Summary
Eine Technik für die Durchführung Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten (LN) wird skizziert. Solche Technik ermöglicht in Echtzeit,
Abstract
Lymphknoten (LN ist), im ganzen Körper befinden, sind ein integraler Bestandteil des Immunsystems. Sie dienen als Ort für die Induktion der adaptiven Immunantwort und damit die Entwicklung von Effektorzellen. Als solche sind LNs Schlüssel zur Bekämpfung von eindringenden Krankheitserregern und Erhaltung der Gesundheit. Die Wahl des LN zur Studie wird von Zugänglichkeit und das gewünschte Modell diktiert, die inguinalen Lymphknoten ist gut gelegen und leicht unterstützt Studien von biologisch relevanten Modelle von Haut-und Schleimhaut-genitale Infektion.
Die inguinalen LN, wie alle LNS, verfügt über ein umfangreiches Netzwerk mikrovaskuläre Versorgung mit Blut. In der Regel enthält diese mikrovaskulären Netzwerk der wichtigsten Futtermittel Arteriole der LN, die später Zweige und hohe Venolen (HEV) speist. HEVs sind zur Erleichterung des Handels von Immunzellen in der LN während der beiden Homöostase und Infektionen spezialisiert. Wie HEVs regulieren Menschenhandel in die LN im Rahmen dieser beiden Umstände ist ein Gebiet intensiver Forschung. Die LN-Feeds Arteriole, hat einen direkten Einfluss auf die vorgelagerten HEVs und ist der wichtigste Nährstoff-und Zell-reiches Blut in den LN. Darüber hinaus werden Änderungen im Futter Arteriole bei der Erleichterung Induktion der adaptiven Immunantwort beteiligt. Die LN Mikrovaskulatur hat offensichtliche Bedeutung in der Aufrechterhaltung einer optimalen Durchblutung der LN und Regulierung von Immunzellen Einstrom in die LN, die entscheidenden Elemente in der richtigen Funktion LN und anschließend Immunantwort sind.
Die Fähigkeit, die LN Mikrovaskulatur in-vivo-Studie ist der Schlüssel zur Aufklärung, wie das Immunsystem und die Mikrovaskulatur und interagieren beeinflussen sich gegenseitig innerhalb der LN. Hier präsentieren wir eine Methode zur in-vivo-Bildgebung des inguinal Lymphknoten. Wir konzentrieren uns auf die Abbildung der Mikrovaskulatur der LN, wobei besonderes Augenmerk auf Methoden, die die Studie mit gesunden Gefäßen, die Fähigkeit zur Bildgebung von lebensfähigen Schiffe über mehrere Stunden halten und die Quantifizierung des Schiffes Größenordnung zu gewährleisten. Methoden für die Durchblutung der Mikrovaskulatur mit vasoaktiven Medikamenten sowie das Potenzial, zu verfolgen und zu quantifizieren zelluläre Verkehr werden ebenfalls vorgestellt.
Intravitalmikroskopie der Leistengegend LN erlaubt die direkte Auswertung der mikrovaskulären Funktion und Echtzeit-Schnittstelle der direkte Schnittstelle zwischen Immunzellen, die LN und die Mikrozirkulation. Diese Technik Potenzial, mit vielen immunologischen Techniken und fluoreszierende Markierung von Zellen als auch manipuliert werden, um Gefäßsystem anderer LNs Studie kombiniert werden.
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Reagenzien im gesamten Experiment verwendet werden, sollten vor Beginn der chirurgischen Protokoll vorbereitet werden. Beachten Sie, dass alle Lösungen hergestellt wurden unter Verwendung steriler Technik.
- Physiologische Kochsalzlösung (PSS) ist am besten in zwei Komponenten hergestellt: basische Salz-Lösung und Natriumhydrogencarbonatlösung. Sowohl Lösungen bei 20X Konzentration und lagern bei 4 ° C. Natriumbicarbonat bei 20X ist 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol) und basische Salz-Lösung bei 20X Konzentration 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol) und 23,4 mm MgSO 4 • 7 H 2 O (246.48g/mol). Die Lösungen sollten in dH 2 O und Chemikalien vorbereitet werden sollte hinzugefügt werden einer nach dem anderen und gerührt, bis die Lösung klar ist vor der Zugabe des nächsten chemische
- Bereiten 2L von PSS durch Verdünnen gleichen Volumina von Natriumbicarbonat und basische Salz-Lösung und Verdünnen auf 1X-Konzentration (für zwei 2L von PSS verdünnen 100mL jedes Natriumbicarbonat und basische Salz-Lösung in dH 2 O
- Legen Sie 2L-Messkolben mit PSS und PSS in 37 ° C Wasserbad. Äquilibrieren Sie die Lösung mit 5% CO 2 / Balance Stickstoffgas für 1 Stunde vor der Operation beginnen.
