Summary
ويرد تقنية لأداء المجهري intravital من العقدة الليمفاوية الأربية (LN). هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي ،
Abstract
الغدد الليمفاوية (LN) ، وتقع في جميع أنحاء الجسم ، هي جزء لا يتجزأ من الجهاز المناعي. انهم بمثابة موقع لتحريض الاستجابة المناعية التكيفية ، وبالتالي ، وتطوير الخلايا المستجيب. على هذا النحو ، LNS هي المفتاح لمحاربة الجراثيم الغازية والحفاظ على الصحة. وأملت اختيار LN للدراسة والوصول النموذج المطلوب ، ويقع كذلك في العقدة الليمفاوية الأربية ، وتدعم دراسات بسهولة من النماذج ذات الصلة بيولوجيا من الجلد والالتهابات المخاطية التناسلية.
وLN الأربية ، شأنها شأن جميع LNS ، لديه شبكة واسعة الاوعية الدموية الدقيقة إمداده بالدم. بشكل عام ، وهذا يشمل شبكة الاوعية الدموية الدقيقة شرين الوجبة الرئيسية للLN أن فروع في وقت لاحق والأعلاف الوريدات البطانية عالية (HEVs). HEVs متخصصة لتسهيل الاتجار الخلايا المناعية في LN خلال التوازن على حد سواء والعدوى. كيف HEVs تنظيم الاتجار في LN تحت كل هذه الظروف هو مجال التنقيب المكثفة. تغذية LN شرين ، لها تأثير مباشر على المنبع وHEVs هو الإمداد الرئيسي للمواد الغذائية والدم الغني الخلية في LN. وعلاوة على ذلك ، فإن التغييرات في تورط شرين الأعلاف في تسهيل تحريض الاستجابة المناعية التكيفية. وmicrovasculature LN له أهمية واضحة في الحفاظ على تدفق الدم إلى LN الأمثل وتنظيم تدفق الخلايا المناعية في LN ، والتي هي عناصر حاسمة في وظيفة LN السليم والاستجابة المناعية لاحقا.
القدرة على دراسة microvasculature LN في الجسم الحي هو المفتاح لتوضيح كيف يمكن لنظام المناعة وmicrovasculature تتفاعل وتؤثر على بعضها البعض داخل LN. هنا ، نقدم طريقة لتصوير في الجسم الحي من العقدة الليمفاوية الأربية. ونحن نركز على التصوير من microvasculature من LN ، مع إيلاء اهتمام خاص للطرق التي تضمن دراسة السفن صحية ، والقدرة على الحفاظ على التصوير من السفن قادرة على البقاء على مدى عدة ساعات ، والكمي لحجم السفينة. وتعرض أيضا أساليب لنضح من microvasculature بالأدوية فعال في الأوعية وكذلك القدرة على تتبع وقياس حركة المرور الخلوية.
Intravital المجهري للLN الأربية يسمح بتقييم وظائف الاوعية الدموية الدقيقة مباشرة في الوقت الحقيقي واجهة من واجهة مباشرة بين الخلايا المناعية ، LN ، ودوران الأوعية الدقيقة لل. هذه التقنية القدرة على أن تكون جنبا إلى جنب مع العديد من التقنيات المناعية والخلايا نيون وضع العلامات وكذلك التلاعب بها كما لدراسة الأوعية الدموية من LNS الأخرى.
Protocol
1. تحضير كاشف
- وينبغي إعداد الكواشف لاستخدامها في كافة مراحل التجربة قبل البدء في بروتوكول الجراحية. علما بأن جميع الحلول باستخدام تقنية معقمة.
- يتم تحضير المحلول الملحي أفضل الفسيولوجية (PSS) في عنصرين هما : الأساسية محلول الملح والصوديوم بيكربونات الحل. يعد كل من الحلول في 20X تركيز وتخزين في 4 درجات مئوية. بيكربونات الصوديوم في 20X هو 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) والأساسية في محلول الملح هو تركيز 20X 2638.0mM كلوريد الصوديوم (58.44g/mol) ، 94.0mM بوكل (74.56g/mol) ، 40.0mM CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) ، و23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). وينبغي إعداد الحلول في DH 2 O والمواد الكيميائية ينبغي أن تضاف في وقت واحد وأثارت الحل واضح حتى قبل إضافة المواد الكيميائية المقبل
- 2L من إعداد جهاز الأمن الوقائي عن طريق تمييع كميات متساوية من بيكربونات الصوديوم والملح والحل الأساسي لتمييع تركيز 1X (لمدة 100ML تمييع 2L PSS من كل بيكربونات الصوديوم والملح في حل الأساسية درهم 2 O
- قارورة تحتوي على مكان الحجمي 2L جهاز الأمن الوقائي وجهاز الأمن الوقائي في حمام الماء 37 درجة مئوية. يوازن الحل مع 5 ٪ CO 2 / توازن غاز النيتروجين ل1hr قبل بدء العملية الجراحية.
