Summary
Hemos establecido un nuevo modelo murino de un sistema de peso que cuelga de la oclusión de la tríada portal. Esta técnica puede ser útil para futuras investigaciones en modelos de isquemia hepáticas de ratón.
Abstract
Lesión hepática aguda debido a la isquemia puede ocurrir durante varios procedimientos clínicos de trasplante hepático, por ejemplo, la resección del tumor hepático o reparación de trauma y puede resultar en insuficiencia hepática que tiene una alta tasa de mortalidad 1-2. Por lo tanto los estudios murinos de isquemia hepática se han convertido en un importante campo de la investigación, proporcionando la oportunidad de utilizar los estudios farmacológicos y genéticos 3.9. En concreto, los ratones condicionales con la eliminación específica de tejido de un gen (CRE, flox sistema) proporciona una visión de la función de las proteínas en tejidos específicos 10-13. Debido a la dificultad técnica asociada con manual de sujeción de la tríada portal en ratones, se realizó una evaluación sistemática mediante un sistema de suspensión de peso para el portal de la oclusión tríada que se ha descrito previamente 3. Mediante el uso de un sistema de suspensión de peso que colocar una sutura alrededor de la rama izquierda de la tríada portal sin causar ningún daño a los lóbulos hepáticos, ya que también lamejores abrazaderas disponibles puede causar daño hepático del tejido debido a la cercanía de tejido hepático para los vasos. Además, la rama derecha de la tríada hepática todavía se perfundieron tanto, no se produce congestión intestinal con esta técnica como el flujo de sangre a los lóbulos hepáticos derecho se conserva. Por otra parte, la tríada portal es manipula solamente una vez durante todo el procedimiento quirúrgico. Como resultado, los procedimientos como pre-acondicionamiento, con tiempos cortos de isquemia y reperfusión, se pueden realizar fácilmente. La evaluación sistemática de este modelo mediante la realización de la isquemia diferente y los tiempos de reperfusión reveló una correlación estrecha del tiempo de isquemia hepática con daño hepático, medido por la alanina (ALT) y aspartato (AST), los niveles séricos de aminotransferasas 3,9. En conjunto, estos estudios confirman la lesión hepática altamente reproducible cuando se utiliza el sistema de suspensión-el peso de la isquemia y la reperfusión hepática intermitente. Así, esta técnica podría ser útil para el interés de otros investigadoresdisfunción eréctil en los estudios de isquemia del hígado en ratones. Por lo tanto el clip de vídeo ofrece un detallado paso a paso la descripción de esta técnica.
Protocol
Observaciones generales. Todas las operaciones deben llevarse a cabo bajo un microscopio vertical de disección (Leica) y utilizando un coagulador quirúrgico. Los ratones en los grupos experimentales y de simulación debe ser equiparado en edad y peso para asegurar la comparabilidad de los resultados. La administración de la temperatura, la presión arterial, la anestesia y el líquido debe ser estable y controlado durante todo el experimento.
1. Anestesia y Cirugía
- Ratones C57BL / 6 debe estar dentro de un rango de edad de 10 a 16 semanas y debe ser acompañado de género en los grupos respectivos.
- Anestesie ratones con pentobarbital sódico (70 mg / kg de peso corporal ip) y mantener la anestesia con aprox. 10 mg / kg / h pentobarbital sódico. La sobredosis puede reducir significativamente la presión arterial y por lo tanto puede alterar los resultados.
- Los ratones, colóquelas sobre una mesa calentada a temperatura controlada (temperatura ambiente, Effenberg, Munich, Alemania) con un termómetro rectal, unida a una reacción térmicacontrolador para mantener la temperatura corporal a 37 º C.
- Los ratones y colóquelos en una posición supina sobre la mesa de cirugía, con las extremidades superiores e inferiores unidas a la mesa con cinta extraíble.
- En el caso de los experimentos de supervivencia de técnicas adecuadas de asepsia, incluyendo el recorte de cabello, la desinfección de la piel con los yodóforos (Betadine, por ejemplo), la manipulación estéril de instrumentos esterilizados en autoclave, y usando máscaras de unos guantes estériles para el cirujano son obligatorios.
2. La oclusión de la tríada portal
- Cubra el área de la incisión con aceite mineral para evitar la inhalación de pelo de ratón por el corte de la piel y previniendo así el riesgo de alergias del pelo del ratón. Realizar laparotomía media y la incisión de la línea alba hasta el extremo superior de modo que usted puede exponer el hígado. Si es posible realizar la incisión con un electrodo de coagulación (Erbe, ICC50, Tuebingen, Alemania) para prevenir el sangrado.
