Summary
מודל Murine מדויק לפגיעה כליות חריפה (AKI) בשל איסכמיה הוא כלי חשוב לחקור פגיעה כליות חריפה ואולי אף למצוא כלים טיפולית לטיפול פגיעה כלייתית. מערכת המשקל תלוי מציעה כלי חסימה מיידית ואמינה reperfusion עורק הכליה מבלי לגרום גודש כליות.
Abstract
בחולים מאושפזים, מעל 50% מהמקרים של פגיעה כליות חריפה (AKI) נגרמות על ידי איסכמיה כלייתית 1-3. מחקר שנעשה לאחרונה גילה כי חולים מאושפזים רק עלייה קלה ברמות קריאטינין בדם (0.3-0.4 mg / dl) קשורה לסיכון של 70% גדול יותר של מוות מאשר אנשים ללא כל עלייה 1. ברוח דברים אלה, ניתוחים הדורשים צולבות מתהדקות של אבי העורקים וכלי כליות משויכים שיעורי אי ספיקת כליות של עד 30% 4. באופן דומה, AKI לאחר ניתוח לב מתרחשת מעל 10% מהחולים בנסיבות רגילות קשורה מגדילה דרמטית בתמותה. AKI גם הסיבוכים הנפוצים לאחר השתלת כבד. לפחות 8-17% מהחולים בסופו של דבר המחייב טיפול בתחליפי כליות 5. יתר על כן, תפקוד השתל מתעכב עקב פציעה תא אבובית במהלך השתלת כליה קשורה לעתים קרובות איסכמיה הקשורים AKI 6. יתר על כן, AKI מתרחשת בכ -20% מהחולים הסובלים אלח דם 6. הופעתם של AKI קשורה מגדילה דרמטית של תחלואה ותמותה 1. גישות טיפוליות מוגבלת מאוד ורוב הניסויים התערבותית ב AKI נכשלו בבני אדם. לכן, שיטות טיפוליות נוספות כדי למנוע פגיעה כלייתית מן איסכמיה יש צורך דחוף 3, 7-9.
כדי להבהיר את המנגנונים של פגיעה כלייתית עקב איסכמיה ואפשרי מודלים אסטרטגיות טיפוליות Murine נדרשים אינטנסיבי 7-13. מודלים עכבר לספק את האפשרות של ניצול מודלים גנטיים שונים, כולל הגן במיקוד עכברים ספציפיים רקמות גן במיקוד עכברים (cre-flox המערכת). עם זאת, איסכמיה כלייתית Murine הוא מאתגר מבחינה טכנית ופרטים ניסיוני להשפיע באופן משמעותי על התוצאות. ביצענו הערכה שיטתית של מודל הרומן חסימת עורק בודד כליות בעכברים, אשר נמנע במפורש את השימוש של clamping או תפירת 14 pedicle כליות. מודל זה דורש nephrectomy של הכליה הימנית מאז איסכמיה יכול להתבצע רק כליה אחת עקב הגדרת הניסוי. למעשה, באמצעות המערכת תלוי במשקל, העורק הכלייתי instrumented רק פעם אחת לאורך כל ההליך הכירורגי. בנוסף, אין חסימה ורידית או השופכה מתרחשת עם טכניקה זו. אנחנו יכולים להפגין זמן מינון תלויי לשעתקו מאוד פגיעה כלייתית עם איסכמיה ידי מדידת קריאטינין בסרום. יתר על כן, כאשר משווים את הדגם החדש עם קונבנציונאלי clamping של ההגנה כולה, pedicle כליות ידי נפשית מראש איסכמי הוא עמוק יותר ואמין יותר. לכן הטכניקה החדשה שלו עשוי להיות שימושי עבור חוקרים אחרים שעובדים בתחום של פגיעה כליות חריפה.
Protocol
הערות כלליות. כל פעולות יש לבצע תחת מיקרוסקופ לנתח זקוף (לייקה) ועל ידי שימוש coagulator כירורגית. העכברים בקבוצת הניסוי צריך להיות מתאימים בגיל ומשקל כדי להבטיח את ההשוואה של התוצאות. הממשל, טמפרטורה לחץ דם, נוזל ההרדמה צריכה להיות יציבה מעקב במהלך הניסוי.