- وتعد أفضل المواد الكيميائية فعال في الأوعية (مثل فينيليفرين ، أستيل كولين ، نتروبروسيد الصوديوم) بتركيز 1M في dH2O وتخزينها في 100μl aliquots في -20 درجة مئوية.
2. تحضير الحيوانات
- تحديد وزن الماوس وإدارة الجرعة الأولى من الصوديوم في بنتوباربيتال 90mg/kg عن طريق الحقن داخل الصفاق. في جميع أنحاء الإجراء هو مراقبة باستمرار الماوس للطائرة عن طريق التخدير قرصة أخمص قدميها ، ودراسة متأنية من معدل التنفس. وينبغي أن تدار من الصوديوم الحقن إضافية حسب الحاجة في بنتوباربيتال 20mg/kg للحفاظ على الطائرة التخدير. الحفاظ على الطائرة الجراحية للتخدير وفقا للوائح الفيدرالية والمؤسسية على النحو المبين في بروتوكول الرعاية الحيوانية التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان والاستخدام (لاعب) من جامعة ق الشمالية.
- إزالة الشعر من منطقة البطن والخاصرة / الورك بواسطة ماكينة حلاقة. إزالة الشعر المتبقي فضفاضة بمسحة الكحول والتربيت المنطقة مع الشريط. هذا يكفي لأن هذا الإجراء هو محطة تجريبية.
- ضع الماوس على متن الجراحية واضحة في موقف ضعيف وإرفاق الماوس إلى المجلس عن طريق تسجيل كل قاطع الطريق إلى المجلس. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عن طريق مصباح الحرارة الخارجية ورصدها عبر الحرارة المستقيم لضمان أن لا يحدث انخفاض حرارة الجسم نتيجة للمخدر.
3. الإجراءات الجراحية
- أثناء إجراء العمليات الجراحية لضمان كامل يتم الاحتفاظ دائما تتعرض الأنسجة superfused معايرتها مع حل PSS تحسنت. فمن المهم أيضا أن أبدا اجراء اتصالات مع الأوعية الدموية في المصالح مع الأدوات الجراحية أو تجرح السفن عن طريق وضع لإجبار الكثير منهم عن طريق التلاعب في الأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة من حولهم.
- مكان الماوس ضمن نطاق تشريح. جعل شق خط الوسط على طول السطح البطني من تجويف البطن وسحب الجلد نحو العمود الفقري الماوس.
- حالما يتم سحب الجلد بحيث LN مرئيا بسهولة ، دبوس الجلد على قاعدة التمثال من Sylgard شفافة 184.
- إزالة طبقة رقيقة من النسيج الضام تتراكب محيط LN
- مسح تتراكب الأنسجة الدهنية وتحيط العقدة الليمفاوية حتى ما يتعرض له سرير الاوعية الدموية الدقيقة. الجزء الرئيسي الشرياني يضع المتاخمة للLN وoverlayed عادة من الوريد. الجراحة كامل يستغرق حوالي 30 دقيقة.
4. التصوير والتحليل سفينة
- مرة واحدة يتعرض الجزء السفينة الفائدة في ظل نطاق تشريح ، وتأمين إعداد intravital على المجهر. علما أن الحيوان لا يزال على متن الجراحية واضحة في حين ان على intravital المجهر طوال فترة التجربة. المحافظة على درجة حرارة الجسم عن طريق مصباح الحرارة وقياس الحرارة عن طريق المستقيم كما هو موضح في القسم الجراحي. كما يتم رصد الطائرة التخدير في كافة مراحل التجربة كما هو موضح في القسم 2.1.
