Summary
Мы создали новый мышиной модели висит вес системы портала триада окклюзии. Этот метод может быть полезным для будущих исследований ишемии в мышиной модели печени.
Abstract
Острого поражения печени из-за ишемии может произойти в течение нескольких клинических процедур, например, трансплантация печени, резекция опухоли печени или травмы ремонта и может привести к печеночной недостаточности, который имеет высокую смертность 1-2. Поэтому исследованиях на мышах печеночной ишемии стали важной областью исследований, предоставляя возможность использовать фармакологических и генетических исследований 3-9. В частности, условный ткани мышей с конкретными удаление гена (CRE, FLOX системы) дают представление о роли белков, в частности, тканей 10-13. Из-за технических трудностей связанных с ручным зажимным портал триады у мышей, мы провели систематическую оценку использовании висячей вес системы портала триада окклюзии, которое было описано выше 3. При использовании висячей вес системы мы размещаем шва вокруг левой ветви портал триады, не вызывая повреждения печеночных долек, так иЗажимы лучших доступных может привести к повреждению ткани печени из-за близкого расположения ткани печени к сосудам. Кроме того, правая ветвь печеночной триаде еще озарен таким образом, не возникает перегрузка кишечного с этой техникой, как приток крови к правой печеночной доли сохраняется. Кроме того, портал триады только один раз манипулировали на протяжении всего хирургического вмешательства. В результате процедуры, как предварительной подготовки, с короткими время ишемии и реперфузии, могут быть легко выполнены. Систематическая оценка этой модели, выполняя различные ишемии и реперфузии раз показали тесную взаимосвязь печени время ишемии с повреждением печени, как измеряется аланин (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) аминотрансфераз сыворотки 3,9. Взятые вместе, эти исследования подтверждают, высокая воспроизводимость поражения печени при использовании висячей вес системы ишемии печени и прерывистый реперфузии. Таким образом, этот метод может оказаться полезным для других интересов исследователейред в печени ишемии исследования на мышах. Поэтому видеоклип содержит подробный, шаг за шагом описание этой техники.
Protocol
Общие замечания. Все операции должны проводиться в вертикальном рассечения микроскопа (Leica) и с помощью хирургического коагулятора. Мышей в экспериментальных и мнимого групп должны соответствовать возрасту и весу для обеспечения сопоставимости результатов. Температура, давление крови, анестезии и жидкости администрации должна быть стабильной и контролируется в течение всего эксперимента.
1. Анестезия и хирургия
- C57BL / 6 должны быть в возрасте от 10 до 16 недель, и они должны быть соответствующего пола в соответствующих группах.
- Обезболить мышей с фенобарбиталом натрия (70 мг / кг массы тела внутрибрюшинно) и поддержания анестезии с ок. 10 мг / кг / ч пентобарбитала натрия. Передозировка может привести к значительному снижению артериального давления и, следовательно, могут изменить результаты.
- Место мыши на контролируемой температурой нагретого таблицы (РТ, Эффенберг, Мюнхен, Германия) с ректальный зонд термометра подключен к тепловой обратной связиКонтроллер для поддержания температуры тела на 37 ° C.
- Место мышей в положении лежа на операции стол, верхних и нижних конечностей крепится к столу со съемной кассеты.
- В случае выживания экспериментов соответствующих асептических методов, включая отсечение волос, дезинфекция кожи с йодофоры (например, Бетадин), стерильная обработка автоклавного инструментов, с использованием масок и стерильные перчатки для хирурга не требуется.
2. Портал Триада Occlusion
- Обложка области разреза с минеральным маслом, чтобы предотвратить вдыхание мыши волосы обрезать кожу и тем самым предотвращая риск аллергии мыши волос. Выполните срединной лапаротомии и разрез белой линии до верхнего конца, так что вы можете легко выявить печени. Если возможно выполнить разрез с коагуляции электрод (Эрбе, ICC50, Тюбинген, Германия), чтобы предотвратить кровотечение.
- Поместите нагревательный стол с помощью мыши в позицию, что хвост направленииТед к хирургу. Эта позиция предоставляет наилучшие условия для локализации триады и поставить шва.
- Свернуть кишечник с правой стороны с помощью мокрой шваброй кончик хлопком разоблачить портал триады.
- Немного сместить средней и левой доли по отношению к диафрагме и правой доле на кишечнике. Это даст вам четкое представление о портале триада выше бифуркации права, медиана / левой долями.
- Внимательно осмотрите портал триады и удерживайте нажатой правую долю мягко вниз с мягким пинцетом. Это даст вам прекрасный вид на левый триада портала.