1. הרדמה וניתוח
- ניסויים איסכמיה כליות יכול להתבצע בו זמנית עם החלת איסכמיה ו reperfusion הן הכליות, או אחרי nephrectomy יחיד בשילוב עם טיפול איסכמיה של הכליה הנותרת. כטיפול איסכמיה הבילטרליים של הכליות הן קשורה קשיים טכניים מוגברת, הגדרה ניסיונית מורכב יותר ניתוח ארוך יותר, נבצע nephrectomy זכות ואחריו טיפול איסכמיה של הכליה השמאלית הנותרים, תוך ניצול מערכת משקל תלוי. ניצלנו את המערכת המשקל תלוי גם חסימה של העורקים הכליליים בלב. עם זאת, ההליך הוא שונה מאז עורק הכליה יכול להיות מבודד הרקמה הסובבת ואילו לב כלילית נמצא בתוך שריר הלב.
- עכברים (8-14 שבועות של גיל, או מין) יהיה בהרדמה עם pentobarbital במינון של 70mg/kg. אנו נשמור על הרדמה עם כ. 10 מ"ג / ק"ג / שעה pentobarbital נתרן. מינון יתר יכול להפחית באופן משמעותי את לחץ הדם ולכן ניתן לשנות את התוצאות. במחקרים הראשונית שלנו אנחנו גם בשימוש קטמין ו xylazine. עם זאת, תרכובות אלה המושרה ברדיקרדיה חזק (150 / min). לצד ברדיקרדיה שנצפה יש גם ראיות כי הן תרכובות מעורבים מנגנוני הגנה במהלך תנאים של איסכמיה. הרדמה נדיפים אינו יכול לשמש גם בשל יכולתם לגרום גם הגנה כליה ולחץ דם נמוך. לכן הבחירה הסופית שלנו היתה pentobarbital הרדמה. בנוסף, קטמין ו xylazine מופרשים בעיקר על ידי הכליות. Nephrectomy ו איסכמיה רשאית להאריך ההרדמה קטאמין.
- לאחר רפלקסים כאב נעדרים (נבדק על ידי כיווץ האצבעות עם פינצטה) עכברים יוצב על השולחן בקרת טמפרטורה חימום (RT, Effenberg, מינכן, גרמניה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37.0 ° C) במצב משכוב השאיר לרוחב.
- צרף את הגפיים התחתונות העליונות לשולחן באמצעות קלטת.
- עבור אי - קיום ניתוחים, כגון הראו בהפגנה וידאו, לכסות את אזור החתך עם שמן מינרלי כדי למנוע שאיפה של שיער העכבר על ידי חיתוך של העור ובכך למנוע את הסיכון לאלרגיות שיער העכבר. במקרה של ניסויים הישרדות טכניקות aseptic תקין כולל גזירת השיער, חיטוי העור עם iodophors (בבטאדין למשל), טיפול סטרילי של מכשירים autoclaved ושימוש במסכות כפפות סטריליות עבור המנתח נדרשים. שמן מינרלי אינו משמש ניתוחים הישרדות. עבור ניתוחים הישרדות NaCl סטרילי משמש
- חתך באגף ימין יבוצעו עם מספריים לבין אלקטרודה קרישה (Erbe, ICC50, גרמניה) כדי למנוע דימום של שרירים וכלי העור. בניגוד לגישה הכליות דרך קו האמצע laparotomy, טכניקה זו אינה דורשת גישה חלל הצפק.
- Pedicle כליות כולל עורק הכליה וריד הכליה הם ligated באמצעות תפר 4 / 0 משי את הכליה הימנית יהיה לגזור עם מספריים ללא הפרעה כלי הכליה.
- פצע הניתוח נסגר באמצעות תפרים רציפה (שני תפרים) של הקיר שריר ועור עם תפר 4 / 0.
- בעלי חיים ממוקמות אז במצב משכוב זכות לרוחב חתך את האגף השמאלי יבוצעו.
- כליה שמאל מוסר בקפידה מתוך רקמות החיבור, הימנעות את בלוטת יותרת הכליה וכלי.
- בשלב הבא, הכליה מופעלת בצד הגחון שלו לתוך כוס פייברגלס. כוס פייברגלס צריך להיות מעוקר עבור ניתוחים הישרדות. מוט של הכליה הוא דחף בקפידה על ידי מחזיק את הרקמה שמסביב עם מלקחיים לתוך כוס פייברגלס. לאחר מכן הקוטב הוא דחף בזהירות עם מלקחיים לתוך כוס פייברגלס. כליות יישמר רטוב וחם עם ספוגית לחה ספוגה מים 37.0 ° C.