- إعداد superfusion وخطوط الامتصاص. Superfusion من PSS يحدث من قبل إطعام الجاذبية من خزان ، في خزان المياه الساخنة سترة (سترة هو تعميم الماء ويسخن قبل تعميم بالحمام المائي) يجري perfused النيتروجين بنسبة 5 ٪ CO 2 متوازنة ، وأسفل خط بالتنقيط بمعدل 10ML / دقيقة. وينبغي أن تستخدم خط الشفط على مواصلة سحب PSS superfused بعيدا عن الإعداد. علما أنه قبل هذه التجربة هي تنظيفها خطوط شفط مياه وسترة وتخزينها بعد كل تجربة. هذا يضمن العقم قبل التجربة المقبلة.
- فحص درجة حرارة PSS superfusing. ضبط درجة حرارةتعميم حمام ماء و / أو معدل superfusion PSS لتحقيق درجة حرارة 37 درجة مئوية ~ عبر التحضير.
- تسمح الأوعية الدموية لكي تتوازن مع PSS على الأقل 60 دقيقة ، وقياس قطره سفينة باستخدام الفرجار الفيديو. عادة ، ينبغي تحديد قطرها السفينة في نقاط متعددة (على سبيل المثال ، في 40 و 50 ، و 60 دقيقة) لضمان السفينة قد استقرت.
- تقييم الحالة الصحية للسفينة باستخدام ناهض العضلات الملساء محددة (مثل فينيليفرين ، PE) ، وناهض بطانة معينة (مثلا : الأستيل كولين ، ACH). وينبغي تعديل تركيز ناهض اعتمادا على ناهض ، ولكن لمنظمة العمل ضد الجوع PE ويجب أن يتم تقييم هذه السفينة على كل تركيز بإضافة التراكمي (10 - 5M ل9M - 10) لsuperfusate. يجب فصل كل تطبيق من قبل ناهض مرحلة غسل (عادة 30 دقيقة) باستخدام جهاز الأمن الوقائي حتى يعود إلى سفينة القطر يستريح.
- ويمكن إجراء التقييم التالي للصحة السفينة ، والمخدرات فعال في الأوعية اللاحقة ، ووضع العلامات الفلورسنت ، وخلية تتبع التجارب.
- بعد نهاية التجربة يتم إعطاء الحيوان جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال. ثم يتم رصد هذا الحيوان لضمان عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميها ، وعدم وجود حركة التنفس أو خفقان القلب. في مثل هذا الوقت ويتبع ذلك عن طريق خلع عنق الرحم.
5. ممثل النتائج :
بعد فترة إعداد موازنة ينبغي أن تسفر عن صورة واضحة تسمح لتحديد شرين على حد سواء والتي تزود الوريد العقدة الليمفاوية الأربية. يجب أن يكون هناك خلايا الدهنية المحيطة الحد الأدنى للسماح للسفن جدران الوريد شرين والتي يتعين مراعاتها بوضوح للالفرجار الفيديو لتكون لها الغلبة على حساب قطر السفينة. نقطة لا يتجزأ من الإعداد الناجح هو شرين ديها امدادات الدم الغني تتحرك من خلال تجويف وأن هناك درجة كبيرة من نغمة الأوعية الدموية (أي شرين لديه القدرة على vasoconstrict vasodilate لضمان سلاسة والعضلات ومنبهات محددة البطانية على التوالي) .
الشكل 1. Intravital صورة مجهرية من العقدة الليمفاوية الأربية شرين تغذية (السهم الأحمر) التغذية المتوازنة العقدة الليمفاوية مع محلول ملحي الفسيولوجية ويعمل جنبا الى جنب مع الوريد الرئيسي (السهم الأخضر).
الشكل 2. الاستجابة فعال في الأوعية عادي إلى فينيليفرين superfused (PE) بإضافة التراكمية إلى المالحة من تركيزات الفسيولوجية 10 -9 م الى 10 م -5 وجود قوي يوحي تضيق الأوعية العادية وظيفة العضلات الملساء الموجودة في شرين.
الشكل 3. استجابة فعال في الأوعية عادي إلى أستيل superfused (ACH) بإضافة التراكمية إلى المالحة من تركيزات الفسيولوجية 10 -9 م الى 10 م -5 وجود قوي يوحي توسع الأوعية العادية الحالية وظيفة بطانة الأوعية الدموية في شرين.
