Medicine

השימוש במערכת תלייה משקל של איסכמיה כבד בעכברים

Published: August 7, 2012 doi: 10.3791/2550

Michael Zimmerman¹, Eunyoung Tak², Maria Kaplan¹, Mercedes Susan Mandell², Holger K. Eltzschig², Almut Grenz²

¹UCH Transplant Center, University of Colorado, Denver, ²Department of Anesthesiology, University of Colorado, Denver

Summary

הקמנו מודל murine הרומן של המערכת תלוי במשקל עבור הפורטל השלישיה חסימה. טכניקה זו עשויה להיות שימושית לחקירות עתידיות של איסכמיה במודלים של הכבד Murine.

Abstract

פגיעה בכבד עקב איסכמיה חריפה עלולה להתרחש במהלך הליכים רפואיים שונים השתלת כבד כגון כריתת גידולים בכבד או תיקון הטראומה עלולה לגרום לאי ספיקת כבד שבו יש שיעור תמותה גבוה ^1-2. מחקרים Murine ולכן איסכמיה של הכבד הפכו בתחום החשוב של מחקר על ידי מתן הזדמנות לנצל מחקרים פרמקולוגיים וגנטיים ^3-9. באופן ספציפי, עכברים מותנה עם המחיקה רקמה ספציפית של גן (cre, flox המערכת) לספק תובנות לתוך התפקיד של חלבונים ברקמות מסוימות ^10-13. בשל הקושי הטכני קשורה באופן ידני לחיצה השלישיה פורטל בעכברים, ביצענו הערכה שיטתית באמצעות מערכת התלייה משקל על חסימה השלישיה פורטל אשר תוארה בעבר ^3. באמצעות מערכת התלייה משקל אנחנו שמים תפר סביב הענף השמאלי של השלישיה הפורטל מבלי לגרום כל נזק באונות הכבד, שכן גםמיטב מהדק הזמינים יכול לגרום נזק לרקמות הכבד בגלל המיקום הקרוב של רקמת הכבד על כלי. יתר על כן, ענף הימני של השלישיה הכבד הוא perfused עדיין ולכן אין גודש במעיים מתרחש עם הטכניקה הזו כמו את זרימת הדם אל האונות בכבד הנכונים נשמר. יתר על כן, השלישיה הפורטל היא מניפולציה רק פעם אחת לאורך כל ההליך הכירורגי כולו. כתוצאה מכך, הליכים כמו מיזוג מראש, עם זמני קצרים של איסכמיה ו reperfusion, ניתן לבצע בקלות. בחינה שיטתית של מודל זה על ידי ביצוע איסכמיה שונה פעמים reperfusion גילה קשר הדוק זמן איסכמיה הכבד עם נזק כבד, כפי שהיא נמדדת על ידי אלאנין (ALT) ו aspartate (AST) רמות בסרום aminotransferase ^3,9. יחדיו, מחקרים אלה מאשרים פגיעה בכבד לשחזור ביותר בעת השימוש במערכת התלייה משקל של איסכמיה הכבד reperfusion לסירוגין. כך, טכניקה זו עשויה להיות שימושית עניין חוקרים אחריםאד איסכמיה מחקרים כבד בעכברים. לכן את הסרטון מספק תיאור מפורט, שלב אחר שלב של הטכניקה הזו.

Protocol

הערות כלליות. כל פעולות יש לבצע תחת מיקרוסקופ לנתח זקוף (לייקה) ועל ידי שימוש coagulator כירורגית. העכברים בקבוצות הניסוי ואת העמדת פנים יש להתאים בגיל ומשקל כדי להבטיח השוואה של התוצאות. הממשל, טמפרטורה לחץ דם, נוזל ההרדמה צריכה להיות יציבה להשגחה במהלך הניסוי כולו.

1. הרדמה כירורגיה

עכברים C57BL / 6 צריך להיות בטווח גיל של 10 עד 16 שבועות, הם צריכים להיות מין בהתאמה בקבוצות, בהתאמה.
להרדים עכברים עם נתרן pentobarbital (70 מ"ג / ק"ג משקל גוף ה-IP) ולשמור הרדמה עם כ. 10 מ"ג / ק"ג / שעה נתרן pentobarbital. מינון יתר יכולה באופן משמעותי להוריד את לחץ הדם ולכן יכול לשנות את התוצאות.
עכברים מקום על השולחן טמפרטורה מבוקרת מחוממת (RT, Effenberg, מינכן, גרמניה) עם בדיקה רקטלית מדחום מחובר משוב תרמיתבקר כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ° C.
מקום עכברים בעמדה פרקדן על שולחן הניתוח, עם הגפיים העליונים והתחתונים הצמודות בטבלה עם סרט נשלף.
במקרה של ניסויים הישרדות טכניקות אספטיים המתאימים כולל גזירת השיער, חיטוי העור עם iodophors בבטאדין (למשל), טיפול סטרילי של מכשירים autoclaved, ושימוש במסכות כמה כפפות סטריליות למנתח נדרשים.