- Vasoaktive Substanzen (zB Phenylephrin, Acetylcholin, Nitroprussidnatrium) werden am besten bei 1M-Konzentration in dH2O hergestellt und gelagert in 100 &mgr; l Aliquots bei -20 ° C.
2. Tierische Vorbereitung
- Bestimmen Sie das Gewicht der Maus und zu verwalten, die anfängliche Dosis von Natrium-Pentobarbital bei 90mg/kg durch intraperitoneale Injektion. Während des gesamten Verfahrens mit der Maus wird kontinuierlich für Anästhesie Flugzeug über Zehen klemmen und sorgfältige Prüfung der Atemfrequenz beobachtet. Weitere Injektionen von Natrium-Pentobarbital verabreicht als bei 20mg/kg auf die Anästhesie Flugzeug zu halten benötigt werden. Die chirurgische Ebene der Anästhesie ist in Einklang mit Bundes-und institutionelle Regelungen beibehalten, wie in der Tierpflege Protokoll, das von der Animal Care und Verwenden Committee (ACUC) der University of Northern BC genehmigt skizziert.
- Entfernen Sie die Haare aus dem Bauch und Flanken / Hüftbereich durch Rasierer. Verbleibende lose Haare von Alkoholtupfer und klopfte auf den Bereich mit Klebeband. Dies ist ausreichend, da diese experimentelle Vorgehensweise ist Klemme.
- Legen Sie die Maus auf eine klare OP-board in Rückenlage und legen Sie die Maus auf dem Brett durch Abkleben jeder Pfote an den Vorstand. Die Körpertemperatur ist über einen externen Wärmelampe gewartet und überwacht über Rektalthermometer um sicherzustellen, dass Hypothermie nicht als Folge der Narkose auftreten.
3. Surgical Procedure
- Während des gesamten chirurgischen Eingriffs zu gewährleisten freiliegende Gewebe immer gehalten superfundiert mit äquilibriert erwärmt PSS-Lösung. Es ist auch wichtig, nie den Kontakt mit den Gefäßen des Interesses mit chirurgischen Instrumenten oder zu verletzen die Gefäße, indem zu viel Kraft auf sie durch Manipulation Fettgewebe und Bindegewebe um sie herum.
- Platzieren Sie die Maus unter dem Binokular. Machen Sie eine Mittellinienschnitt entlang der ventralen Oberfläche der Bauchhöhle und Einfahren der Haut gegenüber der Maus Wirbelsäule.
- Sobald die Haut eingezogen ist, so dass die LN gut sichtbar ist, Pin die Haut auf einem Sockel aus transparentem Sylgard 184.
- Entfernen Sie die dünne Schicht von Bindegewebe Überlagerung der Bereich um die LN
- Deaktivieren Sie das Fettgewebe überlagert und umgeben den Lymphknoten, bis der mikrovaskulären Bett ausgesetzt ist. Die wichtigsten arteriellen Segment legt neben dem LN und wird allgemein durch die venule überlagert. Die gesamte Operation dauert etwa 30 Minuten.