Discussion
المجهري Intravital من العقدة الليمفاوية الأربية المعروضة هنا يوفر القدرة على microvasculature صورة العقدة الليمفاوية في الجسم الحي ،. وهكذا ، فإنه وسيلة لتسهيل المراقبة المباشرة في الوقت الحقيقي. التصوير من microvasculature LN هو موقع الفريد الذي يسمح احد لدراسة العلاقة بين الاستجابة المناعية والأوعية الدموية و. باستخدام هذا الإعداد ، يمكن توجيه التركيز بشكل خاص على الاستجابة المناعية ، وتعديلات في الأوعية الدموية ، أو على التفاعل بين البلدين.
كما هو الحال مع جميع الأساليب التجريبية ، المجهري intravital القياسية على حد سواء مزايا وقيود. ويمكن بسهولة IVM القياسية ، مثل إعداد وصفها هنا ، يمكن تعديلها ، وثبت في السابق من قبل المؤلفين للسماح المجهري epifluorescent عبر إدخال التتبع الأصباغ الفلورية أو السكان الخلية المسمى. على الرغم من أن معيار IVM لا يعطي إمكانية التصوير ثلاثة الابعاد والتعقب مثل ستعطى من قبل اثنين من الفوتون المجهري أو تصوير الأوعية ، ويتحقق ما زالت تتبع خلية في بعدين السماح الخلية الى خلية والخلية إلى أن الأوعية الدموية التفاعل ولاحظ وكميا ، وبالتعاون مع الإدارة في الجسم الحي ، وتلطيخ لاحقة مع الأضداد الفلورسنت يمكن استخدامها لتقديم بيانات عن البروتين / علامة التعبير في الوقت الحقيقي.
خصوصا ، وتقنيات التصوير تتطلب بيئة بديلة للصور الثابتة ؛ لقط من منطقة العمليات الجراحية أو إضافة ساترة على إعداد شقة مطلوب بشكل متكرر. هذه الحدود ، إذا لم يحل ، والقدرة على يروي بنشاط وسطاء أو غيرها من الأوعية الدموية أكثر من إعداد لتقييم سلامة الأوعية الدموية وعلم وظائف الأعضاء أو غيرها في استخدام تقنيات أخرى مثل التجارب التي أجريت في إطار توسع الأوعية إعداد IVM. وعلاوة على ذلك ، ومعيار IVM لا تتطلب إعداد مسطح تماما والتي لا تتأثر الحركة ، مثل تلك التي تم إنشاؤها بواسطة التنفس من الحيوان. وهذا يسمح لاستخدامها IVM قياسية في مناطق أكثر الجراحية مع زيادة تكرارية. ويتجلى ذلك من خلال إعداد العقدة الليمفاوية الأربية الموصوفة هنا. نظرا لحجم وشكل العقدة الليمفاوية ، لا يمكن أن يتم إعداد شقة دون إصابة الأنسجة وموقع العقدة يثير الاقتراح كبيرة بسبب تنفس الحيوانات. ومثل هذه القضايا يكون من الصعب التغلب عليها عن طريق أساليب أخرى ، ولكن يتم التعامل بسهولة مع استخدام إعداد IVM القياسية وصفها.
باختصار ، يمكن الجمع بين إعداد المفصلة أعلاه مع أي عدد آخر من الكيمياء الحيوية ، والأوعية الدموية ، و / أو التقنيات المناعية مثل نقل أو مجموعات فرعية من تنشيط الخلايا المسمى ، تحريض نقص الأكسجين ، والإفراط في التعبير عن نفاد الوسطاء الأوعية الدموية. ومع ذلك ، تطبيقات إضافية تعتمد على الحالة الصحية للإعداد الأولي. لذا ، فمن الضروري دائما لاختبار صحة الأوعية الدموية التي يجري تصويرها وتقييمها. النقاط الرئيسية لتحقيق الصحة وإعداد ضمان perfused باستمرار مع إعداد PSS معايرتها في درجة حرارة الجسم والتقليل من الاتصال والتوتر وضعت على منطقة العمليات الجراحية أثناء الجراحة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة والمؤسسة الكندية للإبداع ، جامعة كولومبيا البريطانية مركز للبحوث وجامعة الدم قبل الميلاد الشمالية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
