Summary
Wir gründeten eine neue Mausmodell der eine hängende Gewicht für Portal-Triade Okklusion. Diese Technik kann hilfreich sein für zukünftige Untersuchungen der Ischämie in Maus-Leber-Modelle.
Abstract
Akute Leberschädigung aufgrund einer Ischämie kann während mehrerer klinischer Verfahren z. B. Leber-Transplantation, Leber-Resektion des Tumors oder Trauma Reparatur auftreten können und in Leberversagen, die eine hohe Sterblichkeitsrate 2.1 hat zur Folge haben. Deshalb murinen Studien der hepatischer Ischämie sind zu einem wichtigen Bereich der Forschung durch die Bereitstellung der Gelegenheit zu nutzen, pharmakologischen und genetischen Studien 3-9. Ausdrücklich stellen bedingte Mäuse mit gewebespezifischen Deletion eines Gens (CRE, flox System) Einblicke in die Rolle von Proteinen in bestimmten Geweben 13.10. Wegen der technischen Schwierigkeiten mit manuell Einspannen des Portals Dreiklang in Mäusen verbunden sind, führten wir eine systematische Auswertung mit einem hängenden Gewichts-System für Portal-Triade Okklusion, der zuvor 3 beschrieben. Durch die Verwendung eines Hanging-System Gewicht legen wir einen Faden um den linken Ast des Portals Dreiklang ohne dass es zu Schäden an den Leberlappen, da auch derfeinsten Klemmen zur Verfügung kann Lebergewebe Schaden wegen der engen Lage des Lebergewebes zu den Gefäßen verursachen. Ferner ist die rechte Zweig der hepatischen Triade noch folglich keine Überlastung auftritt Darm mit dieser Technik, da der Blutfluss zu den richtigen Leberlappen erhalten bleibt perfundiert. Ferner ist das Portal Triade nur einmal im gesamten chirurgischen Eingriffs manipuliert. Als ein Ergebnis, wie Verfahren Vorkonditionierung, mit kurzen Zeit von Ischämie und Reperfusion, kann leicht durchgeführt werden. Systematische Evaluation dieses Modells, indem Sie verschiedene Ischämie und Reperfusion Zeiten ergab eine enge Korrelation von hepatischer Ischämie Zeit mit Leberschäden wie durch Alanin (ALT) und Aspartat-(AST)-Aminotransferase-Serumspiegel 3,9 gemessen. Zusammengenommen bestätigen diese Studien in hohem Maße reproduzierbar Leberschädigung bei der Verwendung der hängenden Gewicht für hepatischer Ischämie und Reperfusion intermittierende. Somit könnte diese Technik nützlich sein für andere Forscher Interesseed in Leberischämie Studien an Mäusen. Deshalb ist die Video-Clip bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung dieser Technik.
Protocol
Allgemeine Bemerkungen. Alle Arbeiten sind unter einer aufrechten Binokular (Leica) und mit Hilfe eines chirurgischen Koagulator durchgeführt werden. Die Mäuse in den experimentellen und Schein-Gruppen sollten im Alter und Gewicht angepasst werden, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Temperatur, Blutdruck, Anästhesie und Flüssigkeitszufuhr sollte stabil sein und überwacht während des gesamten Experiments.
1. Anästhesie und Chirurgie
- C57BL / 6 Mäusen sollte innerhalb einer Altersspanne von 10 bis 16 Wochen betragen und sie sollten geschlechtsspezifische abgestimmt in den jeweiligen Gruppen sein.
- Anesthetize Mäuse mit Natrium-Pentobarbital (70 mg / kg Körpergewicht ip) und Aufrechterhaltung einer Narkose mit ca. 10 mg / kg / h Natriumpentobarbital. Eine Überdosierung kann deutlich den Blutdruck senken und somit können die Ergebnisse verändern.
- Ort Mäusen auf eine Temperatur gesteuerte beheizte Tisch (RT, Effenberg, München, Deutschland) mit einer rektalen Sonde zu einem Thermometer thermischer Rückführung befestigtSteuerung der Körpertemperatur bei 37 ° C zu halten
- Platz Mäuse in Rückenlage auf dem OP-Tisch, mit den oberen und unteren Enden an dem Tisch mit entfernbaren Klebeband.
- Im Falle des Überlebens Experimente richtige aseptische Techniken einschließlich Clipping von Haaren, Desinfektion der Haut mit Iodophoren (zB Betadine), sterile Handhabung der Instrumente autoklaviert und mit Masken eine sterile Handschuhe für den Chirurgen erforderlich.
2. Portal Triad Occlusion
- Bedecken Sie den Einschnitt mit Mineralöl um das Einatmen von Maus Haare durch Schneiden der Haut und verhindert so das Risiko von Allergien Maus Haare zu verhindern. Führen Mittellinie Laparotomie und Inzision der Linea alba bis zum oberen Ende, so dass Sie leicht entlarven die Leber. Wenn möglich, führen Sie den Schnitt mit einer Koagulationselektrode (Erbe, ICC50, Tübingen, Deutschland), um eine Blutung zu verhindern.
