Summary
Nós estabelecemos um novo modelo murino de um sistema de peso pendurado por isquemia hepática. Esta técnica pode ser útil para futuras investigações de isquemia em modelos murinos hepáticas.
Abstract
Lesão hepática aguda por isquemia pode ocorrer durante diversos procedimentos clínicos de transplante de fígado, por exemplo, a ressecção do tumor hepático ou reparação trauma e pode resultar em insuficiência hepática, que tem uma alta taxa de mortalidade 1-2. Portanto estudos murino de isquemia hepática têm se tornado um importante campo de pesquisa, proporcionando a oportunidade de utilizar estudos farmacológicos e genéticos 3-9. Especificamente, os camundongos com deleção condicionais tecido específico de um gene (CRE, Flox sistema) fornecer insights sobre o papel de proteínas em tecidos específicos 10-13. Devido à dificuldade técnica associada com manualmente aperto da tríade portal em ratos, foi realizada uma avaliação sistemática utilizando uma suspensão do sistema de peso-para o portal de oclusão tríade que foi previamente descrito 3. Ao utilizar uma suspensão do sistema de peso que se coloca um sutura em torno do ramo esquerdo da tríade portal sem causar qualquer dano para os lobos hepáticos, uma vez que também amais finos disponíveis braçadeiras pode causar danos no tecido hepático, devido à localização perto do tecido do fígado para os vasos. Além disso, o ramo direito da tríade hepática ainda é perfundido, portanto, nenhuma congestão intestinal ocorre com esta técnica como o fluxo sanguíneo para os lobos hepáticos direito é preservado. Além disso, a tríade portal é apenas uma vez manipulado durante todo o procedimento cirúrgico. Como resultado, os procedimentos de procura de pré-condicionamento, com tempos curtos de isquemia e reperfusão, pode ser facilmente executada. Uma avaliação sistemática do modelo, realizando isquemia diferente e os tempos de reperfusão revelaram uma estreita correlação do tempo de isquemia hepática com lesão hepática medida pela alanina (ALT) e aspartato (AST) aminotransferases níveis séricos 3,9. Tomados em conjunto, esses estudos confirmam lesão hepática altamente reprodutível quando se utiliza o sistema de enforcamento peso para isquemia e reperfusão hepática intermitente. Assim, esta técnica pode ser útil para o interesse outros investigadoresed em estudos de fígado isquemia em ratinhos. Por conseguinte, o clipe de vídeo fornece uma descrição passo-a-passo detalhada desta técnica.
Protocol
Observações gerais. Todas as operações devem ser realizada sob um microscópio de dissecação vertical (Leica) e usando um coagulador cirúrgico. Os camundongos dos grupos experimentais e simulação deve ser compensada de idade e peso para garantir a comparabilidade dos resultados. Administração de temperatura, pressão arterial anestesia, e fluido deve ser estável e monitorizados durante toda a experiência.
1. Anestesia e Cirurgia
- Camundongos C57BL / 6 deve estar dentro de uma faixa etária de 10 a 16 semanas e eles devem ser pareados por sexo nos grupos respectivos.
- Anestesiar os ratos com pentobarbital sódico (70 mg / kg ip de peso corporal) e manter a anestesia com aprox. 10 mg de sódio / kg / h pentobarbital. A sobredosagem pode reduzir significativamente a pressão arterial e, portanto, pode alterar os resultados.
- Ratinhos lugar sobre uma mesa de temperatura controlada aquecida (RT, Effenberg, Munique, Alemanha) com uma sonda do termómetro rectal ligado a um retorno térmicocontrolador para manter a temperatura corporal a 37 ° C.
- Ratinhos posicionar numa posição supina sobre a mesa de cirurgia, com as extremidades superiores e inferiores ligados à mesa com fita removível.
- Em caso de experiências de sobrevivência adequadas técnicas assépticas, incluindo o corte de cabelo, a desinfecção da pele com iodóforos (Betadine, por exemplo), tratamento de estéril de instrumentos autoclavadas, e utilizando máscaras um luvas esterilizadas para o cirurgião são necessários.
2. Portal Tríade Oclusão
- Cobrir a área de incisão com óleo mineral para evitar a inalação de cabelo do rato através do corte da pele e prevenindo assim o risco de alergias cabelo de rato. Realizar laparotomia mediana e incisão da linha alba até a extremidade superior de modo que você pode facilmente expor o fígado. Se possível realizar a incisão com um eléctrodo de coagulação (Erbe, ICC50, Tuebingen, Alemanha) para evitar o sangramento.
