Summary
Een precieze muis model voor acute nierschade (AKI) als gevolg van ischemie is een belangrijk instrument om acute nierschade te onderzoeken en eventueel vinden therapeutische instrumenten om schade aan de nieren te behandelen. De opknoping gewicht systeem biedt een tool voor onmiddellijke en betrouwbare renale arterie occlusie en reperfusie zonder dat renale congestie.
Abstract
Bij gehospitaliseerde patiënten, zijn meer dan 50% van de gevallen van acute nierschade (AKI), veroorzaakt door renale ischemie 1-3. Een recente studie van de gehospitaliseerde patiënten blijkt dat slechts een lichte verhoging van de serum creatinine niveaus (0,3 tot 0,4 mg / dl) is geassocieerd met een 70% groter risico op overlijden dan bij personen zonder een toename 1. Langs deze lijnen, chirurgische ingrepen waarbij cross-klemming van de aorta en renale vaten worden geassocieerd met een nierinsufficiëntie percentages tot 30% 4. Ook AKI na een hartoperatie komt voor bij meer dan 10% van de patiënten onder normale omstandigheden en wordt geassocieerd met een dramatische toename in sterfte. AKI komen ook vaak voor complicaties na levertransplantatie. Minstens 8-17% van de patiënten uiteindelijk die nierfunctievervangende therapie 5. Bovendien is een vertraagde transplantaatfunctie te wijten aan tubulus cel letsel tijdens een niertransplantatie hebben ondergaan vaak gerelateerd aan ischemie-geassocieerde AKI 6. Bovendien, AKI komt voor bij ongeveer 20% van de patiënten die lijden aan sepsis 6. Het optreden van de AKI wordt geassocieerd met dramatische toename van morbiditeit en mortaliteit 1. Therapeutische benaderingen zijn zeer beperkt en de meerderheid van interventionele proeven in AKI hebben gefaald bij de mens. Daarom zijn extra therapeutische modaliteiten om schade aan de nieren te voorkomen dat ischemie dringend nodig 3, 7-9.
Licht te werpen op de mechanismen van nierschade als gevolg van ischemie en mogelijke therapeutische strategieën murine modellen zijn intensief vereist 7-13. Muismodellen bieden de mogelijkheid om gebruik te maken van verschillende genetische modellen, waaronder gen-gerichte muizen en weefsel specifiek gen-gerichte muizen (cre-Flox systeem). Echter, muizen renale ischemie is technisch uitdagende en experimentele details grote invloed resultaten. We voerden een systematische evaluatie van een nieuw model voor geïsoleerde renale arterie occlusie in muizen, die specifiek vermijdt het gebruik van klemmen of hechten de renale pedikel 14. Dit model vereist een nefrectomie van de rechter nier, omdat ischemie kan alleen worden uitgevoerd in een nier als gevolg van de experimentele setting. In feite, met behulp van een opknoping gewicht systeem, de nierslagader is alleen geïnstrumenteerd een keer gedurende de chirurgische ingreep. Bovendien zijn er geen veneuze of obstructie van de urethra optreedt met deze techniek. We konden aantonen time-dosis-afhankelijk en zeer reproduceerbare schade aan de nieren met ischemie door het meten van serum creatinine. Bovendien, bij het vergelijken van dit nieuwe model met conventionele klemming van de hele pedikel, nier-bescherming door preconditionering ischemische is dieper en betrouwbaarder. Daarom zijn nieuwe techniek kan nuttig zijn voor andere onderzoekers die werkzaam zijn in het gebied van acute nierschade.
Protocol
Algemene opmerkingen. Alle operaties moeten worden uitgevoerd onder een rechtop dissectiemicroscoop (Leica) en met behulp van een chirurgische coagulator. De muizen in de experimentele groepen moeten worden afgestemd op leeftijd en het gewicht om de vergelijkbaarheid van de resultaten te garanderen. Temperatuur, bloeddruk, anesthesie en vochttoediening moet stabiel en gecontroleerd worden tijdens het experiment.
1. Anesthesie en chirurgie
- Renale ischemie experimenten kunnen worden uitgevoerd met gelijktijdig toepassen van ischemie en reperfusie aan beide nieren, of na een nefrectomie in combinatie met ischemie behandeling van de resterende nier. Als bilaterale ischemie behandeling van beide nieren is geassocieerd met een verhoogde technische problemen, een meer complexe experimentele setting en langer chirurgie, voeren wij een recht nefrectomie gevolgd door een ischemie behandeling van de resterende linker nier door gebruik te maken van een opknoping gewicht systeem. We gebruikte dit opknoping gewicht systeem ook voor de kransslagader occlusie in het hart. Echter, de procedure is anders omdat de nierslagader kan worden geïsoleerd van het omliggende weefsel terwijl de kransslagader ligt in de hartspier.