- בעקבות החשיפה של הכליה מיקום שמאל לתוך כוס פייברגלס בעל כליה מאופק ventrally יש מתח על כלי כליות. הרחקה מספיק חשוב עבור מיקום מוצלח של תפר מתחת העורק הכלייתי. לאחר מכן בעל כליות קבועה העורק הכלייתי ניתן לזהות בקלות כפי שהוא פועל על גבי עורק הכליה.
- עורק הכליה הוא גזור מן הרקמות הסמוכות, קרוב שלה, להמריא מעל אבי העורקים בבטן עם מלקחיים בסדר. עורק הוא גזור מן הווריד הבסיסית עם מלקחיים מעוקל בחלקו העליון.
- תפר 8 / 0 משי (Ethicon, Norderstedt, גרמניה) היא תחת בעורק הכליה על ידי שימושone מלקחיים כמדריך המוביל. טכניקה זו מאפשרת הפסקה של זרימת הדם בעורקים רק לכליה ללא דחיסה של עורק הכליה, לעומת clamping של pedicle כליות.
- תפר ממוקם על מוט קטן (יכול להיות סיכת ביטחון מוכן) ומשקל של כ. 1g מצורף בסוף כל אחד (צינור Eppendorf). משקל ניתן להתאים לגודל כליה על ידי הוצאת או הוספת מים לתוך צינורות Eppendorf. עם זאת, צריך להיות העורק משך מעט כלפי מעלה, כך דם לא פועל דרך העורק אך ללא מתיחה גדולה על העורק. הלחץ למתוח רס"ן על העורק יכולה לגרום נזק לכלי קיר עם עיבוי של דפנות העורקים ואת reperfusion מופחת.
- בעוד המשקולות אינן נתמכות, העורק הכלייתי הוא occluded מיד. לעומת זאת, כאשר המשקולות נתמכים, זרימת הדם ישוחזר מיד האיבר. חסימה מוצלח הוא אושר על ידי שינוי צבע אדום לבן.
- פעמים איסכמיה שונים ניתן לבצע כנדרש בניסוי. Reperfusion להשלים יתקיים בהתאם לאורך הזמן איסכמיה. פעמים איסכמיה עד 45 דקות לאפשר פגיעה בכליות ההשבה. בהגדרות הניסוי שלנו השתמשנו 20 עד 30 דקות של איסכמיה עם פגיעה כלייתית בינונית, אשר מאפשרת לנו לראות שיפור, כמו גם ירידת ערך של נזק כלייתי בהתאם לזן העכבר הטיפול.
- לאחר reperfusion להשלים הכליה יכול להיות מוחלף מתוך כוס פייברגלס. לכן בעל כליה מבולבל והמתח על הכליה הוא שוחרר. מוט גולגולת מוסר בעדינות מתוך הכוס עם מלקחיים תפל ואת מוט הזנב כדלקמן מיד.
- קיבעון (קלטות) של העכבר ניתן לשחרר את העכבר ניתן להציב בעמדה פרקדן לאישור FITC-אינולין למשל תווית.
- ב תת של ניסויים, לחץ הדם וקצב הלב ניתן להקליט במשך ההליך הכירורגי. מדידות לחץ דם מתקבלים באופן רציף באמצעות קטטר העורק הראשי. בקיצור, עורק הצוואר חשוף דרך לנתיחה בוטה של שרירי paratracheal. בעקבות חשיפת נוסף והימנעות קפדנית של טראומה רקמות (במיוחד של העצב מחנק), קטטר מוכנס לתוך הכלי באמצעות שני התפרים ואת מהדק קטן. לחץ דם נמדד עם אלמנט Statham (WK 280, WKK, Kaltbrunn, שוויץ).
- לקבלת אישור FITC שכותרתו אינולין קטטר יש להציב לווריד הצוואר נותר עירוי של נתרן כלורי ו אינולין FITC שכותרתו. יתר על כן קטטר לשלפוחית השתן צריך להיות מוכנס לאיסוף שתן באופן פעם תלוי כמוסבר להלן בפירוט.
2. מדידה של פגיעה בכליות
- באופן כללי: פרמטרים התוצאה הבאה מומלץ לקבוע פגיעה בכליות לאחר איסכמיה כלייתית:
בצע FITC שכותרתו פינוי אינולין להעריך את קצב הסינון גלומרולרי (GFR). כחלופה לקבוע פינוי קריאטינין ו קריאטינין בסרום באמצעות חקירה כלוב מטבולי 24 שעות לאחר פגיעה כלייתית. בצע כליות H & E מכתים ו myeloperoxidase (MPO) ELISA לקביעת הנזק הכלייתי ודלקת 24 שעות לאחר איסכמיה כלייתית. - כלוב חקירות מטבולית:
- בעקבות איסכמיה הכליה השמאלי הוא פנה חזרה למצב retroperitoneal ואת הפצע סגור כפי שתואר לעיל.
