Summary
हम फांसी पोर्टल त्रय रोड़ा के लिए वजन प्रणाली के एक उपन्यास murine मॉडल की स्थापना की. इस तकनीक के के murine यकृत मॉडल में ischemia के भविष्य जांच के लिए उपयोगी हो सकता है.
Abstract
तीव्र जिगर ischemia के कारण चोट कई नैदानिक जैसे यकृत प्रत्यारोपण यकृत ट्यूमर लकीर या मानसिक आघात की मरम्मत की प्रक्रिया के दौरान होते हैं और जिगर की विफलता है जो एक उच्च मृत्यु दर 1-2 परिणाम कर सकते हैं. इसलिए यकृत ischemia के murine अध्ययन औषधीय और आनुवंशिक अध्ययन 3-9 का उपयोग करने का अवसर प्रदान कर अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र बन गए हैं. विशेष रूप से, ऊतक एक जीन की विशिष्ट विलोपन (रचनात्मक, flox प्रणाली) के साथ सशर्त चूहों विशेष 10-13 ऊतकों में प्रोटीन की भूमिका में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं. तकनीकी मैन्युअल रूप से चूहों में पोर्टल त्रय clamping के साथ जुड़े कठिनाई की वजह से, हम एक व्यवस्थित फांसी वजन पोर्टल त्रय रोड़ा जो पहले कर दिया गया है 3 में वर्णित के लिए एक प्रणाली का उपयोग कर मूल्यांकन प्रदर्शन किया. फांसी वजन एक प्रणाली का उपयोग करके हम यकृत lobes को किसी भी क्षति कारण के बिना भी बाद से पोर्टल त्रय के बाईं शाखा के चारों ओर एक सीवन जगहबेहतरीन उपलब्ध clamps के जहाजों को जिगर ऊतक के निकट स्थान की वजह से यकृत के ऊतकों को नुकसान हो सकता है. इसके अलावा, यकृत त्रय की सही शाखा अभी भी इस प्रकार perfused नहीं आंतों भीड़ इस तकनीक के साथ होता है सही यकृत lobes को रक्त प्रवाह के रूप में संरक्षित है. इसके अलावा, पोर्टल त्रय पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान केवल एक बार चालाकी. एक परिणाम के रूप में, प्रक्रियाओं पूर्व कंडीशनिंग की तरह, ischemia और reperfusion से कम समय के साथ आसानी से किया जा सकता है. अलग ischemia और reperfusion समय प्रदर्शन से इस मॉडल का व्यवस्थित मूल्यांकन जिगर की क्षति का साथ यकृत ischemia समय के एक करीबी संबंध का पता चला है के रूप में (ALT) alanine और (AST) के aspartate aminotransferase सीरम स्तर 3,9 की मापा. साथ में ले ली, इन अध्ययनों अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य जिगर चोट की पुष्टि जब यकृत ischemia और आंतरायिक reperfusion के लिए फांसी वजन प्रणाली का उपयोग कर. इस प्रकार, इस तकनीक अन्य जांचकर्ताओं ब्याज के लिए उपयोगी हो सकता हैचूहों में जिगर ischemia के अध्ययन में एड. इसलिए वीडियो क्लिप इस तकनीक का एक विस्तृत वर्णन कदम से कदम प्रदान करता है.
Protocol
सामान्य टिप्पणी. सभी आपरेशनों एक ईमानदार विदारक माइक्रोस्कोप (Leica) के तहत और एक शल्य आतंचक का उपयोग किया जाना चाहिए. प्रयोगात्मक और नकली समूहों में चूहों की उम्र और वजन में मिलान किया जाना चाहिए करने के लिए परिणामों की तुलनात्मकता सुनिश्चित. तापमान, रक्तचाप, संज्ञाहरण, और तरल पदार्थ प्रशासन स्थिर और पूरे प्रयोग के दौरान निगरानी होनी चाहिए.
1. संज्ञाहरण और सर्जरी
- C57BL / 6 चूहों में 10 से 16 सप्ताह की आयु सीमा के भीतर हो और वे लिंग संबंधित समूहों में मिलान होना चाहिए.
