Summary
نموذج دقيق لإصابة الفئران الكلى الحاد (آكي) نتيجة لنقص التروية هو أداة مهمة للتحقيق في إصابة حادة في الكلى وربما تجد الأدوات العلاجية لعلاج اصابة في الكلى. نظام الوزن معلقة يقدم أداة لفورية وموثوقة انسداد الشريان الكلوي وضخه دون التسبب في ازدحام الكلوي.
Abstract
في المرضى في المستشفى ، وتحدث أكثر من 50 ٪ من حالات الإصابة كلوي حاد (كونا) عن طريق نقص تروية الكلى 1-3. كشفت دراسة حديثة لمرضى المستشفى مقترن سوى زيادة معتدلة في مستويات الكرياتينين في المصل (0،3-0،4 ملغ / دل) مع 70 ٪ خطر أكبر للوفاة في الأشخاص من دون أي زيادة بنسبة 1. على طول هذه الخطوط ، والعمليات الجراحية التي تتطلب عبر لقط ترتبط من الشريان الأورطي والأوعية الكلوية مع معدلات الفشل الكلوي لمدة تصل إلى 30 ٪ 4. وبالمثل ، AKI بعد الجراحة القلبية يحدث في أكثر من 10 ٪ من المرضى في ظل الظروف العادية ويترافق مع زيادة كبيرة في معدل الوفيات. AKI هي أيضا المضاعفات شيوعا بعد زرع الكبد. ما لا يقل عن 8-17 ٪ من مرضى الكلى في نهاية المطاف تتطلب العلاج ببدائل 5. علاوة على ذلك ، كثيرا ما يرتبط تأخر الدالة الكسب غير المشروع بسبب الاصابة الخلية نبيب خلال زرع الكلى لنقص تروية المرتبطة آكي 6. علاوة على ذلك ، AKI يحدث في حوالي 20 ٪ من المرضى الذين يعانون من تسمم 6. يرتبط حدوث AKI مع الزيادات الكبيرة في معدلات الاعتلال والوفيات 1. محدودة جدا النهج العلاجي وغالبية التجارب التداخلية في AKI فشلت في البشر. لذا ، هناك حاجة ماسة إلى طرائق علاجية إضافية لمنع اصابة الكلى من نقص التروية 3 ، 7-9.
لتوضيح آليات إصابة الكلى نتيجة لنقص التروية والاستراتيجيات العلاجية الممكنة الفئران نماذج مطلوبة بكثافة 7-13. نماذج الماوس توفير إمكانية الاستفادة من نماذج مختلفة بما فيها الجينات الوراثية التي تستهدف أنسجة الفئران والجينات المحددة التي تستهدف الفئران (لجنة المساواة العرقية ، flox النظام). ومع ذلك ، نقص تروية الكلى الفئران يمثل تحديا تقنيا وتفاصيل تجريبية لها تأثير ملموس على النتائج. أجرينا إجراء تقييم منهجي للنموذج رواية للعزلة انسداد الشريان الكلوي في الفئران ، والتي تتجنب على وجه التحديد استخدام لقط أو خياطة في 14 عنيق الكلوي. هذا النموذج يتطلب استئصال الكلية من الكلية اليمنى منذ نقص التروية يمكن تنفيذها فقط في كلية واحدة بسبب الإعداد التجريبية. في الواقع ، وذلك باستخدام نظام التعليق الوزن ، الشريان الكلوي هو المجهزة مرة واحدة فقط طوال العملية الجراحية. بالإضافة إلى ذلك ، أي انسداد مجرى البول أو وريدي يحدث مع هذه التقنية. يمكن أن نظهر للوقت تعتمد على الجرعة وتكرار الاصابة الكلوية للغاية مع نقص التروية من خلال قياس الكرياتينين في المصل. علاوة على ذلك ، عند مقارنة هذا النموذج الجديد مع لقط التقليدية لحماية وعنيق كلها شروط مسبقة من قبل الكلوي الدماغية هي أكثر عمقا وأكثر موثوقية. لذا قد يكون أسلوبه الجديد مفيدا لغيره من الباحثين الذين يعملون في مجال إصابة الكلى الحاد.