- בתום הניתוח עכברים לקבל 0.3 מ"ל IP מלוחים נורמלי להתאושש למשך 2 שעות תחת מנורת חימום.
- לאחר מכן עכברים יוצב לתוך כלובים מטבוליים (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, גרמניה) לקביעת פרמטרים תפקודי כליות עבור 2 פעמים של 24 שעות.
- צריכת המים של כל עכבר צריך להיקבע על ידי שקילת בקבוק ריק מלא במים לפני האספקה העכבר מ -24 שעות מאוחר יותר על ידי שקילת בקבוק מלא שוב. משקל העכבר צריך להיות נחוש גם כן.
- אחרי 24 שעות דם 75μl כ לקוחים מקלעת ורידית מאחורי העין באמצעות צינור נימי בהרדמה isoflorane קצר.
- התפקוד הכלייתי מוערך על ידי מדידת פלזמה ו קריאטינין בשתן 24 שעות לאחר איסכמיה כלייתית בשיטה colorimtric זמינים מסחרית לפי יצרן ג `פרוטוקול (LT-SYS, העבודה + Technik, ברלין, גרמניה). פלזמה ו ריכוזים שתן של Na +, K + נקבעים עם פוטומטר להבה פליטה (ELEX 6361, Eppendorf AG, המבורג, גרמניה). הפרשה כליות וערכים hemodynamic מחושבים באמצעות נוסחאות תקן 15-17.
- פינוי אינולין: FITC-אינולין ניסויים אישור יבוצע לאחר איסכמיה כלייתית.
- וריד הצוואר השמאלי cannulated עבור i רציףnfusion. לאחר לנתח את הווריד מרקמות סמוכות עם מספריים הכנה (דומון, WPI) למקם שני תפרים (4 / 0) סביב הווריד. מניחים מהדק על הווריד לפני תפר proximale לעצור את זרימת הדם. לאחר מכן לסגור את הקשר דיסטלי ומקום משקל על אחד תפר הדיסטלית מסתיים למתח המתח על הווריד. זה מאוד חשוב כדי לקבל את צנתר בווריד. השתמש מיקרו מספריים כדי לחתוך פתח קטן לתוך הווריד. החזק את הפתיחה עם מלקחיים קנס (דומון, WPI) והמקום צנתר לווריד. כדי לקדם את הקטטר לקחת את מהדק את. ודא כי אין מתח על הקטטר כך שניתן למקם אותו מבלי להחזיק אותו. לאחר מכן לסגור את תפר הפרוקסימלי השני מעל הוריד את הקטטר.
- קטטר הוא הניח בשלפוחית השתן איסוף שתן מתוזמן. לכן אתה חותך חתך קצר בעור על שלפוחית השתן. הסר בזהירות את שלפוחית השתן דרך חור בעור. תקן את שלפוחית השתן עם רקמות רטוב. מניחים תפר מוכן על שלפוחית השתן (4 / 0).
- גזור קטע קצר של קטטר (1.5cm) וחום בצד כדי לקבל טבעת סביב הקטטר אשר מקל כדי לתקן את זה בשלפוחית.
- חותכים חור לתוך שלפוחית השתן בחלק העליון שלה מאוד. הפוך את חתך בין הכלים כדי למנוע דימום. הכנס את הקצה הגדול של קטטר לתוך שלפוחית השתן לסגור את תפר את הקטטר ואת שלפוחית השתן.
- כל העכברים לקבל בולוס הפתרון 0.85% נתרן כלורי בסכום השווה ל -20% ממשקל הגוף. עירוי רציף נשמר בקצב של 800ul/h/25g משקל הגוף FITC-אינולין הוא הוסיף העירוי להערכת גלומרולרי שלם קצב הסינון בכליה (GFR). לאחר ייצוב של חיות עבור 20 דקות, 20 דקות בעיתוי אוספים שתן מבוצעות (ארבע פעמים) לקביעת קצב זרימת השתן FITC-אינולין. הדם מתקבל באמצע תקופה כל למדידת FITC-אינולין.
