Summary
一个执行的腹股沟淋巴结（LN），活体显微镜技术概述。这种技术可以实时，
Abstract
淋巴结（LN），位于整个身体，免疫系统的一个不可分割的组成部分。他们作为诱导适应性免疫应答的网站，因此，发展效应细胞。因此，LNS打击入侵的病原体，并保持健康的关键。 LN的选择研究是出于可访问性和所需的模型;以及位于腹股沟淋巴结和轻松地支持皮肤和生殖器黏膜感染的生物相关模型的研究。
腹股沟号法律公告，像所有的LNS，拥有广泛的微血管网络，提供血液。在一般情况下，这种微血管网络号法律公告，随后分支机构和饲料高内皮微静脉（HEV）的主要饲料动脉。混合动力汽车是专门用于促进在双方的动态平衡和感染免疫细胞的贩运到的LN。混合动力车如何调节这两种情况下的贩运到的LN是一个激烈的勘探领域。 LN饲料动脉，直接对混合动力汽车的上游影响，主要是营养和丰富的血细胞的LN的供应。此外，在饲料中动脉的变化有牵连在促进适应性免疫反应的诱导。号法律公告微血管，保持一个最佳的血液供应的LN和调节免疫细胞的大量涌入，这是正确的LN函数和随后的免疫反应中的关键要素进入LN的重要性显而易见。
号法律公告在体内的微血管的能力，研究阐明，免疫系统如何和微血管相互作用和影响的LN内的的关键。在这里，我们提出了一个在体内成像的腹股沟淋巴结方法。我们注重的LN微血管成像，要特别注意方法，确保健康血管的研究，保持可行的船只数量超过一个小时的成像能力，以及船只幅度量化。还介绍了灌注微血管与血管活性药物，以及潜在的跟踪和量化蜂窝流量的方法。
活体显微镜腹股沟号法律公告允许直接评价微血管功能和实时接口的免疫细胞之间的LN和微循环，的直接接口。这种技术的潜力结合，与许多免疫学技术和荧光细胞标记以及操纵研究其它LNS血管。
Protocol
1。试剂准备
- 在整个实验中使用的试剂应在开始手术协议前准备。请注意，所有的解决方案是采用无菌技术。
- 生理盐水溶液（PSS）是最好准备两部分组成：基本盐溶液和碳酸氢钠溶液。准备在这两种解决方案20X浓度和储存在4 ° C。碳酸氢钠在20X 360.0mM碳酸氢钠（84.01g/mol）和基本20X 浓度盐溶液94.0mM 2638.0mM氯化钠（58.44g/mol），氯化钾（74.56g/mol），40.0mM 氯化钙 •2H 2为O（147.02g/mol），并23.4mM硫酸镁4•7H 2 O（246.48g/mol）。应准备在DH 2 O和化学品的解决方案应补充一次，搅拌，直到解决方案之前加入未来的化学品
- 准备的PSS 2L等量的碳酸氢钠和基本盐溶液稀释，稀释至1X浓度（的PSS 2L每个碳酸氢钠和基本盐溶液稀释100毫升卫生署2
- 置于2L容量瓶在37℃水浴中含有PSS和PSS。 1小时前平衡的解决方案，以外科手术开始，用5％的CO 2 /平衡氮气。
- 血管活性化学物质（如苯肾上腺素，乙酰胆碱，硝普钠）是最好的准备1M浓度在dH2O和100μL分装储存于-20 ° C
2。动物的制备
- 确定鼠标的重量和管理的初始剂量的戊巴比妥钠腹腔注射每千克90毫克。整个过程中，鼠标不断监测麻醉通过脚趾捏和呼吸频率的仔细检查飞机。管理附加注射戊巴比妥钠20mg/kg维持麻醉平面的需要。手术的麻醉平面维持在联邦和机构法规的规定，动物护理和使用北卑诗大学（ACUC）委员会批准的协议动物保健概述。
- 删除从腹部和侧面/臀面积由剃须刀的头发。删除剩余的酒精棉签松散的头发，拍着用胶带面积。这是足够的，因为这样的实验过程是终端。
- 在仰卧位放置在一个明确的手术板鼠标和附加录音每个脚垫板鼠标板。保持体温是通过外部加热灯，并通过直肠温度计监测，以确保低温麻醉剂不会发生。
3。外科手术
- 确保在整个手术过程中暴露的组织始终保持平衡回暖的PSS液灌流。同样重要的是永远不会与血管手术器械的利益接触或放置在他们用力过猛，通过操纵他们周围的脂肪组织和结缔组织的伤害船只。
- 将鼠标下的解剖范围。沿着腹面中线切开腹腔，并收回对鼠标的脊柱皮肤。
- 一旦皮肤回缩，使LN是很容易看到，针到一个透明Sylgard 184底座的皮肤。
- 删除的一层薄的结缔组织，覆盖该地区周围的LN
- 清除脂肪组织覆盖和周围的淋巴结，直到微血管床暴露。毗邻的LN的主要动脉段规定，通常由小静脉重叠。整个手术大约需要30分钟。
4。成像和血管分析
- 一旦血管段的利息是根据解剖的范围公开，安全上编制的活体显微镜。请注意，动物仍然明确手术板，而在整个实验期间活体显微镜。体温是通过加热灯和维护，通过直肠温度计测量，在手术节所述。麻醉平面还监测整个实验过程中，如在2.1节中所述。
