Summary
Une technique pour effectuer la microscopie intravitale du ganglion inguinal (LN) est décrite. Cette technique permet en temps réel,
Abstract
Les ganglions lymphatiques (LN), situés à travers le corps, sont une composante intégrante du système immunitaire. Ils servent un site pour l'induction de la réponse immunitaire adaptative, et donc, le développement de cellules effectrices. En tant que tel, LNS sont la clé de la lutte contre les pathogènes envahisseurs et le maintien de la santé. Le choix de la LN à l'étude est dicté par l'accessibilité et le modèle désiré, le ganglion lymphatique inguinal est bien situé et supporte facilement les études de modèles biologiquement pertinentes de la peau et les muqueuses génitales d'infection.
La LN inguinale, comme tous les ganglions, dispose d'un réseau microvasculaire étendue lui fournissant le sang. En général, ce réseau microvasculaire comprend l'artériole l'alimentation principale de la LN que par la suite les branches et les aliments de haute veinules endothéliales (HEV). HEV sont spécialisés pour faciliter le trafic des cellules immunitaires dans le LN pendant les deux homéostasie et de l'infection. Comment réguler le trafic HEV dans la LN en vertu de ces circonstances est une zone d'exploration intense. La LN nourrissent artériole, a une influence directe sur l'amont HEV et l'alimentation principale de nutriments et de cellules du sang riche dans le LN. Par ailleurs, des changements dans l'artériole alimentation sont impliqués dans la facilitation de l'induction de la réponse immunitaire adaptative. Le système microvasculaire LN a une importance évidente dans le maintien d'un approvisionnement en sang optimal à la LN et de réglementer l'afflux de cellules immunitaires dans le LN, qui sont des éléments cruciaux dans la fonction LN et la réponse adéquate suite immunitaire.
La possibilité d'étudier la microvascularisation LN in vivo est la clé pour élucider la façon dont le système immunitaire et le système microvasculaire interagissent et s'influencent les uns les autres au sein de l'LN. Ici, nous présentons une méthode pour l'imagerie in vivo du ganglion lymphatique inguinal. Nous nous concentrons sur l'imagerie de la microvascularisation de la LN, en accordant une attention particulière aux méthodes qui assurent l'étude des vaisseaux sains, la capacité à maintenir l'imagerie des vaisseaux viables sur un certain nombre d'heures, et la quantification de l'ampleur du navire. Méthodes pour la perfusion de la microcirculation avec des médicaments vasoactifs ainsi que le potentiel de tracer et de quantifier le trafic cellulaire sont également présentés.
Microscopie intravitale de la LN inguinale permet une évaluation directe de la fonctionnalité microvasculaires et en temps réel de l'interface directe entre les cellules immunitaires, les LN, et la microcirculation. Cette technique pourrait être combinée avec des techniques immunologiques nombreuses et l'étiquetage des cellules fluorescentes ainsi que pour étudier la vascularisation manipulé de LNS autres.
Protocol
1. Préparation des réactifs
- Réactifs qui seront utilisés tout au long de l'expérience devrait être préparé avant de commencer le protocole chirurgical. Notez que toutes les solutions ont été faites en utilisant une technique stérile.
- Sérum physiologique (PSS) est le mieux préparé en deux composantes: une solution de sel de base et une solution de bicarbonate de sodium. Préparer des solutions à la concentration de 20X et stocker à 4 ° C. Le bicarbonate de sodium à 20X est 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) et une solution de sel de base à 20X la concentration est 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), et 23.4mm MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). Les solutions doivent être préparées en DH 2 O et les produits chimiques doivent être ajoutés un à un et agité jusqu'à solution est limpide avant d'ajouter le produit chimique suivante
- Préparer 2L du PSS en diluant des volumes égaux de solution de bicarbonate de sodium et le sel de base et dilue la concentration de 1X (pour deux 2L du PSS diluer 100 ml de chaque solution de bicarbonate de sodium et le sel de base dans dH 2 O
- Fiole jaugée Placez 2L contenant PSS et PSS à 37 ° C bain-marie. Equilibrer la solution avec 5% de CO 2 / azote gazeux équilibre pour 1h avant le début de la procédure chirurgicale.
- Produits chimiques vasoactif (ex. phényléphrine, l'acétylcholine, le nitroprussiate de sodium) sont les mieux préparés à une concentration 1M de dH2O et stockés dans 100 ul aliquotes à -20 ° C.
2. Préparation des animaux
- Déterminer le poids de la souris et d'administrer la dose initiale de pentobarbital de sodium à 90mg/kg par injection intrapéritonéale. Tout au long de la procédure de la souris est continuellement surveillée pour le plan d'anesthésie par pincement de l'orteil et l'examen minutieux de la fréquence respiratoire. Injections supplémentaires de pentobarbital de sodium doit être administré au besoin, à 20mg/kg de maintenir avion anesthésie. Le plan chirurgical d'anesthésie est entretenu conformément aux règlements fédéraux et institutionnels tel que décrit dans le protocole de soins des animaux approuvée par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation (ACUC) de l'University of Northern BC.