- Pentobarbital सोडियम (70 शरीर मिलीग्राम / किग्रा वजन आईपी) के साथ चूहों असंवेदनता उत्पन्न करना और बनाए रखने के लगभग साथ संज्ञाहरण. 10 मिलीग्राम / किग्रा / घंटे सोडियम pentobarbital. Overdosing काफी रक्तचाप को कम कर सकते हैं और इस प्रकार परिणाम को बदल सकते हैं.
- जगह चूहों के एक तापमान नियंत्रित गर्म तालिका (आरटी, Effenberg, म्यूनिख, जर्मनी) पर एक गुदा थर्मामीटर जांच के साथ एक थर्मल प्रतिक्रिया से जुड़ी37 में शरीर का तापमान बनाए रखने के नियंत्रक डिग्री सेल्सियस
- सर्जरी की मेज पर एक लापरवाह स्थिति में जगह के ऊपरी और निचले extremities के साथ हटाने योग्य टेप के साथ तालिका से जुड़ी, चूहों.
- अस्तित्व प्रयोगों के मामले में बाल की कतरन, त्वचा की (जैसे Betadine) iodophors, autoclaved उपकरणों की बाँझ से निपटने, और मास्क सर्जन के लिए एक बाँझ दस्ताने का उपयोग कर के साथ कीटाणुशोधन सहित उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक की आवश्यकता है.
2. पोर्टल तीनों आड़
- खनिज तेल के साथ त्वचा में कटौती और इस प्रकार माउस बाल एलर्जी के जोखिम को रोकने के द्वारा माउस बालों की साँस लेना रोकने के कवर चीरा क्षेत्र. ऊपरी छोर तक प्रदर्शन midline और LINEA अल्बा के laparotomy चीरा ताकि आप आसानी से जिगर बेनकाब कर सकते हैं. यदि संभव हो तो जमावट (Erbe है, ICC50, Tuebingen, जर्मनी) इलेक्ट्रोड रक्तस्राव को रोकने के साथ चीरा प्रदर्शन.
- माउस के साथ एक स्थिति है कि पूंछ निदेशक है हीटिंग तालिका में रखेंसर्जन के लिए टेड. स्थिति है कि आप सबसे अच्छा करने के लिए त्रय स्थानीयकरण और सिवनी जगह सेटिंग के साथ प्रदान करता है.
- सही पक्ष पर एक गीला कपास टिप झाड़ू का उपयोग करने के लिए पोर्टल त्रय का पर्दाफाश द्वारा आंत विस्थापित.
- थोड़ा डायाफ्राम की ओर मंझला और बाईं पालि और आंत की ओर सही पालि बदलाव. कि तुम सही, मंझला छोड़ दिया / lobes के विभाजन के ऊपर पोर्टल त्रय का एक स्पष्ट विचार दे देंगे.
- ध्यान से पोर्टल त्रय का निरीक्षण किया और सही पालि नरम संदंश के साथ धीरे नीचे पकड़. कि आप बाईं पोर्टल त्रय पर एक अच्छा विचार दे देंगे.
- बाईं पोर्टल त्रय के तहत सुई धारक यकृत धमनी, यकृत नस, और बाईं से दाईं ओर पित्त नली सहित, के माध्यम से, एक बार नेत्रहीन जगह सीवन (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी 7/0 नायलॉन सिवनी) के साथ सुई की पहचान की माउस के.
- सिलाई त्रय के तहत मिलकर हो गया है. एक गहरी सिलाई रग vaca अवर जो नीचे स्थित है को घायल कर सकते हैंत्रय. इसलिए सही जिगर lobes पकड़ नीचे संदंश साथ सिलाई रखने से पहले रग Cava की पहचान.
- एक संदंश के साथ सही पक्ष पर सुई की नोक ले लो और यह धीरे जिगर घायल बिना जिगर क्षेत्र के बाहर खींच.
- सीवन Eppendorf ट्यूब (लगभग 3 जी, पानी से भरा) के प्रत्येक के अंत करने के लिए देते हैं और जगह दोनों सीवन सीवन धारकों से अधिक समाप्त होता है. सीवन धारक सिलाई की distally जगह इतनी है कि सीवन सही त्रय के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है.
