지역이나 동물 위치 수정 얻은 신호를 제어 및 데이터의 정량 분석을 허용할 수 있습니다. 따라서, 많은 실험에 이미지 하나 이상의 집합이 정량 분석을 허용하는 데 필요한 범위 내에서 될 수 있도록 다중 노출 조건 하에서 지속적으로 이미지 동물 도움이됩니다.
모든 리포터 유전자의 표현을 기억하는 것이 중요하다 그것이 필요한 이미징을 위해 사용됩니다 recombinants의 종자의 적합성에 대한 잠재적인 영향을 평가하는 시험 연구를 수행하고, 독성에 영향을 줄 수 있습니다. 그것은 박테리아가 외국 유전자의 표현을 필요로하기 때문에 이것은 발광 생물 이미징의 한계 중 하나입니다. 이것은 종종 자신의 영향에 따라 다를 수도 있습니다 여러 개의 발광 기자 시스템의 대사 또는 검사에 미치는 영향을 줄이기 위해, 기자의 유전자 for 표현 수준의 적정을 연구하는 세균 종에 해당하는 코돈 사용을 사용하여 최적화된 구성의 사용을 통해 극복있을 수 있습니다 피트니스에.
전염성 요원들과 이미징 연구에 대한 또 다른 주요 변수는 몇 군데되는 에이전트에 의해 만들어진 신호의 레벨입니다. 체외에서에 비해 동물의 각 에이전트에 대한 검색의 문턱에 차이가 있기 때문에, 그것은 이전 에이전트 번호를 최적화하기위한 여러 전염성 복용을 사용하여 시범 연구보다 광범위한 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 발광 생물 기자 스스로도 생산 신호의 레벨이 가능한 높은 수 있도록, 전사, 번역 및 낮은 독성에 최적화된해야합니다. 기자의 최적화는 체외에서 대부분의 경우 수행할 수 있습니다하지만, 발광의 파장은 또한 중요한 직접 동물에서 다른 기자들을 평가하고, 포유 동물 조직에 침투하는 최적의 기자에 의해 생산 능력 조명에 영향을 것입니다. 각 동물이 동물의 다양성의 좋은 거래를 통제하는, 개별적으로 다음 수 있지만, 그것은 그룹간에 통계 중요성을 결정 수 있도록 충분한 동물을 포함 여전히 필요합니다. 보통 동물의 숫자는 4 있어야합니다 - 그룹 당 6, 많은 경우에 관찰되는 그룹 사이 두 배 이상으로 낮은 차이를 수 있도록합니다. 마지막으로, 접종 경로 및 해당 조직에 전달 및 정확한 에이전트의 숫자 정확성 동물 사이의 전반적인 다양성을 감소시켜 일관된 결과를 보장하는 데 도움이 될 것입니다.
생산 bioluminescence의 스펙트럼 특성은 또한 생체내의 이미지를 감염하는 능력에 영향을 미치는 중요한 요소이다. 포유 동물 조직에서 파장 이하 600 NM의 조명은 크게, 헤모글로빈의 포유 동물 조직의 주요 구성 요소를 흡수하고 있습니다. bioluminescence의 파장에 대한 침투의 깊이가 크게 파장에 대한 이상 600 nm의 8,12을 증가시킵니다. CBRluc 및 FFluc 모두도 폐, 간 7-8를 포함하여 깊은 조직에 생체내 이미징에서 이러한 luciferases 거의 이상적 기자 만들기, 600 nm의를 포함하여 광범위한 파장과 bioluminescence를 생성합니다.
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Disclosures
동물 연구는 텍사스 A & M 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
저자는 본 연구를 통해 가치있는 토론 및 지원에 대한 시릴 실험실 구성원을 감사드립니다. 우리는이 프로토콜을 찍는 동안 박사와 여호수아 힐과 도움 박사 제임스 사무엘의 실험실 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원에서 빌 & 멜린다 게이츠 재단과 부여 AI47866로부터 부여하여 48,523 후원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | VETONE | 501027 | |
| Ketamine | Butler Animal Health Supply | ||
| Xylazine | MP Biomedicals | 158307 | |
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | |
| Fetal plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
| Cathether (22G x 1”) | Terumo Medical Corp. | OX2225CA | |
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | |
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | |
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | ||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | ||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | ||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
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