Protocol
يجب أن يتم تنفيذ ملاحظات عامة جميع العمليات تحت مجهر تشريح تستقيم (لايكا) وباستخدام مخثار الجراحية. وينبغي أن تكون مطابقة للفئران في المجموعات التجريبية في العمر والوزن لضمان إمكانية المقارنة بين النتائج. وينبغي أن درجة الحرارة وضغط الدم والتخدير وسائل الإدارة أن تكون مستقرة ورصدها أثناء التجربة.
1. التخدير والجراحة
- اما التجارب يمكن أن يؤديها نقص تروية الكلى في وقت واحد مع تطبيق نقص التروية وضخه إلى كل من الكليتين ، أو بعد استئصال الكلية واحدة في الجمع بين العلاج مع نقص التروية في الكلى المتبقية. كما يرتبط الثنائية علاج نقص التروية من كلا الكليتين مع زيادة الصعوبات التقنية ، وهو وضع أكثر تعقيدا وأطول عملية جراحية تجريبية ، سنقوم بإجراء استئصال الكلية اليمنى تليها العلاج نقص تروية الكلى اليسار المتبقية من خلال الاستفادة من نظام الوزن شنقا. نحن تستخدم هذا النظام أيضا على الوزن شنقا انسداد الشريان التاجي في القلب. ومع ذلك ، فإن الإجراء مختلف حيث يمكن عزل الشريان الكلوي من الأنسجة المحيطة بها في حين ان الشريان التاجي الذي يقع في عضلة القلب.
- والفئران (8-14 أسابيع من العمر ، إما الجنس) مع بنتوباربيتال يكون تخدير بجرعة 70mg/kg. وسوف نحافظ على تخدير مع تقريبا. 10 مغ / كغ / ح بنتوباربيتال الصوديوم. ويمكن زيادة الجرعة أقل بشكل ملحوظ من ضغط الدم ، وبالتالي يمكن أن يغير النتائج. في دراساتنا الأولية كنا أيضا الكيتامين وزيلازين. ومع ذلك ، بفعل هذه المركبات a بطء القوية (150 / دقيقة). بجانب بطء وحظ أن هناك أيضا أدلة على أن تشارك كل من المركبات في آليات الحماية من خلال ظروف نقص التروية. لا يمكن أن يستخدم التخدير المضطربة إما بسبب قدرتها على حمل أيضا حماية الكلى وضغط الدم المنخفض. ولذلك فإن خيارنا النهائي للتخدير بنتوباربيتال. بالإضافة إلى ذلك ، في المقام الأول تفرز الكيتامين وزيلازين عن طريق الكلى. استئصال الكلية ونقص التروية قد يطيل التخدير الكيتامين.
- ردود الفعل مرة واحدة والألم غائبة (اختبار عن طريق الضغط على أصابع القدمين مع ملاقط) توضع على طاولة الفئران التدفئة التحكم في درجة حرارته (RT ، Effenberg ، ميونيخ ، ألمانيا للحفاظ على حرارة الجسم عند 37.0 درجة مئوية) في وضع الاستلقاء الجانبي الايسر.
- إرفاق اطرافه السفلى والعليا الى طاولة باستخدام الشريط.
- لعدم بقاء العمليات الجراحية ، وهذه كما هو موضح في التظاهرة الفيديو ، وتغطي منطقة شق مع الزيوت المعدنية لمنع استنشاق الشعر الماوس عن طريق قطع الجلد وبالتالي منع من خطر الحساسية الشعر الماوس. في حالة بقاء التجارب المطلوبة بما في ذلك تقنيات التطهير المناسب لقطة من الشعر ، وتطهير الجلد مع iodophors (مثل Betadine) ، التعامل مع الأدوات المعقمة وتعقيمها باستخدام يخفي قفازات معقمة للجراح. لا تستخدم الزيوت المعدنية في جراحات البقاء. البقاء على قيد الحياة لجراحات يستخدم كلوريد الصوديوم العقيمة
- سيتم تنفيذ الحق شق الجناح مع مقص ، والقطب التخثر (Erbe ، ICC50 والمانيا) لمنع النزيف من العضلات والأوعية الجلد. على النقيض من الوصول إلى الكليتين عن طريق فتح البطن خط الوسط ، وهذا الأسلوب لا يتطلب الوصول إلى التجويف البريتوني.
- و تربط عنيق الكلوي بما في ذلك الشريان الكلوي والوريد الكلوي باستخدام خياطة 4 / 0 والحرير ، وسيتم خفض الكلى الحق في الخروج مع مقص دون التدخل في السفن الكظرية.