- भार लागू करके त्रय तुरंत अवरोधित हो सकता है, जिगर के बाईं और मंझला lobes को रक्त की आपूर्ति की रुकावट के कारण. सफल रोड़ा आसानी से इस्कीमिक lobes के पीला blanching के दृश्य निरीक्षण के द्वारा पुष्टि की जा सकती है. इसके विपरीत, रंग के परिवर्तन को तुरंत गायब हो जाता है जब फांसी वजन डंडे से जारी कर रहे हैं और जिगर reperfused है. यह आंशिक यकृत ischemia मॉडल bloo संरक्षण द्वारा mesenteric भीड़ से बचा जाता हैसही जिगर lobes को घ प्रवाह.
- उदर गुहा में आंत बदलें. एक गीला 37.0 पर पानी से लथपथ झाड़ू के साथ जिगर और आंत गर्म रखें डिग्री सेल्सियस इसके अलावा शरीर के तापमान को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भोजन की चादर के साथ सर्जरी खत्म होने के बाद चूहों को कवर स्थिर रखने के लिए.
- Ischemia के प्रदर्शन करना प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के प्रति आवश्यक के रूप में. मंझला और छोड़ दिया जिगर lobes के वजन और reperfusion की एक परिभाषित ischemia के समय रिलीज के बाद तुरंत शुरू कर देंगे. इस तकनीक चूहों में पलटवाँ ischemia के उत्पादन की अनुमति देता है. यदि कोई आगे ischemia बार प्रदर्शन किया जाएगा ध्यान से सिवनी हटाने.
- 15 मिनट पहले और सीधे reperfusion के बाद उदर गुहा में लगभग 400 μl सोडियम क्लोराइड जोड़ें. द्रव हर 30 मिनट 100 μl की राशि reperfusion के समय के दौरान तरल पदार्थ नुकसान की भरपाई में स्थानापन्न करने के लिए जारी रखें.
- अस्तित्व प्रयोगों के लिए शल्य चिकित्सा घाव मांसपेशी दीवार की लगातार सीवन और त्वचा वाई का उपयोग बंद कर दिया हैएक 4/0 सीवन वें.
3. लिवर परफ्यूज़न में परिवर्तन
निम्नलिखित परिणाम मानकों को जिगर चोट निम्नलिखित यकृत ischemia निर्धारित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं:
जिगर एंजाइमों (जैसे ALT, AST) और जिगर ऊतक विज्ञान (एच ई धुंधला) निम्नलिखित जिगर ischemia और 3,9 reperfusion की निर्धारित करते हैं.
चित्रा 1 जिगर ischemia के लिए एक प्रणाली फांसी वजन के मॉडल: एक फांसी वजन प्रणाली के लिए छोड़ दिया और मंझला 3 पालि के जिगर ischemia के प्रेरित करने के लिए स्थापित किया गया है. (ए) में इसलिए पूंछवाला और सही पालि धीरे बाईं पालि से अलग हो गए थे. सही पालि था तो थोड़ा स्थानांतरित करने के लिए स्पष्ट रूप से सही, मंझला और बाएँ lobes के विभाजन के ऊपर पोर्टल त्रय देखने. एक 8.0 नायलॉन सीवन बाईं यकृत त्रय के तहत रखा गया था. (ख) प्रत्येक सीवन के अंत में एक छोटा सा वजन (3 जी Eppendorf तूपानी से भरा bes) संलग्न है और लागू किया गया था. यकृत ischemia के लाल से पीला करने के लिए छोड़ दिया और मंझला पालि के रंग बदलने से दिखाई देता है. इस प्रयोगात्मक डिजाइन की अनुमति देता है सटीक और लागू करने और जारी वजन लोड के द्वारा छोड़ दिया यकृत त्रय की reperfusion की आड़.
चित्रा 2 अलग जिगर ischemia बार की alanine (ALT) और aspartate (AST) के चूहों में aminotransferase पर प्रभाव. आंशिक पोर्टल त्रय ischemia दर्शाया (- 60 मिनट ischemia 0) के रूप में प्रेरित किया गया था. Reperfusion के 2 घंटे के बाद, ALT और AST (बी) (ए) मापा गया. 7 चूहों / समूह - परिणाम ± 6 के एसई मतलब है के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. * पी <0.05 0 मिनट ischemia के (दिखावा नियंत्रण) के साथ तुलना में.