4. Imaging und Gefäßanalyse
- Sobald das Schiff Segment von Interesse unter der Binokular ausgesetzt ist, sichern Sie die Vorbereitung auf die intravitale Mikroskop. Beachten Sie, dass Tiere auf dem klaren chirurgischen Bord bleibt, während auf der Intravitalmikroskopie Mikroskop während der gesamten Dauer des Experiments. Die Körpertemperatur wird über Wärmelampe gewartet und gemessen über rektale Thermometer während des chirurgischen Abschnitt beschrieben. Die Anästhesie-Ebene ist auch während des ganzen Experiments überwachen, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
- Richten Sie die Superfusion und Saugleitungen. Superfusion von PSS erfolgt durch Schwerkraft aus einem Reservoir, in den Wassermantel beheizten Behälter (der Wassermantel umgewälzt und durch die zirkulierende Wasserbad erhitzt) wird von 5% CO 2 symmetrische Stickstoff durchströmt, und unten einen Tropf line mit einer Rate von 10 ml / min. Eine Saugleitung sollte verwendet werden, um weiterhin zu ziehen superfundiert PSS weg von der Vorbereitung. Beachten Sie, dass vor dem Experiment die Saugleitungen und Wassermantel gründlich gereinigt und gelagert nach jedem Experiment. Dies gewährleistet die Sterilität vor dem nächsten Versuch.
- Prüfen Sie die Temperatur des superfusing PSS. Stellen Sie die Temperatur deszirkulierenden Wasserbad und / oder die Rate der PSS Superfusion auf eine Temperatur von ~ 37 ° C über die Vorbereitung zu erreichen.
- Lassen Sie die Gefäße mit PSS für mindestens 60 Minuten ausgleichen und Quantifizierung der Gefäßdurchmesser mit der Video-Bremssattel. In der Regel sollte Gefäßdurchmesser an mehreren Punkten bestimmt werden (z. B. bei 40, 50 und 60 Minuten), um sicherzustellen, das Schiff stabilisiert hat.
- Beurteilen Sie die Gesundheit des Schiffes mit einem glatten Muskulatur spezifischen Agonisten (zB Phenylephrin, PE) und einer Endothel spezifischen Agonisten (zB Acetylcholin, ACh). Die Konzentration des Agonisten sollte je nach Agonisten eingestellt werden, sondern auch für PE und Ach das Schiff sollte bei jeder Konzentration von kumulativen Addition (10-5M bis 10-9M), um die Superfusat ausgewertet werden. Jeder Agonist Anwendung sollte durch eine Wäsche-Phase (in der Regel 30 Minuten) mit PSS, bis das Schiff wieder in Ruhe Durchmesser getrennt werden.
- Nach der Auswertung des Schiffes Gesundheit, anschließender vasoaktive Medikamente, Fluoreszenzmarkierung und Zelle Tracing Experimente durchgeführt werden können.
- Nach dem Ende des Experiments wird das Tier eine Überdosis von Natrium-Pentobarbital gegeben. Das Tier wird dann überwacht, um sicherzustellen, dass es keine Antwort auf Zehen klemmen und fehlende Atembewegung oder Herzschlag. Zu diesem Zeitpunkt ist dies durch Genickbruch folgte.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Nach der Equilibrierung Zeit der Vorbereitung sollte Ausbeute ein klares Bild, dass für die Identifizierung der beiden Arteriole und venule, dass die Leiste Lymphknoten liefert ermöglicht. Es sollte minimal Fettzellen um die Gefäße für Wände der Arteriolen und Venen, klar für die Video-Messschieber bis überlagert Gefäßdurchmesser berechnen beobachten zu ermöglichen. Die integrale Punkt für eine erfolgreiche Vorbereitung ist der Arteriole hat eine reiche Blutversorgung bewegt durch das Lumen und dass es ein hohes Maß an Gefäßtonus (dh die Arteriole hat die Fähigkeit, vasoconstrict und vasodilate zu Muskel-und Endothelzellen spezifische Agonisten bzw. glatt) .
Abbildung 1. Intravital Mikroskopie Bild inguinal Lymphknoten Feed Arteriole (roter Pfeil) Fütterung der Lymphknoten äquilibriert mit physiologischer Kochsalzlösung und läuft an der Seite der Haupt-venule (grüner Pfeil).
Abbildung 2. Normale vasoaktiven Reaktion auf superfundiert Phenylephrin (PE) durch kumulative neben physiologischer Kochsalzlösung aus den Konzentrationen 10 -9 M bis 10 -5 M. Die Anwesenheit eines robusten Vasokonstriktion ist suggestive der normalen glatten Muskulatur Funktion in der Arteriole.
Abbildung 3. Normale vasoaktiven Reaktion auf superfundiert Acetylcholin (ACh) durch kumulative neben physiologischer Kochsalzlösung aus Konzentrationen 10 -9 M bis 10 -5 M. Die Anwesenheit eines robusten Vasodilatation ist suggestive der normalen Endothelfunktion in der Arteriole.