2. פורטל שלישיה ספיגה

לכסות את אזור החתך עם שמן מינרלי כדי למנוע שאיפה של שיער העכבר על ידי חיתוך של העור ובכך למנוע את הסיכון לאלרגיות שיער העכבר. בצע laparotomy חתך קו האמצע של Linea alba עד הקצה העליון, כך שאתה יכול בקלות לחשוף את הכבד. אם אפשר לבצע את החתך עם אלקטרודה קרישה (Erbe, ICC50, Tuebingen, גרמניה) כדי למנוע דימום.
מניחים את הטבלה חימום עם העכבר במצב שהזנב הוא direcטד למנתח. עמדה זו מספקת לך ההגדרה הטובה ביותר לתהליך הלוקליזציה של השלישיה ולהעמיד תפר.
את מקומו של המעי בצד ימין באמצעות ספוגית לחה עצה כותנה לחשוף את השלישיה הפורטל.
קצת להזיז את האונה חציון שמאלה לכיוון הסרעפת ואת האונה הימנית לכיוון המעי. זה ייתן לך תצוגה ברורה של השלישיה הפורטל מעל הסתעפות של הזכות, חציון / שמאל אונות.
בזהירות לבדוק את השלישיה פורטל והחזק את האונה הימנית בעדינות עם מלקחיים תפל. זה ייתן לך נוף יפה על השלישיה הפורטל השמאלי.
לאחר שזוהו חזותית במקום מחט עם תפר (7/0 תפר ניילון; Ethicon, Norderstedt, גרמניה) באמצעות בעל מחט תחת שמאל פורטל השלישיה, כולל עורק הכבד, וריד הכבד, ואת צינור המרה מצד שמאל לצד ימין של העכבר.
תפר צריך להיות הדוק תחת השלישיה. תפר עמוק יותר יכול לפגוע וקה הנבוב נחות הנמצא תחתהשלישיה. לכן להחזיק את אונה של הכבד ישר עם מלקחיים כדי לזהות את הווריד הנבוב לפני ביצוע תפר.
קח את קצה המחט בצד ימין עם מלקחיים כמה ולמשוך אותו בעדינות מחוץ לאזור הכבד מבלי לפגוע בכבד.
צרף לסוף כל אחד תפר הצינור Eppendorf (כ 3 גרם, מלא מים) ומניחים תפר בשני הקצוות על בעלי תפר. מניחים את בעל תפר distally של תפר כך תפר לא מפריע השילוש הנכון.
על ידי יישום משקולות השלישיה יהיה occluded באופן מיידי, גורמת הפרעה באספקת הדם האונות שמאל החציוני של הכבד. חסימה מוצלחת ניתן לאשר בקלות על ידי בדיקה ויזואלית של הלבנה החיוורת של האונות איסכמי. לעומת זאת, שינוי של צבע מיד נעלמת כאשר המשקולות התלויות משתחררים הקטבים ואת הכבד reperfused. מודל חלקי איסכמיה כבד נמנע עומס mesenteric באמצעות שמירה blooזרימת ד את אונה של הכבד הנכונים.
החלף את המעי לחלל הבטן. שמור את הכבד חם המעי עם ספוגית לחה ספוגה במים על 37.0 ° C. כמו כן כדי לשמור על טמפרטורת גוף יציבה לכסות את העכברים עם גלישת מזון זמינים מסחרית לאחר סיום הניתוח.
בצע איסכמיה כנדרש לפי פרוטוקול הניסוי. לאחר שחרור מוגדר בזמן איסכמיה את משקולות reperfusion של אונות כבד חציון שמאל יתחיל באופן מיידי. טכניקה זו מאפשרת לייצר איסכמיה הפיכה בעכברים. אם אין איסכמיה פעמים נוספות יבוצעו בזהירות להסיר את התפרים.
להוסיף כ 400 נתרן כלורי μl לתוך חלל הבטן 15 דקות לפני מיד לאחר reperfusion. המשך להחליף נוזלים כל 30 דקות בסך של 100 μl לפצות אובדן הנוזלים בזמן reperfusion.
עבור ניסויים הישרדות פצע כירורגי סגור באמצעות תפר מתמשך של קיר השרירים והעור Wiה תפר 4/0.

3. שינויים זלוף כבד

הפרמטרים התוצאות הבאות מומלץ לקבוע פגיעה בכבד הכבד איסכמיה הבאה:

לקבוע אנזימי הכבד (למשל ALT, AST) ואת הכבד היסטולוגיה (צביעת H & E) איסכמיה הכבד הבא reperfusion ^3,9.

איור 1 מודל של מערכת התלייה משקל כבד על איסכמיה. מערכת המשקל תלוי הוקם כדי לגרום איסכמיה הכבד של האונה השמאלית חציון ^3. (א) לכן באונה caudate וימין הופרדו בעדינות מהאונה השמאלית. האונה הימנית אז זז מעט כדי להציג בבירור את השלישיה הפורטל מעל הסתעפות של אונות, ימין ושמאל החציוני. תפר 8.0 ניילון הוטל השלישיה הכבד השמאלית. (ב) בסוף כל תפר קטן משקל (3 גרם Eppendorf ט"וBES מלאים מים) היה קשור ויישומי. איסכמיה הכבד גלוי על ידי שינוי צבע של האונה השמאלית החציוני מאדום בהיר. זה עיצוב ניסיוני מאפשר חסימה מדויק reperfusion של השלישיה הכבד השמאלי על ידי הפעלת ושחרור עומס המשקל.