- إغلاق الجروح الجراحية باستخدام الخيط المستمر (اثنان من الغرز) من الجدار العضلي والجلد مع خياطة 4 / 0.
- ثم توضع الحيوانات في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن ، وسوف يتم تنفيذ شق الجهة اليسرى.
- تتم إزالة بعناية الكلية اليسرى من الأنسجة الضامة ، وتجنب الغدة الكظرية والسفن.
- المقبل ، يتم تشغيل الكلى مع الجانب البطني أسفل إلى فنجان وسيت. ويجب تعقيم الكأس وسيت لجراحات البقاء. يتم الضغط بعناية قطب الكلى في كأس وسيت من خلال عقد الأنسجة المحيطة مع ملقط. بعد ذلك يتم الضغط بعناية القطب في كأس وسيت مع ملقط. وسيتم الاحتفاظ الكلى الرطب والحار الرطب مع مسحة غارقة بالماء عند 37.0 درجة مئوية.
- بعد التعرض للالكلية اليسرى والتنسيب في فنجان وسيت المقيد صاحب الكلى ventrally أن التوتر في الأوعية الكلوية. والزجرية كافية هو أمر هام لنجاح التنسيب للخياطة تحت الشريان الكلوي. بعد ذلك يتم إصلاح حامل الكلى ويمكن أن يكون الشريان الكلوي التعرف عليها بسهولة لأنها تعمل على أعلى من الوريد الكلوي.
- يتم تشريح الشريان الكلوي من الأنسجة المجاورة ، على مقربة من اقلاعها في الفترة من الشريان الأورطي البطني مع ملقط الغرامة. يتم تشريح الشريان من الوريد الأساسية مع ملقط المنحني في أعلى جدا.
- يتم وضع الدرز 8 / 0 الحرير (Ethicon ، Norderstedt ، ألمانيا) تحت الشريان الكلوي باستخدامone ملقط كدليل الرائدة. هذا الأسلوب يسمح فقط من انقطاع تدفق الدم في الشرايين في الكلى دون ضغط من الوريد الكلوي ، بالمقارنة مع لقط من عنيق الكلوي.
- يوضع فوق القطب خياطة صغيرة (يمكن أن يكون صمام الأمان المعدة) ويبلغ وزنه تقريبا. ويرد في نهاية كل 1G (إيبندورف أنبوب). يمكن تكييفها لثقل حجم الكلى بأخراج أو إضافة الماء في الأنابيب إيبندورف. ومع ذلك ، ينبغي الشريان انسحب قليلا إلى أعلى ، بحيث لا يشغل عن طريق الدم في الشريان ولكن من دون امتداد رئيسي على الشرايين. ويمكن التأكيد الكبرى تمتد على الشريان يسبب الضرر جدار السفينة مع سماكة جدران الشرايين وضخه مخفضة.
- في حين أن أوزان غير معتمد ، هو المغطي على الفور الشريان الكلوي. في المقابل ، عندما يتم اعتماد الأوزان ، وعلى الفور يتم استعادة تدفق الدم إلى الجهاز. ويؤكد انسداد الناجحة التي قام بها تغيير اللون من الأحمر إلى الأبيض.
- لا يمكن أن يؤديها مرات الإسكيمية مختلفة كما هو مطلوب من قبل التجربة. وسوف تجرى ضخه كاملة اعتمادا على طول الوقت الإسكيمية. مرات نقص التروية تصل إلى 45 دقيقة تسمح للاسترداد إصابة الكلى. في إعدادات التجريبية لدينا استخدمنا 20 حتى 30 دقيقة من نقص التروية مع الضرر يشكل الكلوي المتوسط والذي يسمح لنا أن نرى تحسنا فضلا عن الإضرار تلف الكلى اعتمادا على سلالة الماوس والعلاج.
- يمكن ضخه بعد إتمام عملية استبدال الكلى للخروج من كأس وسيت. لذا فإن صاحب الكلى غير المثبتة ويتم تحريرها من حدة التوتر في الكلى. تتم إزالة بلطف القطب الجمجمة من الكأس مع ملقط لطيف والقطب الذيلية التالي على الفور.
- ويمكن إطلاق التثبيت (الأشرطة) من الفأرة ، ويمكن وضع الماوس في موقف ضعيف لإزالة FITC - الإينولين المسمى مثلا.