- Legen Sie die Heiz-Tabelle mit der Maus in der Lage, dass der Schwanz Richtung istTed für den Chirurgen. Diese Position bietet Ihnen die beste Einstellung zu lokalisieren und den Dreiklang, um die Naht zu platzieren.
- Anschließend verdrängt man das Darm auf der rechten Seite mit einem feuchten Wattestäbchen Wattestäbchen, das Portal Dreiklang aussetzen.
- Geringfügig verschieben den Median und linken Lappen in Richtung der Membran und der rechte Lappen in Richtung Darm. Das gibt Ihnen einen klaren Blick auf das Portal Dreiklang oberhalb der Bifurkation der rechten, mittleren / linken Lappen.
- Überprüfen Sie sorgfältig das Portal Dreiklang und halten Sie die rechte Lappen sanft mit einer Pinzette fad. Das gibt Ihnen eine schöne Aussicht auf dem linken Portal Dreiklang.
- Einmal visuell festgestellten Ort die Nadel mit dem Faden (7/0 Nylonnaht; Ethicon, Norderstedt, Deutschland) über einen Nadelhalter unter dem linken Portal Dreiklang, einschließlich der Leberarterie, Lebervene, und Gallengang von der linken auf die rechte Seite der Maus.
- Der Stich muss eng sein, unter dem Dreiklang. Ein tiefer Stich kann zu Verletzungen der Vena Vaca unterlegen, die unter befindetder Dreiklang. Deshalb halten Sie die rechte Leberlappen nach unten mit der Zange, um die Vena Cava, bevor Sie den Stich zu identifizieren.
- Nehmen Sie die Spitze der Nadel auf der rechten Seite mit einer Pinzette heraus und ziehen Sie sie vorsichtig aus der Leber Bereich ohne Verletzung der Leber.
- An jedes Ende des Fadens ein Eppendorf-Röhrchen (etwa 3 g, mit Wasser gefüllt) und stellen sowohl Fadenenden über Nahtmaterial Halter. Platzieren Sie die Fadenhalter distal von der Masche, so dass die Naht nicht mit der rechten Triade stören.
- Durch die Anwendung der Gewichtungen der Triade wird sofort verschlossen, wodurch Unterbrechung der Blutversorgung des linken und mittleren Lappen der Leber. Erfolgreiche Okklusion kann leicht durch visuelle Inspektion der blasse Blanchieren der ischämischen Lappen bestätigt werden. Im Gegensatz dazu die Änderung der Farbe sofort verschwindet, wenn die Gewichte hängen von den Polen freigesetzt werden und die Leber reperfundiert. Diese partielle hepatische Ischämie-Modell vermeidet Staus mesenterialen durch die Erhaltung Blood Strömung zu den rechten Leberlappen.
- Ersetzen Sie den Darm in die Bauchhöhle. Halten Sie die Leber und Darm warm mit einem feuchten Wattestäbchen mit Wasser bei 37,0 ° C eingetaucht Neben der Körpertemperatur stabil zu halten decken die Mäuse, die mit handelsüblichen Frischhaltefolie nach Beendigung der Operation.
- Führen Ischämie nach experimentellen Protokoll erforderlich. Nach einer definierten Zeit Release Ischämie und Reperfusion die Gewichte der mittleren und linken Leberlappen wird sofort gestartet. Diese Technik erlaubt die Herstellung reversible Ischämie bei Mäusen. Wenn keine weiteren Ischämie Zeiten durchgeführt werden, entfernen Sie vorsichtig die Naht.
- In etwa 400 ul Natriumchlorid in die Bauchhöhle 15 Minuten vor und unmittelbar nach der Reperfusion. Weiter zur Flüssigkeit ersetzen alle 30 Minuten in einer Menge von 100 ul zu Flüssigkeitsverlust während der Reperfusion zu kompensieren.
- Für das Überleben Experimente die OP-Wunde wird geschlossen mit fortlaufenden Naht des Muskels Wand und die Haut with einer 4/0 Nahtmaterial.
3. Änderungen in Leberperfusion
Die folgenden Outcome-Parameter werden empfohlen, um Leberschäden nach hepatischer Ischämie zu bestimmen:
Bestimmen Sie Leberenzyme (zB ALT, AST) und Leberhistologie (H & E Färbung) folgende Leber Ischämie und Reperfusion 3,9.