- 成立灌流和吸线。出现的PSS灌流水库的重心从饲料，成由5％CO 2平衡氮灌注水套加热水库（传阅和循环水浴加热水套），并为10ml的速度向下滴水线/分钟。应采用吸线，继续拉从筹备灌流PSS的距离。请注意，实验前吸线和水套进行彻底清洗和存储每次实验后。这将确保不育之前的下一个实验。
- 检查superfusing PSS的温度。调整温度循环水的浴缸和/或PSS的灌流速度，实现温度〜37 ° C整个准备工作。
- 允许血管与PSS的平衡至少60分钟，使用视频卡尺量化血管直径。通常，血管直径应确定在多点（例如，在40，50和60分钟），以确保船只已趋于稳定。
- 评估使用一个特定的平滑肌激动剂（如去氧肾上腺素，PE）和内皮细胞的特定受体激动剂（如乙酰胆碱，乙酰胆碱）的船只的健康。取决于激动剂激动剂浓度应调整，但PE和ACH船只应在评估每个浓度累积增加（10 - 5M 10 - 9M）的superfusate。每个受体激动剂的应用程序应使用PSS的船只，直到返回休息直径（一般为30分钟）一洗相分离。
- 可以进行以下评估血管健康，随后的血管活性药物，荧光标记，并跟踪实验细胞。
- 实验结束后，动物过量戊巴比妥钠。动物监测，以确保到脚趾捏和缺乏运动呼吸或心脏跳动，没有响应。在这样的时间，这是颈椎错位。
5。代表性的成果：
继平衡期的准备工作应产生清晰的图像，可以提供的腹股沟淋巴结的动脉和小静脉识别。应该有最小的脂肪细胞周围的船只，以便清楚地观察到的视频叠加计算血管内径卡尺的小动脉和小静脉的墙壁。一个成功的准备整点是动脉有丰富的血液供应，通过腔和血管张力有一个显着的程度（即动脉有能力vasoconstrict vasodilate平滑肌和内皮细胞的特定受体激动剂分别） 。
图1。腹股沟淋巴结动脉饲料喂养淋巴结平衡与生理盐水和沿端运行的主要微静脉（绿色箭头）（红色箭头）的活体显微镜图像。
图2。累计除了生理盐水灌流苯肾上腺素（PE）的浓度正常的血管活性物质的反应 10-9米至10 -5 M 。一个强大的血管收缩的存在是正常的动脉平滑肌功能目前的暗示。
图3。累计此外，从浓度生理盐水灌流乙酰胆碱（ACH）的正常血管活性反应10-9米至 10 -5 M。一个强大的血管舒张的存在是正常的动脉血管内皮功能目前的暗示。
Discussion
这里介绍的节点的腹股沟淋巴结的活体显微镜图像的淋巴结在体内的微血管的能力。因此，它有利于直接，实时观测的一种手段。号法律公告微血管成像是一个独特的的网站，允许一个研究免疫反应和血管之间的接口。使用该制剂，可重点针对在免疫反应，在血管的改变，或在两者之间的互动。
与所有的实验方法，标准活体显微镜的优势和局限。 IVM的标准，如准备在这里描述，可以很容易地进行修改，和作者先前已证明，允许通过引进荧光示踪染料或标记的细胞群啶显微镜。虽然标准IVM的不给三维成像的可能性和跟踪如将双光子显微镜或血管造影，细胞追踪仍然在两个方面取得，使细胞与细胞和细胞对血管的互动要观察和量化，并结合在体内的管理和随后用荧光抗体染色，可用于蛋白/标记表达的实时数据。
值得注意的是，替代的成像技术，需要一个静态图像的环境，经常需要手术区或另外一个在平坦的准备盖玻片夹紧。这限制了，如果不消除，积极灌注血管或其他介质的准备，以评估血管的完整性和生理等，或使用其他技术，如IVM的编制内进行血管扩张实验能力。此外，IVM的标准并不需要一个完全平坦的准备，而不是通过运动，如动物呼吸产生的的影响。这使得更多的外科手术领域，更大的可重复性使用标准的IVM来。这是体现腹股沟淋巴结这里描述的准备。由于淋巴结的大小和形状，不能作准备平整，无组织受伤和节点的位置产生重大的议案，由于动物的呼吸。这些问题将通过其他方法难以克服的，但很容易使用标准IVM的准备的处理。
总之，上面详细的准备，可与任意数量的其他生化，血管和/或转让激活的子集或标记的细胞，缺氧诱导血管介质损耗过度表达，如免疫学技术。然而，更多的应用程序都依赖于前期准备工作的健康。因此，至关重要的是要始终测试成像和评估血管健康。实现健康准备的关键点是确保编制不断灌注平衡PSS的体温和最大限度地减少手术区放置在手术过程中的接触和压力。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由在加拿大卫生研究院，加拿大不列颠哥伦比亚大学中心的创新，血液研究和北卑诗大学基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
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