- Muizen (8-14 weken oud, zowel mannen als vrouwen) worden verdoofd met pentobarbital bij een dosis van 70mg/kg. Wij zullen zorgen voor verdoving met circa. 10 mg / kg / h natriumpentobarbital. Overdosering kan aanzienlijk lagere bloeddruk en kan dus veranderen de resultaten. In onze eerste onderzoeken we ook ketamine en xylazine. Echter, deze verbindingen leidden tot een sterke bradycardie (150 / min). Naast de waargenomen bradycardie zijn er ook aanwijzingen dat beide verbindingen worden betrokken bij de beschermende mechanismen tijdens voorwaarden van ischemie. Vluchtige anesthetica kan ook niet vanwege hun vermogen gebruikt worden om ook leiden tot nier-bescherming en lage bloeddruk. Daarom is onze uiteindelijke keuze voor de anesthesie was pentobarbital. Daarnaast worden ketamine en xylazine voornamelijk uitgescheiden door de nieren. Nefrectomie en ischemie kan verlengen ketamine anesthesie.
- Zodra de pijn reflexen zijn afwezig (getest door knijpen de tenen met een pincet) muizen zullen worden geplaatst op een temperatuur-gecontroleerde verwarming tafel (RT, Effenberg, München, Duitsland op lichaamstemperatuur te handhaven op 37,0 ° C) in een linker laterale decubitus positie.
- Bevestig de onderste en bovenste ledematen naar de tafel met behulp van tape.
- Voor niet-survival operaties, zoals aangegeven in de video-demonstratie, dekking van de incisie gebied met minerale olie om inademing van de muis haar te voorkomen door het snijden van de huid en verhinderen zo het risico van muis haar allergieën. In het geval van overleving experimenten de juiste aseptische technieken, waaronder het knippen van het haar, desinfectie van de huid met jodoforen (bijv. Betadine), steriele behandeling van geautoclaveerd instrumenten en het gebruik van maskers een steriele handschoenen voor de chirurg zijn verplicht. Minerale olie wordt niet gebruikt in overleving operaties. Om te overleven operaties steriele NaCl wordt gebruikt
- Rechterflank snede zal worden uitgevoerd met een schaar en een coagulatie-elektrode (Erbe, ICC50, Duitsland) om het bloeden van de spieren en de huid schepen te voorkomen. In tegenstelling tot toegang tot de nieren via de middellijn laparotomie, werkt deze techniek niet nodig de toegang tot de buikholte.
- De renale pedicle waaronder nierarteriestenose en renale ader wordt afgebonden met een 4 / 0 zijden hechtdraad en de rechter nier zal worden weggesneden met een schaar zonder zich te bemoeien met de bijnier schepen.
- De chirurgische wond is gesloten met een continue hechtdraad (twee steken) van de spierwand en de huid met een 4 / 0 hechtdraad.
- Dieren worden vervolgens geplaatst in een recht laterale decubitus positie en een linkerflank snede zal worden uitgevoerd.
- De linker nier is zorgvuldig verwijderd uit het bindweefsel, het vermijden van de bijnier en vaartuigen.
- Vervolgens wordt de nier gedraaid met de ventrale zijde naar beneden in een Lucite beker. De Lucite cup moet worden gesteriliseerd om te overleven operaties. De pool van de nier wordt zorgvuldig geduwd in de beker door Lucite houden het omliggende weefsel met een pincet. Daarna wordt de paal wordt zorgvuldig geduwd in de Lucite beker met een pincet. De nier zal worden gehouden nat en warm met een nat wattenstaafje doordrenkt met water bij 37,0 ° C.
- Na blootstelling van de linker nier en plaatsing in een Lucite cup houder van de nier is ventraal terughoudend om de spanning op de nier schepen. Een voldoende straatverbod is belangrijk voor een succesvolle plaatsing van de hechting onder de nierslagader. Daarna wordt de nier houder is vastgesteld en de nierslagader kan gemakkelijk worden geïdentificeerd als het draait op de top van de nier-ader.
- De nierslagader wordt doorsneden van aangrenzende weefsels, dicht bij de take-off van de abdominale aorta met fijne pincet. De slagader wordt doorsneden van de onderliggende ader met een gebogen pincet op de top.
- Een 8 / 0 zijden hechtdraad (Ethicon, Norderstedt, Duitsland) is onder de nierslagader door gebruik te makeneen pincet als een toonaangevende gids. Deze techniek maakt het mogelijk onderbreking van alleen de arteriële bloedtoevoer naar de nieren zonder compressie van de renale ader, in vergelijking met klemmen van de renale pedikel.