- في مجموعات فرعية من التجارب ، يمكن تسجيل ضغط الدم ومعدل ضربات القلب خلال عملية جراحية. ويتم الحصول على قياسات ضغط الدم بشكل مستمر عن طريق قسطرة الشريان السباتي. باختصار ، ما يتعرض له الشريان السباتي عن طريق تشريح حادة في عضلات رغامى. عقب التعرض لمزيد من الحذر وتجنب الصدمات الأنسجة (خاص للعصب المبهم) ، يتم إدخال القسطرة في الإناء باستخدام اثنين من الغرز وملقاط صغير. ويقاس ضغط الدم مع وجود عنصر ستاثام (WK 280 ، WKK ، Kaltbrunn ، سويسرا).
- لFITC المسمى الإينولين إزالة قسطرة لابد من وضعها في الوريد الوداجي الأيسر للتسريب من كلوريد الصوديوم والإينولين FITC المسمى. وعلاوة على ذلك قسطرة المثانة لابد من إدراجها لجمع البول بطريقة تعتمد على الوقت كما هو موضح أدناه في التفاصيل.
2. قياس إصابة الكلى
- بصفة عامة : ينصح المعلمات نتيجة التالية لتحديد إصابة الكلى نقص تروية الكلى التالية :
أداء FITC المسمى إزالة الإينولين لتقييم معدل الترشيح الكبيبي (GFR). كبديل تحديد وتصفية الكرياتينين الكرياتينين في الدم عن طريق التحقيق قفص الأيضية 24 ساعة بعد إصابة الكلى. أداء الكلى H & E وتلطيخ الميلوبيروكسيديز (MPO) ELISA لتحديد الأضرار والالتهابات الكلوية 24 ساعة التالية نقص تروية الكلى. - تحقيقات قفص الأيضية :
- التالية الإسكيمية تشغيل الكلى الظهير الايسر في موقف خلف الصفاق ويتم إغلاق الجرح على النحو المبين أعلاه.
- في نهاية عملية جراحية الفئران تتلقى 0.3 مل IP المالحة الطبيعي واستعادة لمدة 2 ساعة تحت مصباح التدفئة.
- وبعد ذلك يتم وضع الفئران في أقفاص التمثيل الغذائي (Tecniplast دويتشلاند ، Hohenpeissenberg ، ألمانيا) لتحديد معايير وظيفية كلوي 2 مرات عن 24 ساعة.
- كمية المياه في كل الفأر يحدده وزنها فارغة وزجاجة مملوءة بالماء قبل التوريد إلى الفأرة وأكثر من 24 ساعة في وقت لاحق عن طريق وزن زجاجة كاملة من جديد. وزن الماوس ويحدد كذلك.
- بعد 24 ساعة يتم أخذ الدم من حوالي 75μl الضفيرة الوريدية وراء العين عبر الأنابيب الشعرية تحت التخدير isoflorane قصيرة.
- ويتم تقييم وظائف الكلى عن طريق قياس الكرياتينين البلازما والبول بعد 24 ساعة من نقص تروية الكلى باستخدام أسلوب colorimtric المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الصانع سيصدره (LT - SYS ، + تكنيك العمل ، برلين ، ألمانيا). تركيزات البلازما والبول من نا + ، K + مصممون مع مضواء لهب الانبعاثات (اليكس 6361 ، إيبندورف AG ، هامبورغ ، ألمانيا). وتحسب مطرح الكلى والدورة الدموية القيم باستخدام الصيغ القياسية 15-17.
- سيتم تنفيذ التجارب إزالة FITC - الإينولين نقص تروية الكلى التالية : تصفية الإينولين.
- هو مقنى الوريد الوداجي الأيسر لأنني مستمرnfusion. بعد تشريح الأنسجة المجاورة من الوريد مع مقص التحضير (دومون ، WPI) مكان اثنين الغرز (4 / 0) في جميع أنحاء الوريد. وضع المشبك في الوريد قبل خياطة proximale لوقف تدفق الدم. بعد ذلك وثيقة العقدة البعيدة ووضع الوزن على واحد من الدرز القاصي ينتهي إلى سلالة التوتر في الوريد. هذا مهم جدا للحصول على القسطرة في الوريد. استخدام المقص الصغير لقطع فتحة صغيرة في الوريد. عقد فتح مع ملقط غرامة (دومون ، WPI) ووضع قسطرة في الوريد. للمضي قدما في القسطرة اتخاذ قبالة المشبك. تأكد من أنه لا يوجد أي توتر في القسطرة بحيث يمكنك وضعه أسفل دون عقده. وثيقة بعد ذلك خياطة second الداني عبر الوريد والقسطرة.