- Enlever les poils de la zone abdominale et le flanc / hanche en rasoir. Retirer restantes cheveux dénoués par tampon imbibé d'alcool et de tapoter la zone avec du ruban adhésif. Cela est suffisant que cette procédure expérimentale est en phase terminale.
- Placez la souris sur un conseil clair chirurgicale en position couchée et attacher la souris pour le conseil en enregistrant chaque coussinet plantaire à la planche. La température corporelle est maintenue par une lampe de chaleur externe et surveillé via thermomètre rectal pour s'assurer que l'hypothermie ne se produit pas en raison de l'anesthésie.
3. Procédure chirurgicale
- Pendant toute la procédure chirurgicale d'assurer tissu exposé est toujours maintenu superfusées avec une solution équilibrée PSS réchauffé. Il est également important de ne jamais entrer en contact avec la vascularisation d'intérêt avec des instruments chirurgicaux ou de blesser les vaisseaux en plaçant à la force de beaucoup sur eux en manipulant les tissus adipeux et le tissu conjonctif qui les entourent.
- Placez la souris sous le microscope à dissection. Faire une incision médiane le long de la surface ventrale de la cavité abdominale et rétracter la peau vers la colonne vertébrale de la souris.
- Une fois que la peau se rétracte pour que le LN est facilement visible, la broche de la peau sur un piédestal de transparence Sylgard 184.
- Retirez la mince couche de tissu conjonctif recouvrant la zone autour de la LN
- Effacer la superposition du tissu adipeux et entourent les ganglions lymphatiques jusqu'à ce que le lit microvasculaire est exposée. Le segment des principales artères pose à côté de la LN et est couramment recouvert par la veinule. La chirurgie prend environ 30 minutes.
4. Imagerie et analyse des navires
- Une fois le segment des navires d'intérêt est exposé sous le coup de dissection, sécuriser la préparation sur le microscope intravitale. Notez que les restes d'animaux sur le plateau claires chirurgicale tandis que sur le microscope intravitale pendant toute la durée de l'expérience. La température corporelle est maintenue par une lampe chauffante et mesurée par thermomètre rectal comme décrit lors de la section chirurgicale. L'avion d'anesthésie est également surveillé tout au long de l'expérience comme décrit dans la section 2.1.
- Mettre en place la surfusion et des lignes d'aspiration. Superfusion du PSS se fait par l'alimentation par gravité à partir d'un réservoir, vers le réservoir d'eau chauffée veste (la veste de l'eau est distribuée et chauffée par le bain-marie circulateur) étant perfusé par le CO 2 5% d'azote équilibré, et en bas une ligne au goutte à goutte à un taux de 10ml / min. Un tuyau d'aspiration doit être utilisée pour continuer tirez PSS superfusées loin de la préparation. Notez que avant l'expérience des lignes d'aspiration et la chemise d'eau sont soigneusement nettoyés et stockés après chaque expérience. Cela garantit la stérilité avant l'expérience suivante.
- Vérifiez la température de la PSS superfusing. Réglez la température de lacirculant bain d'eau et / ou le taux de surfusion PSS pour atteindre une température de ~ 37 ° C à travers la préparation.
- Autoriser la vascularisation s'équilibrer avec PSS pour au moins 60 minutes et de quantifier le diamètre du vaisseau en utilisant l'étrier vidéo. Typiquement, le diamètre du vaisseau devrait être déterminée en des points multiples (par exemple, à 40, 50 et 60 minutes) pour s'assurer que le navire s'est stabilisé.
- Évaluer la santé de la cuve à l'aide d'un agoniste du muscle lisse spécifiques (ex. phényléphrine, PE) et un agoniste endothélium spécifiques (ex.: l'acétylcholine, l'ACh). Concentration d'agoniste doit être ajustée en fonction de l'agoniste, mais pour le PE et Ach le navire doit être évaluée à chaque concentration par addition cumulative (10-5M à 10-9M) à l'superfusat. Chaque demande agoniste doivent être séparées par une phase de lavage (généralement 30 minutes) en utilisant PSS jusqu'à ce que le navire rentre au diamètre de repos.
- Après évaluation de la santé des navires, à la suite médicaments vasoactifs, marquage fluorescent, et la cellule de traçage expériences peuvent être menées.
- Après la fin de l'expérience de l'animal est donné une surdose de pentobarbital de sodium. L'animal est ensuite surveillé pour s'assurer qu'il n'ya pas de réponse à pincement de l'orteil et l'absence de mouvement respiratoire ou battement de coeur. Au moment où ceci est suivi par dislocation cervicale.
