Summary
Vi etablerte en roman murine modell av en hengende vekt system for portalen triade okklusjon. Denne teknikken kan være nyttig for fremtidige undersøkelser av iskemi i murine hepatiske modeller.
Abstract
Akutt leverskade på grunn av iskemi kan oppstå under flere kliniske prosedyrer f.eks levertransplantasjon, nedsatt svulst reseksjon eller traumer reparasjon og kan resultere i leversvikt som har en høy dødelighet 1-2. Derfor murine studier av nedsatt iskemi har blitt en viktig forskningsfelt ved å gi mulighet til å utnytte farmakologiske og genetiske studier 3-9. Spesielt betingede mus med vev spesifikk sletting av et gen (CRE, flox system) gir innsikt i rollen som proteiner i bestemte vev 10-13. På grunn av tekniske problemer forbundet med manuelt fastspenning portalen triaden i mus, utførte vi en systematisk evaluering ved hjelp av en hengende vekt system for portalen triaden okklusjon som har blitt beskrevet tidligere tre. Ved å bruke en hengende vekt system legger vi en sutur rundt venstre grenen av portalen triaden uten å forårsake noen skade på hepatiske lobes, ettersom ogsåfineste klemmer tilgjengelig kan føre til nedsatt vevsskade på grunn av den nære plasseringen av leveren vev til fartøyene. Videre er det rett grenen av nedsatt triaden fortsatt perfused dermed ingen intestinal lunger forekommer med denne teknikken som blodtilførselen til de riktige hepatiske lobes er bevart. Videre er portalen triaden eneste manipulert en gang gjennom hele kirurgiske prosedyren. Som et resultat av prosedyrer liker pre-condition, med korte perioder med iskemi og reperfusjon, kan lett utføres. Systematisk evaluering av denne modellen ved å utføre ulike iskemi og reperfusjon ganger viste en nær sammenheng med nedsatt iskemi tid med leverskade målt ved alanin (ALT) og aspartat (AST) aminotransferase i serum 3,9. Samlet utgjør disse studier bekrefter svært reproduserbare leverskade ved bruk av henging vekt system for nedsatt iskemi og periodisk reperfusjon. Dermed kan denne teknikken være nyttig for andre etterforskere interesseed i leveren iskemi studier på mus. Derfor videoklippet gir en detaljert steg-for-steg beskrivelse av denne teknikken.
Protocol
Generelle bemerkninger. Alt arbeid må utføres under en oppreist dissekere mikroskop (Leica), og ved hjelp av et kirurgisk coagulator. Musene i eksperimentelle og humbug grupper bør bli matchet i alder og vekt for å sikre sammenlignbarhet av resultater. Temperatur, blodtrykk, anestesi og væske administrasjon bør være stabile og overvåkes under hele forsøket.
1. Anestesi og kirurgi
- C57BL / 6 mus bør være innenfor en aldersgruppe fra 10 til 16 uker, og de bør være kjønnsbasert matchet i de respektive gruppene.
- Anesthetize mus med natrium pentobarbital (70 mg / kg kroppsvekt ip) og opprettholde anestesi med ca. 10 mg / kg / time natrium pentobarbital. Overdosering kan redusere blodtrykket og dermed kan endre resultatene.
- Plasser mus på en temperaturkontrollert oppvarmet bord (RT, Effenberg, München, Tyskland) med en rektal termometer sonde festet til en termisk tilbakemeldingkontrolleren til å opprettholde kroppstemperaturen ved 37 ° C.
- Plasser mus i en liggende stilling på kirurgi bordet, med øvre og nedre ekstremiteter festet til bordet med avtagbar tape.
- Ved overlevelse eksperimenter riktige aseptiske teknikker inkludert klipping av hår, desinfeksjon av huden med iodophors (f.eks Betadine), steril håndtering av autoklaveres instrumenter, og bruke masker noen sterile hansker for kirurgen er nødvendig.