- يتم وضع قسطرة في المثانة البولية لجمع البول في الوقت المناسب. خفض بالتالي يجب شق قصير في الجلد فوق المثانة. إزالة بعناية المثانة من خلال ثقب الجلد. إصلاح المثانة بمنديل الرطب. مكان الدرز على استعداد أكثر من المثانة (4 / 0).
- قطع قطعة قصيرة من قسطرة (1.5cm) ، والحرارة على نهاية للحصول على حلقة حول القسطرة مما يجعل من السهل اصلاحها في المثانة.
- قطع ثقب في المثانة في أعلى جدا والخمسين. جعل خفض بين السفن لمنع النزيف. إدراج نهاية كبير من قسطرة في المثانة وإغلاق أكثر من خياطة القسطرة والمثانة.
- كل الفئران التي تحصل على البلعة من 0.85 ٪ في محلول كلوريد الصوديوم وهو مبلغ يعادل 20 ٪ من وزن الجسم. يتم الاحتفاظ التسريب المستمر بمعدل 800ul/h/25g وزن الجسم ويضاف FITC - الإينولين إلى التسريب لتقييم كامل الكلى معدل الترشيح الكبيبي (GFR). بعد استقرار هذه الحيوانات لمدة 20 دقيقة ، يتم تنفيذ 20 البول توقيت مجموعات دقيقة (أربع مرات) لتحديد معدل تدفق البول وFITC الإينولين. يتم الحصول على الدم في منتصف كل فترة لقياس FITC - الإينولين.
- عند البدء في جمع فترات لمدة 20 دقيقة باستخدام جهاز توقيت. جمع البول عن طريق وضع نهاية للقسطرة المثانة في أنبوب إيبندورف الصغيرة. قياس الوزن أنبوب قبل وبعد جمع البول بحيث يمكنك تحديد كمية البول. وتؤخذ عينات من الدم عن طريق الدم retroorbital شكل جمع الضفيرة الوريدية عبر الأنابيب الشعرية في منتصف كل فترة التحصيل.
- ويمكن جمع الدم والكلى وبعد كل إجراء مزيد من التحليل على سبيل المثال ELISA MPO ، خلوى EISA ، الأنسجة.
3. ممثل النتائج :
الشكل 1 نموذج لنظام شنقا الوزن لنقص تروية الكلى : تم وضع نظام الوزن شنقا للحث على نقص تروية الكلى في الكلى اليسرى. ولذلك كان ضعت خياطة النايلون 8،0 تحت الشريان الكلوي وعند نهاية كل خياطة وعلقت على وزن صغير (1G). يسمح هذا التصميم التجريبي عكسها انسداد الشريان الكلوي من خلال تطبيق والافراج عن حمولة الوزن.
Discussion
باختصار ، هذه الدراسة توضح تقنية جديدة لأداء نقص تروية الكلى في نموذج الفئران باستخدام نظام شنقا الوزن عن انسداد الشريان الكلوي. في الواقع ، فإن هذه الدراسة تثبت إصابة استنساخه للغاية ، وبالتالي تقليل التفاوت المقترنة لقط من عنيق الكلوي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ودعمت الدراسات الحالية المعاهد الوطنية للولايات المتحدة منحة الصحة R01 - HL092188 ، R01 - DK083385 وR01HL098294 ، ومؤسسة للتعليم والبحوث التخدير (FAER) منح لHKE ، منحة لFAER JYD و(دويتشه Forschungsgemeinschaft) البحوث DFG الزمالة (GR2121/1-1) لAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | World Precision Instruments, Inc. | a fine microvessel scissor |
References
- Abuelo, J. G. Normotensive ischemic acute renal failure. N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).
- Lameire, N. The pathophysiology of acute renal failure. Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).
- Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping. Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).
- Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation. Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).
- Schrier, R. W., Wang, W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).
- Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure. Transplantation. 80, 643-649 (2005).
- Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).
- Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors. Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).
- Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).