- De hechting is geplaatst over een klein paal (kan een veiligheidsspeld bereid zijn) en een gewicht van ca.. 1g is aan elk uiteinde (eppendorfbuisje). Het gewicht kan worden aangepast aan de nier grootte door het afsluiten of het toevoegen van water in de eppendorf buizen. Toch moet de slagader naar boven iets worden getrokken, zodat er geen bloed loopt door de slagader, maar zonder grote languit op de slagader. Grote stretch stress op de slagader kan leiden tot schade aan de vaatwand met verdikking van de vaatwand en een verminderde reperfusie.
- Terwijl de gewichten worden niet ondersteund, is de nierslagader onmiddellijk afgesloten. In tegenstelling, als de gewichten worden ondersteund, wordt de bloedstroom direct hersteld naar het orgel. Succesvolle occlusie wordt bevestigd door een verandering van kleur van rood naar wit.
- Verschillende ischemie tijden kan worden uitgevoerd, zoals vereist door het experiment. Een complete reperfusie zal plaatsvinden, afhankelijk van de lengte van de ischemie tijd. Ischemie tijden tot 45 minuten laten vergoeding in aanmerking komen nierschade. In onze experimentele opstellingen gebruiken we 20 tot 30 minuten van ischemie met een medium schade aan de nieren, die ons in staat stelt om te zien verbetering en vermindering van de schade aan de nieren, afhankelijk van de muis stam en de behandeling.
- Na volledige reperfusie van de nier kan worden vervangen uit de Lucite beker. Daarom is de nier houder is nog niet opgeloste en de spanning op de nieren wordt vrijgegeven. De craniale pool is voorzichtig verwijderd uit de beker met een zacht pincet en de caudale pool volgt onmiddellijk.
- De fixatie (tapes) van de muis kan worden vrijgegeven en de muis kan worden geplaatst in een liggende positie voor bijvoorbeeld FITC-gelabeld inuline klaring.
- In subsets van experimenten, kan de bloeddruk en de hartslag worden opgenomen gedurende de chirurgische ingreep. Bloeddrukmetingen worden voortdurend verkregen via een halsslagader katheter. In het kort, is de halsslagader blootstelling via stompe dissectie van de paratracheale spieren. Na verdere blootstelling en zorgvuldig vermijden van weefsel trauma (het bijzonder van de nervus vagus), wordt een katheter ingebracht in het vat met twee hechtingen en een kleine klem. De bloeddruk wordt gemeten met een Statham element (WK 280, WKK, Kaltbrunn, Zwitserland).
- Voor de FITC-gelabelde inuline klaring een katheter moet worden geplaatst in de linker halsader voor intraveneuze infusie van natriumchloride en FITC-gelabelde inuline. Verder is een blaas katheter moet worden ingebracht voor de urine op te vangen in een tijd afhankelijke manier zoals hieronder beschreven in detail.
2. Meting van nierschade
- In het algemeen: De volgende uitkomstmaten worden aanbevolen om de nieren schade vast te stellen volgende verminderde ischemie:
Voer FITC-gelabelde inuline afstand tot de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) te beoordelen. Als alternatief creatinineklaring en serum creatinine via metabole kooi onderzoek 24 uur na de schade aan de nieren vast te stellen. Voer nier H & E kleuring en een myeloperoxidase (MPO) ELISA tot nierschade en ontsteking 24 uur na renale ischemie te bepalen. - Metabole kooi onderzoeken:
- Na ischemie van de linker nier wordt weer omgezet in de retroperitoneale positie en de wond is gesloten zoals hierboven beschreven.
- Aan het einde van de operatie muizen ontvangen 0,3 ml fysiologische zoutoplossing IP en te herstellen gedurende 2 uur onder een warmtelamp.
- Daarna muizen zal worden geplaatst in metabole kooien (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, Duitsland) voor de bepaling van de nierfunctie functionele parameters voor de twee maal van 24 uur.
- Het water inname van elke muis moet worden bepaald door weging van de lege fles en gevuld met water voordat het aan de muis en dan 24 uur later door weging van de volle fles opnieuw. De muis gewicht moet ook worden bepaald.
- Na 24 uur ongeveer 75μl bloed zijn afkomstig uit de veneuze plexus achter het oog via een capillair onder de korte isoflorane verdoving.
- De nierfunctie wordt bepaald door het meten van plasma-en urine creatinine 24 uur na renale ischemie met behulp van een commercieel verkrijgbare colorimtric werkwijze volgens de fabrikant 's-protocol (LT-SYS, Labor + Technik, Berlijn, Duitsland). Plasma-en urine concentraties van Na +, K + worden bepaald met een vlam-emissie fotometer (ELEX 6361, Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland). Renale excretie en hemodynamische waarden worden berekend met behulp van standaard formules 15-17.