Discussion
वर्तमान अध्ययन छोड़ दिया यकृत पोर्टल त्रय का रोड़ा फांसी वजन के लिए एक प्रणाली का उपयोग करके एक murine मॉडल में ischemia के प्रदर्शन की तकनीक का वर्णन करता है. हालांकि यह जानने के लिए आसान तरीका है निम्नलिखित नुकसान ध्यान में रखा जाना चाहिए. शुरुआत में एक बहुत ही आम गलती एक गहरी सिलाई जो पोर्टल त्रय और रग Cava शामिल है. श्वास और दिल की दर बढ़ प्रतिरोध और चूहों के एक जल्दी मौत में जिसके परिणामस्वरूप दिल रक्त लौटने में कमी के कारण 15 मिनट के भीतर नीचे धीमी हो जाएगी. रग Cava सहित रोकने का सबसे अच्छा तरीका सही lobes एक संदंश के साथ नीचे पकड़े द्वारा सिलाई से पहले रग Cava स्थानीयकरण है. एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि वजन भारी है जो छोड़ दिया और सही पोर्टल परीक्षण जो भी सही lobes को रक्त प्रवाह रुक जाता है पर बहुत ज्यादा तनाव में परिणाम कर सकते हैं नहीं कर रहे हैं. इसलिए माउस वजन और Eppendorf शीशियों में पानी की मात्रा समायोजित किया जाना चाहिएuture धारकों टांका स्थान से distally रखा जाना चाहिए. विपरीत पर अगर वजन कम रक्तचाप के लिए कर रहे हैं पूरी तरह से बंद नहीं है. दोनों गलतियों को आसानी से एक अतिरिक्त सही या मंझला और बाएँ lobes के अपर्याप्त रंग बदलने पालि का पीला रंग बदलने के द्वारा कर रहे हैं क्रमशः detectable. इसलिए यकृत रंग वजन लागू करने के बाद परिवर्तन हर 10 मिनट में नियंत्रित किया जाना चाहिए. एक अन्य आम शल्य चिकित्सा जटिलता सुई के साथ जिगर के घायल है. इसलिए सही lobes एक कमज़ोर संदंश इतना है कि सुई की नोक आसानी से हो सकता है और देखा जा सकता है एक सुई धारक के साथ लिया के साथ नीचे आयोजित किया जाना चाहिए. यदि शुरुआत में इन कमियों को ध्यान में रखा जाता यकृत ischemia के लिए फांसी वजन प्रणाली एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पोर्टल त्रय की clamping के साथ जुड़े जिगर क्षति की परिवर्तनशीलता को कम से कम ischemia के चोट की वजह से प्रदान करता है. फांसी वजन एक प्रणाली का उपयोग करके, पोर्टल त्रय ही पूरे भर में एक बार चालाकीशल्य चिकित्सा की प्रक्रिया काफी कम यकृत lobes को नुकसान हो सकता है. इसके अलावा, इस तकनीक के साथ कोई यकृत या आंतों की भीड़ होती है. अधिक ऊतक आघात हटाने और जगह के साथ विशेष रूप से इस्कीमिक शर्त के दौरान जैसे कई ischemia के चक्र के दौरान घोड़े का अंसबंध के reapplication पोत clamps के द्वारा होता है. वजन है कि जिगर ऊतक से एक दूरस्थ स्थान में फांसी, हमारी टिप्पणियों के अनुसार, उपयोग विश्वसनीय रोड़ा का लाभ प्रदान करता है, जबकि एक घोड़े का अंसबंध के reapplication द्वारा जिगर lobes के हेरफेर के कारण ऊतक आघात को रोकने. साथ में ले ली है, वर्तमान अध्ययन ischemia के दौरान पोर्टल त्रय रोड़ा के लिए फांसी वजन प्रणाली की व्यवहार्यता प्रदान करता है, परिवर्तनशीलता और सीमाओं clamping के साथ जुड़े कम से कम. इस प्रकार यह तकनीक अन्य जांचकर्ताओं जो यकृत ischemia के अध्ययन पर विचार के लिए ब्याज की हो सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
वर्तमान अध्ययन संयुक्त राज्य अमेरिका स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों R01-HL092188, R01 DK083385 और R01HL098294, और संज्ञाहरण शिक्षा और अनुसंधान के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित थे (FAER) HKE और DFG (ड्यूश Forschungsgemeinschaft) रिसर्च (फैलोशिप अनुदान GR2121/1- 1) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन एजी के लिए अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