- Как только визуально определить место иглы для наложения швов (7/0 нейлоновый шов, Ethicon, Нордерштедт, Германия) через иглу держателя под левой портал триады, в том числе печеночной артерии, печеночной вены и желчного протока с левой на правую сторону мыши.
- Стежка должна быть тесно в рамках триады. Более глубокий шов может повредить полой Вака уступает которая находится подтриады. Поэтому оставляют за собой право долей печени вниз, щипцы для определения полой вены перед размещением стежка.
- Возьмите кончик иглы на правой стороне с пинцетом и потянуть его осторожно из области печени, не повредив печень.
- Прикрепите к каждому концу шва трубы Эппендорф (около 3 г, наполненной водой) и поместите оба шва на шов заканчивается владельцев. Поместите шва держатель дистальнее шов, чтобы шов не препятствовать осуществлению прав триады.
- Применяя веса триады будет немедленно окклюзии, вызывая прекращение кровоснабжения левой и средней долей печени. Успешное окклюзия может быть легко подтверждено путем визуального осмотра бледно побледнение ишемической долей. С другой стороны, изменение цвета сразу же исчезает, когда висит веса освобождаются от полюсов и печень reperfused. Эта модель частичного ишемии печеночной избежать заторов брыжеечных, сохраняя Blooг потока справа доли печени.
- Замените кишечника в брюшную полость. Держите печени и кишечника теплым мокрым тампоном, смоченным в воде при температуре 37,0 ° С. Кроме того, держать температуру тела стабильного покрытия мышей с помощью коммерчески доступных пищевой пленкой после окончания операции.
- Выполните ишемии при необходимости в протоколе исследования. После определенного времени выпуска ишемии веса и реперфузии средней и левой доли печени начнется немедленно. Эта техника позволяет производить обратимое ишемия у мышей. Если нет дальнейшего раз ишемии будет осуществляться осторожно удалите шва.
- Добавить 400 мкл хлорида натрия в брюшную полость 15 минут до и непосредственно после реперфузии. Продолжайте заменять жидкости каждые 30 минут в размере 100 мкл, чтобы компенсировать потери жидкости во время реперфузии времени.
- Для выживания экспериментов в области операционной раны закрывают непрерывным швом мышц стенки и кожу шм 4/0 шва.
3. Изменения в печени перфузии
Следующие параметры результата рекомендуется определять повреждения печени вследствие ишемии печеночной:
Определение ферментов печени (например, АЛТ, АСТ) и гистологии печени (H & E окрашивание) после ишемии и реперфузии печени 3,9.
Рисунок 1 Модель висячей вес системы печени ишемии. Висит масса была создана система, чтобы вызвать печень ишемия левой и средней доли 3. () Таким образом, хвостатых и правой доли были аккуратно отделить от левой доли. Правой доли был тогда немного сдвинута четко просмотреть портал триады выше бифуркации правой, средней и левой долями. 8,0 нейлоновый шов был помещен под левую триаду печени. (B) в конце каждого шва малый вес (3 г Эппендорф туБес наполненный водой) был присоединен и применяются. Печеночная ишемии видно по изменению цвета на левой и средней доле от красного до светло. Этот экспериментальный дизайн позволяет точно окклюзии и реперфузии левой печеночных триад, применяя и освобождение вес груза.
Рисунок 2. Влияние разное время ишемии печени на аланин (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) аминотрансфераз у мышей. Частично портал триады ишемии вызывали, как указано (0 - 60 мин ишемии). Через 2 часа реперфузии, ALT (A) и АСТ (б) были измерены. Результаты представлены как среднее ± SE 6 - 7 мышей / группу. * P <0,05 по сравнению с 0 мин ишемии (фиктивный контроль).