- Inuline klaring: FITC-inuline klaring experimenten zullen worden uitgevoerd volgens renale ischemie.
- De linker halsader is gecanuleerde voor continue infusion. Na het ontleden van de ader van de aangrenzende weefsel met een schaar de voorbereiding (Dumont, WPI) plaats twee hechtingen (4 / 0) rond de ader. Plaats een klem op de ader voor de proximale hechting om de bloedstroom te stoppen. Daarna sluit het distale knoop en leg een gewicht op een van de distale hechtdraad uiteinden om spanning spanning op de ader. Dit is zeer belangrijk om de katheter in de ader. Gebruik een micro-schaar op een kleine opening in de ader afgesneden. Houd de opening met een fijn pincet (Dumont, WPI) en plaats de katheter in de ader. Ter bevordering van de katheter neem de klem af. Zorg ervoor dat er geen spanning op de katheter, zodat u kunt plaatsen naar beneden, zonder vast te houden. Daarna sluit de tweede proximale hechting op de ader en de katheter.
- Een katheter wordt geplaatst in de urineblaas voor getimede urine collectie. Daarom knip je een korte incisie in de huid over de blaas. Verwijder voorzichtig de blaas door de huid gat. Bevestig de blaas met een natte doek. Plaats een voorbereide hechting over de blaas (4 / 0).
- Knip een kort stuk van een katheter (1,5 cm) en de warmte op einde aan een ring te krijgen rond de katheter, die het gemakkelijker maakt om het probleem te verhelpen in de blaas.
- Maak een gat in de blaas bij zijn zeer top. Maak de snede tussen de schepen om het bloeden te voorkomen. Steek het grote uiteinde van de katheter in de blaas en sluit de naad over de katheter en de blaas.
- Alle muizen krijgen een bolus van 0,85% natriumchloride-oplossing in een bedrag gelijk aan 20% van het lichaamsgewicht. Continue infusie wordt gehandhaafd op een snelheid van 800ul/h/25g lichaamsgewicht en FITC-inuline wordt toegevoegd aan het infuus voor de evaluatie van de hele nier glomerulaire filtratiesnelheid (GFR). Na stabilisatie van de dieren voor 20 min, 20 min zijn getimede urine collecties uitgevoerd (vier maal) voor de bepaling van de urinestroom en de FITC-inuline. Bloed is verkregen in het midden van elke periode voor meting van de FITC-inuline.
- Bij het starten van de collectie periodes gedurende 20 minuten gebruik maken van een timer. Verzamel de urine door het plaatsen van het einde van de blaas katheter in een kleine eppendorfbuisje. Meet de buis gewicht voor en na de urine op te vangen, zodat u kunt de urine bedrag te bepalen. Bloedmonsters af te nemen via retroorbital bloed collectie vormen de veneuze plexus via capillaire buizen in het midden van elke collectie periode.
- Bloed en de nieren kan worden verzameld na elke procedure voor verdere analyse bijvoorbeeld MPO ELISA, cytokine EISA, histologie.
3. Representatieve resultaten:
Figuur 1 Model van een opknoping gewicht voor renale ischemie:. Een opknoping gewicht systeem is opgezet om renale ischemie van de linker nier veroorzaken. Daarom is een 8,0 nylon hechtdraad werd geplaatst onder de nierslagader en aan het einde van elke hechting een klein gewicht (1g) was verbonden. Deze experimentele ontwerp kan omkeerbaar occlusie van de nierslagader door toepassing van en het vrijgeven van het gewicht lading.
Discussion
Kortom, de huidige studie beschrijft een nieuwe techniek voor het uitvoeren van renale ischemie in een muismodel met behulp van een opknoping gewicht voor renale arterie occlusie. In feite is deze studie toont zeer reproduceerbare letsel, dus het minimaliseren van de variabiliteit in verband met klemming van de renale pedikel.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De huidige studies werden ondersteund door de Verenigde Staten National Institutes of Health subsidie R01-HL092188, R01-DK083385 en R01HL098294, en de Stichting voor Anesthesie Onderwijs en Onderzoek (FAER) subsidies voor de HKE, een FAER verlenen aan JYD en een DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) onderzoek Fellowship (GR2121/1-1) tot AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | World Precision Instruments, Inc. | a fine microvessel scissor |
References
- Abuelo, J. G. Normotensive ischemic acute renal failure. N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).
- Lameire, N. The pathophysiology of acute renal failure. Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).
- Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping. Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).
- Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation. Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).
- Schrier, R. W., Wang, W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).
- Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure. Transplantation. 80, 643-649 (2005).
- Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).
- Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors. Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).
- Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).