- Coloque a tabela de aquecimento com o mouse em uma posição de que a cauda é direçãoted para o cirurgião. Essa posição lhe fornece a melhor configuração para localizar a tríade e colocar a sutura.
- Deslocar o intestino, no lado direito, utilizando uma compressa de algodão molhado ponta para expor a tríade portal.
- Ligeiramente mudar o lobo mediano e esquerdo em direção ao diafragma e do lobo direito para o intestino. Isso lhe dará uma visão clara da tríade portal acima da bifurcação da direita, mediana / esquerda lobos.
- Verifique cuidadosamente a tríade portal e segure o lobo direito, com cuidado, com uma pinça branda. Isso lhe dará uma bela vista sobre a tríade portal esquerda.
- Uma vez identificada visualmente lugar a agulha com a sutura (7/0 de sutura de nylon; Ethicon, Norderstedt, Alemanha) por meio de um suporte de agulha sob a esquerda da tríade portal, incluindo a artéria hepática, a veia hepática, e vias biliares a partir do lado esquerdo para o lado direito do mouse.
- O ponto tem de ser cuidadosamente sob a tríade. A mais profunda do ponto pode ferir a veia vaca inferior que está localizado soba tríade. Portanto, manter os lobos hepáticos direito para baixo com a pinça para identificar a veia cava antes de colocar o ponto.
- Tomar a ponta da agulha, no lado direito com uma pinça e puxá-la suavemente para fora da área do fígado sem ferir o fígado.
- Anexar a cada extremidade da sutura um tubo Eppendorf (aproximadamente 3 g, cheio de água) e colocar tanto a sutura termina sobre suportes de sutura. Coloque o suporte de sutura distalmente da costura de modo a que a sutura não interfere com a tríade direita.
- Ao aplicar os pesos da tríade será imediatamente ocluída, causando a interrupção do fornecimento de sangue para os lobos esquerdo e mediano do fígado. Oclusão bem sucedida pode ser facilmente confirmado por inspeção visual de branqueamento pálida dos lobos isquêmicos. Em contraste, a mudança de cor imediatamente desaparece quando os pesos de suspensão são libertadas a partir dos pólos e do fígado é reperfundido. Este modelo de isquemia parcial hepática evita congestionamento mesentérica, preservando bloofluxo d para os lobos do fígado direito.
- Substituir o intestino para a cavidade abdominal. Mantenha o fígado e intestino quente com um cotonete úmido embebido em água a 37,0 ° C. Além disso para manter a temperatura corporal estável cobrir os ratinhos com o envoltório de alimentos comercialmente disponível depois de terminar a cirurgia.
- Execute isquemia, conforme exigido por protocolo experimental. Depois de um lançamento definida isquemia tempo os pesos e reperfusão dos lobos hepáticos médio e esquerdo começará imediatamente. Esta técnica permite a produção de isquemia reversível em ratinhos. Se não houver tempo de isquemia mais será realizado cuidadosamente remover a sutura.
- Adicionar aproximadamente 400 ul de cloreto de sódio para a cavidade abdominal 15 minutos antes e imediatamente após a reperfusão. Continuar a substituir fluido a cada 30 minutos, numa quantidade de 100 ul para compensar a perda de fluido durante o tempo de reperfusão.
- Para os experimentos de sobrevivência da ferida cirúrgica é fechada com sutura contínua da parede muscular e da pele with uma sutura 4/0.
3. Alterações na perfusão de fígado
Os parâmetros de resultados a seguir são recomendados para determinar fígado isquemia hepática seguinte:
Determinar as enzimas hepáticas (por exemplo, ALT, AST) e histologia hepática (coloração H & E) de isquemia e reperfusão hepática seguinte 3,9.