Discussion
В настоящем исследовании описывается методика проведения ишемии в мышиной модели с помощью висячей вес системы окклюзии левой печеночной триаде портала. Хотя это и простой способ научиться следующим ловушки должны быть приняты во внимание. Очень распространенная ошибка в начале глубокая стежка которая включает в себя портал триады и полой вены. Дыхание и сердечный ритм замедляется в течение 15 минут в связи с увеличением сопротивления и снижение возвращения крови к сердцу в результате преждевременной смерти мышей. Лучший способ предотвратить в том числе полой вены локализовать полой вены до стежка, удерживая правую доли вниз с щипцами. Другим важным вопросом является то, что веса не тяжелый, который может привести к слишком большой стресс на левой и правой портал суда, который также останавливает приток крови к правой доли. Таким образом, количество воды в Эппендорф флаконы должны быть скорректированы с весом мыши и сuture владельцы должны быть размещены снаружи от стежка месте. Напротив, если веса на низкое кровяное давление полностью не остановился. Обе ошибки легко обнаруживаются с помощью дополнительного изменения цвета бледного правой доли или недостаточное изменение цвета средней и левой долями, соответственно. Поэтому изменение цвета печеночной после применения весов следует контролировать каждые 10 минут. Другим распространенным осложнением является хирургическое ранения печени с иглой. Таким образом, право доли, необходимо зафиксировать с мягким пинцетом так, чтобы кончик иглы можно легко увидеть и взять с собой иглодержатель. Если этих ошибок в начале учитывается вес висячей системы печеночной ишемии обеспечивает высокую воспроизводимых травмы в результате ишемии, минимизируя изменчивость печени связано с зажимом портал триады. При использовании висячей вес системы, портал триады только один раз манипулировали на протяжении всегохирургической процедуры, в результате чего значительно меньше повреждений печеночных долек. Кроме того, не печени или кишечной застой происходит с этой техникой. Более ткани травмы происходит за счет удаления и замены судна зажимы, особенно с повторным зажим в течение нескольких циклов ишемии, как во время ишемического прекондиционирования. Использование подвесных весов, которые находятся в удаленном от ткани печени, по нашим наблюдениям, обеспечивает преимущества надежной окклюзии, предотвращая травмы тканей за счет манипуляций с долей печени по повторным зажимом. Взятые вместе, настоящее исследование дает возможность висячей вес системы портала триада окклюзии при ишемии, сводя к минимуму изменчивости и ограничений, связанных с зажима. Таким образом, эта методика может представлять интерес для других исследователей, которые считают изучение печеночной ишемии.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Настоящие исследования были поддержаны США Национальных Институтов Здоровья грант R01-HL092188, R01-DK083385 и R01HL098294 и Фонда образования Анестезия и исследований (FAER) предоставляет HKE и DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) исследовательский грант (GR2121/1- 1) и Американской ассоциации сердца Грант AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Rook, M., Rand, E. Predictors of long-term outcome after liver transplant. Curr. Opin. Organ. Transplant. 16, 499-504 (2011).
- Henrion, J. Ischemia/reperfusion injury of the liver: pathophysiologic hypotheses and potential relevance to human hypoxic hepatitis. Acta. Gastroenterol. Belg. 63, 336-347 (2000).
- Hart, M. L., Much, C., Kohler, D. Use of a hanging-weight system for liver ischemic preconditioning in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 294, 1431-1440 (2008).
- Schneider, M., Geyte, K., Fraisl, P. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 138, 1143-1154 (2010).
- Coriat, R., Leconte, M., Kavian, N. Mangafodipir Protects against Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury in Mice. PLoS One. 6, e27005 (2011).
- Sakai, N., Van Sweringen, H. L., Schuster, R. Receptor activator of NF-kappaB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. , (2011).
- Zhang, J., Hu, W., Xing, W. The Protective Role of CD59 and Pathogenic Role of Complement in Hepatic Ischemia and Reperfusion Injury. Am. J. Pathol. 179, 2876-2884 (2011).
- Beldi, G., Banz, Y., Kroemer, A. Deletion of CD39 on natural killer cells attenuates hepatic ischemia/reperfusion injury in mice. Hepatology. 51, 1702-1711 (2010).
- Hart, M. L., Much, C., Gorzolla, I. C. Extracellular adenosine production by ecto-5'-nucleotidase protects during murine hepatic ischemic preconditioning. Gastroenterology. 135, 1739-1750 (2008).
- Beraza, N., Ludde, T., Assmus, U., Roskams, T., Vander Borght, S., Trautwein, C. Hepatocyte-specific IKK gamma/NEMO expression determines the degree of liver injury. Gastroenterology. 132, 2504-2517 (2007).
- Lentsch, A. B. Activation and function of hepatocyte NF-kappaB in postischemic liver injury. Hepatology. 42, 216-218 (2005).
- Luedde, T., Assmus, U., Wustefeld, T. Deletion of IKK2 in hepatocytes does not sensitize these cells to TNF-induced apoptosis but protects from ischemia/reperfusion injury. J. Clin. Invest. 115, 849-859 (2005).
- Kapitsinou, P. P., Liu, Q., Unger, T. L. Hepatic HIF-2 regulates erythropoietic responses to hypoxia in renal anemia. Blood. , (2010).