- כאשר החל בתקופות אוסף במשך 20 דקות להשתמש טיימר. איסוף שתן על ידי הנחת סוף קטטר לשלפוחית השתן לתוך צינור Eppendorf קטן. מדדו את משקל הצינור לפני ואחרי איסוף שתן, כך שתוכל לקבוע את כמות השתן. דגימות דם נלקחות באמצעות טופס איסוף דם retroorbital מקלעת ורידית באמצעות צינורות נימי באמצע כל תקופת האיסוף.
- דם את הכליה ניתן לאסוף לאחר כל הליך להמשך למשל ניתוח MPO ELISA, ציטוקינים EISA, היסטולוגיה.
3. נציג תוצאות:
איור 1 דגם של המערכת תלוי במשקל עבור איסכמיה כלייתית:. מערכת משקל תלוי הוקם כדי לגרום איסכמיה כלייתית של הכליה השמאלית. לכן תפר 8.0 ניילון הושם תחת בעורק הכליה בסוף תפר כל משקל קטן (1G) צורף. זה עיצוב ניסיוני מאפשר חסימה הפיכה של העורק הכלייתי על ידי יישום ושחרור עומס משקל.
Discussion
לסיכום, המחקר הנוכחי מתאר שיטה חדשנית לביצוע איסכמיה כלייתית במודל Murine באמצעות מערכת תלוי במשקל של חסימת עורק הכליה. למעשה, מחקר זה מדגים פגיעה לשחזור ביותר, ובכך לצמצם את השונות הקשורות clamping של pedicle כליות.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחקרים מציגים נתמכו על ידי ארצות הברית National Institutes of Health מענק R01-HL092188, R01-DK083385 ו R01HL098294, ואת הקרן לחינוך ומחקר הרדמה (FAER) מענקים HKE, מענק FAER כדי JYD ו (דויטשה Forschungsgemeinschaft) למחקר DFG המלגה (GR2121/1-1) כדי AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4mg/mL in saline |
| Suture, silk 4.0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon Inc. | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | World Precision Instruments, Inc. | a fine microvessel scissor |
References
- Abuelo, J. G. Normotensive ischemic acute renal failure. N Engl J Med. 357, 797-805 (2007).
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. N Engl J Med. 334, 448-460 (1996).
- Lameire, N. The pathophysiology of acute renal failure. Crit Care Clin. 21, 197-210 (2005).
- Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping and unclamping. Anesthesiology. 82, 1026-1060 (1995).
- Yalavarthy, R., Edelstein, C. L., Teitelbaum, I. Acute renal failure and chronic kidney disease following liver transplantation. Hemodial Int. 11, Suppl 3. S7-S12 (2007).
- Schrier, R. W., Wang, W. Acute renal failure and sepsis. N Engl J Med. 351, 159-169 (2004).
- Grenz, A., Osswald, H., Eckle, T. The Reno-Vascular A2B Adenosine Receptor Protects the Kidney from Ischemia. PLoS Medicine. 5, e137-e137 (2008).
- Grenz, A., Zhang, H., Hermes, M. Contribution of E-NTPDase1 (CD39) to renal protection from ischemia-reperfusion injury. FASEB J. 21, 2863-2873 (2007).
- Grenz, A., Zhang, H., Eckle, T. Protective role of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in renal ischemia. J Am Soc Nephrol. 18, 833-845 (2007).
- Akcay, A., Nguyen, Q., Edelstein, C. L. Mediators of inflammation in acute kidney injury. Mediators Inflamm. , 137072-137072 (2009).
- Faubel, S., Ljubanovic, D., Poole, B. Peripheral CD4 T-cell depletion is not sufficient to prevent ischemic acute renal failure. Transplantation. 80, 643-649 (2005).
- Wei, Q., Bhatt, K., He, H. Z., Mi, Q. S., Haase, V. H., Dong, Z. Targeted deletion of Dicer from proximal tubules protects against renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 21, 756-761 (2010).
- Joo, J. D., Kim, M., Horst, P. Acute and delayed renal protection against renal ischemia and reperfusion injury with A1 adenosine receptors. Am J Physiol Renal Physiol. 293, F1847-F1857 (2007).
- Grenz, A., Eckle, T., Zhang, H. Use of a hanging-weight system for isolated renal artery occlusion during ischemic preconditioning in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F475-F485 (2007).
- Qi, Z., Whitt, I., Mehta, A. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am J Physiol Renal Physiol. 286, 590-596 (2004).
- Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am J Physiol. 276, 172-177 (1999).
- Lorenz, J. N. A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282, 1565-1582 (2002).