Discussion
Intravitalmikroskopie der Leistengegend Lymphknoten hier vorgestellten bietet die Möglichkeit, Bild Mikrovaskulatur der Lymphknoten in-vivo. So erlaubt es die Mittel der direkten Echtzeit-Beobachtung. Imaging der LN Mikrovaskulatur ist ein einzigartiger Ort, dass man die Schnittstelle zwischen der Immunantwort und das Gefäßsystem untersucht werden können. Mit dieser Vorbereitung kann konzentrieren sich speziell auf die Immunantwort, Veränderungen in den Blutgefäßen, oder Interaktion zwischen den beiden geleitet werden.
Wie bei allen experimentellen Ansätzen, hat Standard Intravitalmikroskopie sowohl Vor-und Nachteile. Standard IVM, wie die Vorbereitung hier beschrieben, kann leicht geändert werden, und wurde bereits von den Autoren gezeigt, dass Epifluoreszenzmikroskopie über die Einführung von fluoreszierenden Tracer Farbstoffe oder etikettiert Zellpopulationen ermöglichen. Obwohl Standard IVM nicht gibt die Möglichkeit der dreidimensionalen Bildgebung und Tracing, wie sie durch Zwei-Photonen-Mikroskopie oder Angiographie gegeben werden, wird die Zelle Tracking noch in zwei Dimensionen erreicht so Zell-Zell-und Zell-zu-Gefäßsystem Interaktion zu sein beobachtet und quantifiziert und in Verbindung mit in-vivo-Applikation und anschließender Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern verwendet, um Daten über Protein / Marker Ausdruck in Echtzeit geben.
Bemerkenswert ist, benötigen alternative bildgebende Verfahren einer statischen Umgebung für Bilder; Klemmung der OP-Bereich oder die Zugabe von einem Deckglas auf einem flachen Vorbereitung wird häufig benötigt werden. Dies begrenzt, wenn nicht eliminiert, die Fähigkeit zur aktiven perfuse vaskulären oder anderen Vermittlern über die Vorbereitung auf die vaskuläre Integrität und Physiologie etc. oder die Verwendung anderer Techniken wie durchgeführt Vasodilatation Experimente innerhalb der IVM Vorbereitung zu bewerten. Darüber hinaus hat Standard IVM nicht erforderlich, eine völlig ebene Vorbereitung und wird nicht durch Bewegung, wie sie durch die Atmung des Tieres erzeugt betroffen. Dies ermöglicht es Standard IVM in mehr chirurgischen Bereichen mit höherer Reproduzierbarkeit verwendet werden. Dies wird durch die Leisten-Lymphknoten-Vorbereitung hier beschriebene Beispiel. Angesichts der Größe und Form der Lymphknoten, kann das Präparat nicht flach gemacht werden ohne Verletzung des Gewebes und die Lage des Knotens führt zu erheblichen Bewegung durch tierische Atmung. Solche Fragen schwierig sein würde, durch andere Methoden zu überwinden, sind aber leicht mit der Verwendung der Standard-IVM Vorbereitung beschrieben behandelt.
Zusammenfassend kann die Herstellung oben beschrieben mit einer beliebigen Anzahl von kombiniert werden andere biochemische-, Gefäß-und / oder immunologischen Techniken wie dem Transfer von Teilmengen aktiviert oder markierten Zellen, die Induktion von Hypoxie und Überexpression von Erschöpfung der vaskulären Mediatoren. Allerdings sind zusätzliche Anwendungen abhängig von der Gesundheit der anfänglichen Vorbereitung. Daher ist es wichtig, immer testen, die Gesundheit der Gefäße wird abgebildet und ausgewertet. Wichtige Punkte zum Erreichen eines Gesundheits-Vorbereitung sind die Gewährleistung der Vorbereitung ständig mit äquilibriert PSS bei Körpertemperatur perfundiert und Minimierung des Kontakts und Stress auf den OP-Bereich während der Operation gelegt.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der Canadian Institutes of Health Research, Canadian Foundation for Innovation, University of British Columbia Centre for Blood Research und der University of Northern BC finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Nitroprusside | Sigma-Aldrich | ||
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | ||
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium Pentobarbitol |
References
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