Abbildung 1 Modell eines Hanging-Gewicht-System für Leberischämie:. Eine hängende Gewicht System wurde eingerichtet, um Leber-Ischämie des linken und Mittellappen 3 zu induzieren. (A) Deshalb ist die caudatus und rechten Lappen wurden vorsichtig aus dem linken Lappen getrennt. Der rechte Lappen war dann leicht verschoben, klar zu sehen das Portal Dreiklang oberhalb der Bifurkation der rechten, mittleren und linken Lappen. Der 8,0 Nylonnaht wurde unter dem linken Leber-Dreiklang platziert. (B) am Ende jedes Fadens ein kleines Gewicht (3 g Eppendorf tuBES mit Wasser gefüllt) befestigt war und angewendet werden. Hepatischer Ischämie sichtbar durch eine Farbänderung des linken und Mittellappen von rot zu verblassen. Das experimentelle Design erlaubt eine präzise Okklusion und Reperfusion des linken Leber-Dreiklang durch Anlegen und Lösen der Gewichtsbelastung.
2. Auswirkungen unterschiedlicher Leberischämie Mal auf Alanin (ALT) und Aspartat-(AST) Aminotransferase in Mäusen. Teilweise Portal Dreiklang Ischämie wurde wie angegeben (- 60 min Ischämie 0) induziert. Nach 2 Stunden Reperfusion wurden ALT (A) und AST (B) gemessen. 7 Mäuse / Gruppe - Ergebnisse sind als Mittelwert ± SE von 6 ausgedrückt. * P <0,05 im Vergleich zu 0 min Ischämie (Schein-Kontrolle).
Discussion
Die vorliegende Studie beschreibt eine Technik, bei der Ischämie in einem Mausmodell mit Hilfe eines hängenden Gewicht für Okklusion der linken Leberpforte Dreiklang. Obwohl es eine einfache Methode, lernen die folgenden Gefahren sollten berücksichtigt werden. Ein sehr häufiger Fehler am Anfang ist ein tiefer Stich, die das Portal Dreiklang und die Vena Cava umfasst. Die Atem-und Herzfrequenz verlangsamt sich innerhalb von 15 Minuten durch den erhöhten Widerstand und die Abnahme der Rückkehr Blutes zum Herzen, was zu einem frühen Tod der Mäuse. Der beste Weg, die einschließlich der Vena Cava zu verhindern, ist die Lokalisierung des Hohlvene vor dem Stich durch Halten der rechten Lappen nach unten mit einer Pinzette. Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Gewichte nicht zu schwer sind, die in zu viel Stress auf der linken und rechten Portal-Studie, die ebenfalls stoppt den Blutfluss zu den rechten Lappen führen kann. Daher ist die Menge an Wasser in der Eppendorfgefäße sollte der Maus beträgt und der s eingestellt werdenukunft Halter sollte distal von der Masche Ort platziert werden. Auf der gegenüberliegenden, wenn die Gewichte sind zu niedriger Blutdruck ist nicht vollständig gestoppt. Beide Fehler sind leicht erkennbar durch eine zusätzliche Farbwechsel bis blass des rechten Lappens oder unzureichende Farbumschlag der mittleren und linken Lappen, beziehungsweise. Deshalb ist die hepatische Farbänderung gemäß der Anwendung der Gewichte sollten alle 10 Minuten kontrolliert werden. Eine weitere häufige Komplikation ist die chirurgische Verletzungen der Leber mit der Nadel. Deshalb sind die rechten Lappen sollten mit einem milden Zange, so dass die Spitze der Nadel leicht gesehen werden kann und genommen mit einem Nadelhalter gehalten werden. Wenn diese Mängel zu Beginn berücksichtigt werden die hängenden Gewicht für hepatischer Ischämie bietet eine hohe Reproduzierbarkeit der Schädigung durch Ischämie durch Minimieren der Variabilität der Leberschäden mit Klemmung des Portals Triade zugeordnet. Durch die Verwendung eines hängenden Gew.-System wird das Portal Triade nur einmal im gesamten manipuliertchirurgischen Eingriff, wodurch deutlich weniger Schäden an den Leberlappen. Darüber hinaus tritt keine hepatische oder intestinale Kongestion mit dieser Technik. Mehr Gewebetrauma erfolgt durch Entfernen und Ersetzen Gefäßklemmen, vor allem mit Wiederanbringung der Klemme während mehrerer Zyklen wie Ischämie während der ischämischen Präkonditionierung. Die Verwendung der hängenden Gewichte, die in einem entfernten Standort aus dem Lebergewebe sind, nach unseren Beobachtungen, bietet den Vorteil einer zuverlässigen Verschluss und verhindert gleichzeitig Gewebetrauma durch Manipulation der Leberlappen durch erneute Anwendung von einer Klemme. Zusammengefasst stellt die vorliegende Studie Durchführbarkeit des hängenden Gewicht für Portal Triade Verschlusses während der Ischämie, die Minimierung der Variabilität und Einschränkungen Klemmelement verbunden ist. Damit diese Technik könnten von Interesse für andere Forscher, die ein Studium hepatischer Ischämie zu erwägen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die vorliegenden Studien wurden vom United States National Institutes of Health Zuschuss R01-HL092188, R01-DK083385 und R01HL098294 und Stiftung für Anästhesie Bildung und Forschung (FAER) gewährt HKE und ein DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Research Fellowship (GR2121/1- 1) und der American Heart Association Grant AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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References
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