A Figura 1 Modelo de uma suspensão do sistema de peso-para isquemia do fígado:. Um sistema de suspensão de peso foi estabelecida para induzir isquemia do fígado do lobo esquerdo e mediana 3. (A) Por conseguinte lobo caudado e direita foram cuidadosamente separadas do lobo esquerdo. O lobo direito foi, então, ligeiramente deslocado para ver claramente a tríade portal acima da bifurcação da direita, lobos mediano e esquerdo. Uma sutura de nylon 8,0 foi colocada sob a tríade hepático esquerdo. (B) No final de cada sutura um peso pequeno (3 g Eppendorf TUbes cheio com água) foi ligado e aplicada. Isquemia hepática é visível por uma mudança de cor do lobo esquerdo e mediana de vermelho para pálido. Este projeto experimental permite a oclusão precisa e reperfusão da tríade hepática esquerda, aplicando e liberando a carga de peso.
Figura 2. Efeito de diferentes tempos de isquemia do fígado em alanina (ALT) e aspartato (AST) aminotransferase em ratinhos. Parcial portal isquemia tríade foi induzida como indicado (0 - 60 min de isquemia). Após 2 horas de reperfusão, ALT (A) e AST (B) foram medidos. Os resultados são expressos como médias ± SE de 6 a 7 ratos / grupo. * P <0,05 comparado com 0 min de isquemia (sham controle).
Discussion
O presente estudo descreve uma técnica de realização de isquemia num modelo murino, utilizando uma suspensão do sistema de peso para a oclusão da esquerda tríade hepática portal. Embora seja um método fácil para aprender as armadilhas que se seguem devem ser tidos em conta. Um erro muito comum no início é um ponto de profundidade, que inclui a tríade portal e da veia cava. A taxa de respiração e de coração irá abrandar no prazo de 15 minutos, devido ao aumento da resistência e da diminuição no retorno do sangue ao coração, resultando em morte precoce um dos ratinhos. A melhor maneira de impedir que o incluindo da veia cava é localizar a veia cava antes do ponto mantendo os lobos direito para baixo com um fórceps. Outra questão importante é que os pesos não são pesados o que pode resultar em muito estresse sobre o julgamento portal esquerda e direita que também interrompe o fluxo sanguíneo para os lobos direito. Por conseguinte, a quantidade de água na frascos Eppendorf deve ser ajustada para o peso do rato eo sdetentores RÓXIMOS deve ser colocada distalmente a partir da localização do ponto. No lado oposto, se os pesos são a baixa pressão sanguínea não é completamente interrompido. Ambos os erros são facilmente detectáveis por uma mudança de cor adicional para pálido do lobo direito ou mudança de cor insuficiente dos lobos mediano e esquerdo, respectivamente. Por conseguinte, a mudança de cor hepática após a aplicação dos pesos deve ser controlada a cada 10 minutos. Outra complicação comum cirúrgica é o ferindo do fígado com a agulha. Por conseguinte, os lobos direito deve ser mantido para baixo com um fórceps brandas de modo que a ponta da agulha pode ser facilmente vistos e tomado com um suporte de agulha. Se estas armadilhas no início são tidos em conta a suspensão do sistema de peso-para isquemia hepática fornece uma lesão altamente reprodutível devido à isquemia, minimizando a variabilidade de danos no fígado associado com aperto da tríade portal. Ao utilizar uma suspensão do sistema de peso, a tríade portal é apenas manipulado uma vez ao longo de todoprocedimento cirúrgico, causando significativamente menos danos para os lobos hepáticos. Além disso, nenhum congestão hepática ou intestinal ocorre com esta técnica. Trauma mais tecido ocorre por remoção e substituição de braçadeiras de navios, especialmente com reaplicação do grampo durante os ciclos de isquemia múltiplos como durante o pré-condicionamento isquêmico. O uso de pesos que são penduradas em um local remoto a partir do tecido do fígado, de acordo com as nossas observações, proporciona a vantagem de oclusão fiável, evitando trauma dos tecidos devido à manipulação dos lobos hepáticos por reaplicação de uma braçadeira. Tomados em conjunto, o presente estudo fornece viabilidade do sistema de enforcamento peso para oclusão da tríade portal durante a isquemia, minimizando a variabilidade e limitações associadas com aperto. Assim, esta técnica pode ser de interesse para outros pesquisadores que consideram estudando isquemia hepática.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os estudos atuais foram apoiadas pela United States National Institutes of Health concessão R01-HL092188, R01-DK083385 e R01HL098294, e Fundação para a Educação Anestesia e Pesquisa (FAER) Dá para HKE e um DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Bolsa de Investigação (GR2121/1- 1) e American Heart Association Grant para AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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