- Coloque la tabla de calefacción con el ratón en una posición que la cola es de direcciónTed para el cirujano. Esa posición te ofrece la mejor configuración para la localización de la tríada y colocar la sutura.
- Desplazar el intestino en el lado derecho utilizando un hisopo de algodón húmedo para exponer la punta de la tríada portal.
- Un poco cambiar el lóbulo medio e izquierdo hacia el diafragma y el lóbulo derecho hacia el intestino. Eso le dará una visión clara de la tríada portal por encima de la bifurcación de la derecha, mediana / izquierda lóbulos.
- Inspeccione cuidadosamente la tríada portal y sostenga el lóbulo derecho suavemente con unas pinzas suaves. Eso le dará una bonita vista de la tríada portal de la izquierda.
- Una vez identificado visualmente a colocar la aguja con el hilo de sutura (sutura de 7/0 nylon; Ethicon, Norderstedt, Alemania) a través de un soporte de la aguja en el lado izquierdo tríada portal, incluyendo la arteria hepática, la vena hepática, y el conducto biliar de la izquierda a la derecha del ratón.
- La puntada tiene que estar estrechamente con la tríada. Un punto más profundo puede lesionar la vena vaca inferior que se encuentra bajola tríada. Por lo tanto mantener los lóbulos hepáticos derecho hacia abajo con las pinzas para identificar la vena cava antes de colocar la puntada.
- Tome la punta de la aguja en el lado derecho con una pinza y tire suavemente de la zona del hígado, sin lesionar el hígado.
- Adjunte a cada extremo de la sutura un tubo Eppendorf (aproximadamente 3 g, llena de agua) y colocar ambos extremos de sutura sobre los titulares de sutura. Coloque el soporte de sutura distal de la puntada para que la sutura no interfiere con la tríada derecha.
- Mediante la aplicación de las ponderaciones de la tríada será inmediatamente obstruida, provocando la interrupción del suministro de sangre a los lóbulos izquierdo y la mediana del hígado. El éxito de la oclusión puede ser fácilmente confirmado por la inspección visual de la palidez pálido de los lóbulos isquémicos. En contraste, el cambio de color desaparece inmediatamente cuando los pesos colgantes son liberados de los polos y el hígado se reperfundido. Este modelo de isquemia parcial hepática mesentérica evita la congestión mediante la preservación de Blood flujo de los lóbulos hepáticos derecho.
- Vuelva a colocar el intestino en la cavidad abdominal. Mantener el hígado y el intestino tibia con una esponja húmeda empapada con agua a 37.0 ° C. Además de mantener una temperatura corporal estable de cubrir los ratones con una envoltura de los alimentos disponibles en el mercado después de terminar la cirugía.
- Realizar la isquemia como se requiere según el protocolo experimental. Después de un comunicado de la isquemia de tiempo definido los pesos y la reperfusión de los lóbulos del hígado la mediana y la izquierda se iniciará inmediatamente. Esta técnica permite la producción de isquemia reversible en ratones. Si no hay tiempos de isquemia más se llevará a cabo retirar con cuidado el hilo de sutura.
- Añadir aproximadamente 400 l de cloruro sódico en la cavidad abdominal 15 minutos antes y directamente después de la reperfusión. Continuar para sustituir el líquido cada 30 minutos en una cantidad de 100 l para compensar la pérdida de fluido durante el tiempo de reperfusión.
- Para los experimentos de supervivencia de la herida quirúrgica se cierra con sutura continua de la pared muscular y wi pielª una sutura 4/0.
3. Los cambios en la perfusión del hígado
Los parámetros de resultados se recomienda lo siguiente para determinar isquemia hepática daño hepático siguiente:
Determinar las enzimas hepáticas (por ejemplo, ALT, AST) y la histología hepática (tinción H & E) isquemia hepática siguiente y reperfusión 3,9.
Figura 1 Modelo de un sistema de suspensión-el peso de la isquemia hepática. Un sistema de peso que cuelga se ha establecido para inducir isquemia hepática del lóbulo izquierdo y la mediana de tres. (A) Por lo tanto el lóbulo caudado y el derecho se separaron suavemente del lóbulo izquierdo. El lóbulo derecho estaba ligeramente desplazado a continuación para ver con claridad la tríada portal encima de la bifurcación de los lóbulos derecho e izquierdo, la mediana. Una sutura de nylon 8,0 se colocó bajo la tríada hepática izquierda. (B) al final de cada sutura un peso pequeño (3 g Eppendorf tuBES llenos de agua) se adjunta y aplicada. Isquemia hepática es visible por un cambio de color del lóbulo izquierdo y la mediana de rojo a amarillo pálido. Este diseño experimental permite la oclusión precisa y reperfusión de la tríada hepática izquierda por la aplicación y liberación de la carga de peso.