2. Portal Triad Okklusjon
- Dekk innsnitt området med mineralolje for å forhindre inhalering av mus hår ved å kutte i huden og dermed forhindrer risikoen for mus hår allergier. Utfør midtlinjen laparotomi og innsnitt i linea alba opp til den øvre enden slik at du enkelt kan eksponere leveren. Hvis mulig utføre snitt med en koagulasjon elektrode (Erbe, ICC50, Tuebingen, Tyskland) for å forhindre blødninger.
- Plasser oppvarming tabellen med musen i en posisjon at halen er retted til kirurgen. At stillingen gir deg den beste innstillingen for å lokalisere triaden og å plassere sutur.
- Forskyving tarmen på høyre side ved å bruke en våt bomull tips tip å avsløre portalen triaden.
- Litt skift median og venstre lapp mot mellomgulvet og høyre lapp mot tarmen. Det vil gi deg et klart syn på portalen triaden over bifurkasjon av retten, median / venstre fliker.
- Inspiser grundig portalen triaden og hold høyre lapp forsiktig ned med bland tang. Det vil gi deg en fin utsikt på venstre portalen triaden.
- Når visuelt identifisert sted nålen med sutur (7/0 nylon sutur; Ethicon, Norderstedt, Tyskland) via en nål holder under venstre portalen triaden, inkludert nedsatt arterien, nedsatt vene, og gallegang fra venstre til høyre side av musen.
- Sømmen må være nøye under triaden. En dypere sting kan skade vena Vaca mindreverdig som ligger undertriaden. Derfor holder de riktige lever lobes ned med tang for å identifisere vena cava før du legger sømmen.
- Ta spissen av nålen på høyre side med en tang og trekk den forsiktig ut av leveren området uten å skade leveren.
- Fest til hver ende av sutur en Eppendorf rør (ca 3 g, fylt med vann) og plasserer begge sutur ender i løpet sutur holdere. Plasser sutur innehaveren distalt av masken slik at suturen ikke griper rett triaden.
- Ved å bruke vektene triaden vil bli publisert umiddelbart okkludert, forårsaker avbrudd i blodtilførselen til venstre og median fliker i leveren. Vellykket okklusjon kan lett bekreftes ved visuell inspeksjon av blek blanchering av iskemiske fliker. I kontrast, forsvinner endring av farge umiddelbart når de hengende vektene er frigjort fra polene og leveren er reperfused. Dette delvis nedsatt iskemi modell unngår mesenteric lunger ved å bevare Blood strømme til de riktige leveren fliker.
- Bytt tarmen i bukhulen. Hold leveren og tarmen varm med en våt bomullspinne fuktet med vann ved 37,0 ° C. I tillegg til å holde kroppstemperaturen stabil dekke mus med kommersielt tilgjengelig mat wrap etter endt kirurgi.
- Utfør iskemi som kreves per forsøksprotokoll. Etter en definert iskemi tid utgivelsen vekter og reperfusjon av median og venstre lever lobes vil starte umiddelbart. Denne teknikken gjør det mulig å produsere reversibel iskemi i mus. Hvis ingen ytterligere iskemi ganger skal utføres forsiktig fjerne sutur.
- Legg ca 400 mL natriumklorid i bukhulen 15 minutter før og rett etter reperfusjon. Fortsett å erstatte væske hvert 30. minutt i en mengde på 100 mL å kompensere væsketapet under reperfusjon tiden.
- For overlevelse eksperimenter operasjonssåret er lukket med kontinuerlig sutur av muskelen veggen og hud with en 4/0 sutur.
3. Endringer i Liver Perfusjons
Følgende resultatmål parametere anbefales å bestemme leverskade følgende nedsatt iskemi:
Bestem leverenzymer (f.eks ALAT, ASAT) og leveren histologi (H & E flekker) følgende lever iskemi og reperfusjon 3,9.