5. Les résultats représentatifs:
Après la période d'équilibrage de la préparation devrait donner une image claire qui permet d'identifier à la fois l'artériole et la veinule qui alimente le ganglion lymphatique inguinal. Il devrait y avoir un minimum de cellules adipeuses entourant les vaisseaux pour permettre aux murs de l'artériole et la veinule être clairement observées pour les étriers de la vidéo à superposer pour calculer le diamètre du vaisseau. Le point intégrante d'une préparation réussie est l'artériole a une alimentation riche en sang en mouvement dans la lumière et qu'il ya un degré significatif de tonus vasculaire (c'est à dire l'artériole a la capacité de vasoconstriction et d'vasodilate muscles lisses et endothéliales agonistes spécifiques respectivement) .
Figure 1. Image de microscopie intravitale des ganglions inguinaux nourrissent artériole (flèche rouge) d'alimentation du ganglion lymphatique équilibrée avec une solution saline physiologique et courir le long du côté de la veinule principale (flèche verte).
Figure 2. Vasoactifs réponse normale à la phényléphrine superfusées (PE) par addition cumulative d'eau physiologique à partir des concentrations 10 -9 M à 10 -5 M. La présence d'une vasoconstriction robuste est suggestive de la fonction musculaire normale lisses présentes dans l'artériole.
Figure 3. Vasoactifs réponse normale à l'acétylcholine superfusées (ACh) par l'addition cumulée à partir de sérum physiologique des concentrations de 10 -9 M à 10 -5 M. La présence d'une vasodilatation robuste est suggestive de l'actuelle fonction normale endothéliale dans l'artériole.
Discussion
Microscopie intravitale du ganglion lymphatique inguinal présentée ici permet de microvascularisation image du ganglion in-vivo. Ainsi, il facilite un moyen de direct, en temps réel d'observation. L'imagerie de la microvascularisation LN est un site unique qui permet d'étudier l'interface entre la réponse immunitaire et le système vasculaire. Utiliser cette préparation, l'accent peut être dirigé spécifiquement à la réponse immunitaire, des altérations dans le système vasculaire, ou à l'interaction entre les deux.
Comme avec toutes les approches expérimentales, la norme microscopie intravitale a la fois des avantages et des limites. Standard IVM, tels que la préparation est décrit ici peut facilement être modifié, et a déjà été démontré par les auteurs pour permettre à la microscopie à épifluorescence via l'introduction de colorants traceur fluorescent ou de populations de cellules étiquetées. Bien IVM norme ne donne pas la possibilité de imagerie tridimensionnelle et de traçage, comme serait donné par microscopie à deux photons ou d'angiographie, le suivi de la cellule est toujours réalisé en deux dimensions permettant de cellule à cellule et cellule-à-vasculaire à l'interaction observés et quantifiés et en liaison avec l'administration in vivo et coloration subséquente avec des anticorps fluorescents peuvent être utilisés pour fournir des données sur les protéines / marqueur d'expression en temps réel.
Notamment, les techniques d'imagerie alternatives nécessitent un environnement statique pour les images; de serrage de la zone chirurgicale ou l'ajout d'une lamelle sur une préparation plat est souvent nécessaire. Cette limite, voire élimine, la capacité à perfuser activement médiateurs vasculaires ou d'autres sur la préparation d'évaluer l'intégrité vasculaire et de la physiologie etc, ou l'utilisation d'autres techniques telles que des expériences menées dans la vasodilatation de la préparation IVM. Par ailleurs, la norme IVM ne nécessite pas une préparation complètement à plat et n'est pas affectée par le mouvement, tels que celui généré par la respiration de l'animal. Cela permet IVM standard à utiliser dans des zones plus chirurgical avec une plus grande reproductibilité. Ceci est illustré par la préparation ganglion lymphatique inguinal décrites ici. Etant donné la taille et la forme des ganglions lymphatiques, la préparation ne peut être faite à plat, sans blesser les tissus et l'emplacement du nœud donne lieu à des mouvements significatifs dus à la respiration des animaux. Ces questions seraient difficiles à surmonter par d'autres méthodes, mais sont facilement traitées en utilisant la préparation IVM standard décrit.
En résumé, la préparation détaillée ci-dessus peuvent être combinés avec n'importe quel nombre d'autres biochimiques, vasculaires et / ou techniques immunologiques telles que le transfert de parties de cellules activées ou étiquetés, l'induction de l'hypoxie, et la sur-expression de l'épuisement des médiateurs vasculaires. Cependant, des applications supplémentaires sont dépendants de la santé de la préparation initiale. Par conséquent, il est essentiel de toujours tester la santé de la vascularisation observée et évaluée. Points clés pour atteindre une préparation de la santé sont d'assurer la préparation est constamment perfusé avec PSS équilibré à la température du corps et de minimiser le contact et le stress placé sur la zone opérée pendant la chirurgie.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est financé par les Instituts canadiens de recherche en santé, la Fondation canadienne pour l'innovation, Université de British Columbia Centre for Blood Research et l'Université du Nord de la Colombie-Britannique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
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