איור 2. השפעת איסכמיה פעמים שונות כבד על אלאנין (ALT) ו aspartate (AST) aminotransferase בעכברים. איסכמיה חלקית פורטל השלישיה הושרה כמצוין (0-60 דקות איסכמיה). אחרי שעה 2 של reperfusion, ALT (א) ו AST (ב ') נמדדו. התוצאות באות לידי ביטוי כאמצעי ± SE של 6 - 7 עכברים / קבוצה. * P <0.05 לעומת 0 דקות איסכמיה (דמה שליטה).

Discussion

המחקר הנוכחי מתאר את הטכניקה של ביצוע איסכמיה במודל murine באמצעות מערכת התלייה משקל על חסימה של השלישיה שמאל הכבד הפורטל. למרות זאת הוא שיטה קלה ללמוד את החסרונות הבאים יש לקחת בחשבון. טעות נפוצה מאוד בהתחלה הוא תפר עמוק הכולל את השלישיה פורטל הווריד הנבוב. קצב הנשימה והלב יהיה להאט תוך 15 דקות בשל התנגדות מוגברת ירידה חוזר הדם אל הלב והתוצאה היא מוות מוקדם של העכברים. הדרך הטובה ביותר למנוע כולל של הווריד הנבוב היא לתהליך הלוקליזציה של הווריד הנבוב לפני תפר ידי החזקת האונות ישר עם מלקחיים מספר. נושא חשוב נוסף הוא כי המשקולות הם לא כבדה אשר עלולה לגרום ללחץ רב מדי על משפט הפורטל על ימין ועל שמאל אשר גם מפסיק את זרימת הדם אל האונות המתאימות. לכן כמות המים צלוחיות Eppendorf יש להתאים את משקל העכבר שלבעלי uture צריך להיות ממוקם distally ממיקום תפר. ביום השני אם המשקולות הן לחץ דם נמוך אינו נעצר לחלוטין. טעויות שניהם בקלות לזיהוי על ידי שינוי צבע נוסף חיוור של האונה הימנית או שינוי צבע מספקת של האונות חציון שמאל, בהתאמה. לכן צבע הכבד שינוי בעקבות יישום משקולות צריך להיות נשלט על כל 10 דקות. עוד סיבוך ניתוחי נפוצה היא פגיעה של הכבד בעזרת מחט. לכן האונות את הזכות יש לקיים את עם מלקחיים תפל כך את קצה המחט ניתן לראות בקלות לקחת עם בעל מחט. אם אלה מלכודות בתחילת נלקחים בחשבון את מערכת התלייה משקל של איסכמיה הכבד מספק פגיעה לשחזור ביותר בשל איסכמיה ידי צמצום שונות של נזק לכבד הקשור לחיצה על השלישיה הפורטל. באמצעות מערכת התלייה משקל, השלישיה הפורטל היא מניפולציה רק פעם אחת לאורך כלהליך כירורגי, גרימת נזק משמעותי פחות האונות בכבד. בנוסף, לא גודש בכבד או במעיים מתרחש עם טכניקה זו. הטראומה לרקמה יותר מתרחשת על ידי הסרת והחלפת מהדק כלי, במיוחד עם reapplication של מהדק במהלך מחזורי איסכמיה מרובים כמו במהלך נפשית מראש איסכמי. השימוש תלוי במשקל כי הם במיקום מרוחק מרקמת הכבד, על פי התצפיות שלנו, מספקת את היתרון של חסימה אמין תוך מניעת טראומה לרקמות עקב מניפולציה של אונה של הכבד על ידי reapplication של מהדק. יחדיו, המחקר הנוכחי מספק היתכנות של מערכת התלייה משקל עבור הפורטל השלישיה חסימה בזמן איסכמיה, מזעור שונות ומגבלות הקשורות מהדק. לכן טכניקה זו עשויה להיות עניין של חוקרים אחרים הרואים בלימוד איסכמיה הכבד.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

המחקרים הנוכחיים נתמכו על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות מענק R01-HL092188, R01-DK083385 ו R01HL098294, ואת הקרן לחינוך ומחקר הרדמה (FAER) מעניקה HKE ו (דויטשה Forschungsgemeinschaft) DFG מחקר Fellowship (GR2121/1- 1) ו - American Heart Association מענק AG.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Pentobarbital (Fatal Plus)	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4 mg/mL in saline
Suture, Prolene 8.0	Ethicon, USA	M8739	reusable
dissecting microscope	Leica	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Surgical instruments	WPI, Dumont		Forceps, needle holder
Coagulator	Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany	n/a	Different providers of coagulators
Table 1. Specific reagents and equipment.