Figur 1 Modell av en hengende vekt system for leveren iskemi:. En hengende vekt system er etablert for å indusere lever iskemi i venstre og median lapp tre. (A) Derfor caudatus og høyre lapp ble forsiktig skilt fra venstre lapp. Retten lapp var da litt forskjøvet til tydelig vise portalen triaden over bifurkasjon av retten, median og venstre fliker. En 8,0 nylon sutur ble lagt under venstre nedsatt triaden. (B) På slutten av hver sutur en liten vekt (3 g Eppendorf tuBES fylt med vann) ble festet og anvendt. Nedsatt iskemi er synlig ved en fargeendring av venstre og median lapp fra rød til blek. Dette eksperimentelle designet tillater presis okklusjon og reperfusjon av venstre nedsatt triaden ved å bruke og slippe belastningen med vektskiver.
Figur 2. Effekt av ulike leverenzymer iskemi ganger på alanin (ALT) og aspartat (AST) aminotransferase i mus. Delvis portal triade iskemi ble indusert som angitt (0 - 60 min iskemi). Etter to timer av reperfusjon, ble ALT (A) og AST (B) målt. Resultatene er uttrykt som middel ± SE av 6 - 7 mus / gruppe. * P <0,05 sammenlignet med 0 min iskemi (humbug kontroll).
Discussion
Denne studien beskriver en teknikk for å utføre iskemi i en murine modell ved hjelp av en hengende vekt system for okklusjon av venstre nedsatt portalen triade. Selv om det er en enkel metode for å lære følgende fallgruver bør tas i betraktning. En svært vanlig feil i begynnelsen er en dyp maske som inkluderer portalen triaden og vena cava. Den pust og puls vil avta i løpet av 15 minutter på grunn av økt motstand og nedgangen i retur blod til hjertet som resulterer i en tidlig død av musene. Den beste måten å forhindre blant annet av vena cava er å lokalisere vena cava før sting ved å holde de riktige lobes ned med en tang. En annen viktig sak er at vektene ikke er for tung som kan resultere i for mye stress på venstre og høyre portal rettssaken som også stopper blodtilførselen til de riktige fliker. Derfor mengden av vann i Eppendorf ampuller bør justeres til musen vekt og suture holdere bør plasseres distalt fra sømmen sted. På motsatt hvis vektene er til lavt blodtrykk ikke er helt stoppet. Begge feilene er lett påvises ved en ekstra farge endring blek av høyre lapp eller utilstrekkelig fargeendring av median og venstre fliker, henholdsvis. Derfor nedsatt fargeendring etter søknad vektene bør kontrolleres hvert 10. minutt. En annen vanlig kirurgisk komplikasjon er skade på leveren med nålen. Derfor retten lobes bør holdes nede med et tørt tang slik at nålespissen kan lett sees og tatt med en nål holder. Hvis disse fallgruvene i begynnelsen tas hensyn til henging vekt system for nedsatt iskemi gir en svært reproduserbar skade på grunn av iskemi ved å minimere variasjonen av leverskader assosiert med fastspenning av portalen triaden. Ved å bruke en hengende vekt system, er portalen triaden eneste manipulert en gang gjennom helekirurgisk prosedyre, forårsaker betydelig mindre skade på hepatiske fliker. I tillegg oppstår ingen lever eller tarm lunger med denne teknikken. Mer vev traumer oppstår ved å fjerne og erstatte fartøy klemmer, spesielt med reapplication av klemmen ved flere iskemi sykluser som i løpet av iskemisk prekondisjonering. Bruken av hengende vekter som er på en ekstern plassering fra leveren vev, ifølge våre observasjoner, gir fordelen av pålitelige okklusjon mens hindre vev traumer på grunn av manipulasjon av leveren lobes ved reapplication av en klemme. Til sammen gir denne studien gjennomførbarheten av de hengende vekt system for portalen triaden okklusjon under iskemi, minimere variasjonen og begrensninger knyttet til fastspenning. Derfor er denne teknikken kan være av interesse for andre forskere som mener å studere nedsatt iskemi.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
De foreliggende studiene ble støttet av USA National Institutes of Health stipend R01-HL092188, R01-DK083385 og R01HL098294, og Stiftelsen for anestesi Utdannings-og forskningsdepartementet (FAER) støtte for HKE og en DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Research Fellowship (GR2121/1- 1) og American Heart Association Grant til AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