Figura 2. Efecto de diferentes tiempos de isquemia en el hígado alanina (ALT) y aspartato (AST) aminotransferasa en ratones. Parcial portal de la isquemia se indujo la tríada como se indica (0 - 60 min de isquemia). Después de 2 h de la reperfusión, ALT (A) y AST (B) se midieron. Los resultados se expresan como media ± SE de 6 a 7 ratones / grupo. * P <0,05 en comparación con isquemia min 0 (control simulado).
Discussion
El presente estudio describe una técnica de realización de la isquemia en un modelo murino utilizando un sistema de suspensión de peso para la oclusión de la tríada portal hepático izquierdo. Aunque es un método fácil de aprender las trampas siguientes deben ser tenidas en cuenta. Un error muy común al principio es un punto de profundidad que incluye la tríada portal y la vena cava. La tasa de respiración y el corazón se ralentizará un plazo de 15 minutos debido a la mayor resistencia y la disminución de devolver la sangre al corazón que resulta en una temprana muerte de los ratones. La mejor manera de prevenir la introducción de asignaturas de la vena cava es localizar la vena cava antes de la puntada a la celebración de los lóbulos derecho hacia abajo con unas pinzas. Otra cuestión importante es que los pesos no son de pesado que puede dar lugar a demasiada tensión en el juicio portal de izquierda y derecha que también detiene el flujo sanguíneo en los lóbulos derecho. Por lo tanto la cantidad de agua en los viales de Eppendorf debe ajustarse al peso del ratón y la stitulares UTURO debe colocarse distalmente desde la ubicación de puntada. Por el contrario, si los pesos son de la presión arterial no se haya detenido por completo. Ambos errores son fácilmente detectables por un cambio de color pálido, adicional a la del lóbulo derecho o el cambio de color insuficiente de los lóbulos medios e izquierdo, respectivamente. Por lo tanto el cambio de color hepática tras la aplicación de los pesos debe ser controlada cada 10 minutos. Otra complicación quirúrgica común es las heridas sufridas por el hígado con la aguja. Por lo tanto los lóbulos derecho debe ser mantenido con un fórceps suaves de modo que la punta de la aguja puede ser fácilmente visto y tomada con un soporte de aguja. Si estas trampas en el comienzo se tienen en cuenta el sistema de suspensión de peso para la isquemia hepática proporciona una lesión altamente reproducibles debido a la isquemia, reduciendo al mínimo la variabilidad de daño hepático asociado con sujeción de la tríada portal. Mediante el uso de un sistema de suspensión de peso, la tríada portal es manipula solamente una vez en toda laprocedimiento quirúrgico, causando daños significativamente menor a los lóbulos hepáticos. Además, ninguna de congestión hepática o intestinal se produce con esta técnica. Más traumatismo de los tejidos se produce mediante la eliminación y la sustitución de las abrazaderas de los buques, sobre todo con una nueva aplicación de la pinza durante los ciclos de isquemia múltiples, como en el precondicionamiento isquémico. El uso de colgar pesos que esté en un lugar alejado del tejido hepático, de acuerdo con nuestras observaciones, proporciona la ventaja de oclusión fiable al tiempo que evita el trauma del tejido debido a la manipulación de los lóbulos del hígado de la reaplicación de una abrazadera. En conjunto, el presente estudio proporciona la viabilidad del sistema de suspensión-el peso de la oclusión de la tríada portal durante la isquemia, reduciendo al mínimo la variabilidad y las limitaciones asociadas con la sujeción. Así, esta técnica podría ser de interés para otros investigadores que consideran que el estudio de la isquemia hepática.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
En el presente estudio fueron apoyadas por los Estados Unidos Institutos Nacionales de Salud de subvención R01-HL092188, R01-DK083385 y R01HL098294, y la Fundación para la Educación e Investigación de Anestesia (FAER) otorga a HKE y DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) Becas de Investigación (GR2121/1- 1) y la Asociación Americana del Corazón Grant AG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Pentobarbital (Fatal Plus) | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | V.P.L. 9372 | 4 mg/mL in saline |
| Suture, Prolene 8.0 | Ethicon, USA | M8739 | reusable |
| dissecting microscope | Leica | n/a | consider generous working distance |
| Heating Table | Rt, Effenberger, Germany | n/a | only and single provider |
| Surgical instruments | WPI, Dumont | Forceps, needle holder | |
| Coagulator | Erbe, ICC50, Tuebingen, Germany | n/a | Different providers of coagulators |
Table 1. Specific reagents and equipment. |
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