Summary
نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسي ، والذي يسمح للتلاعب كفاءة الممرات مرشح.
Abstract
وقد تم التطور الجنيني في الكلى درس على نطاق واسع على حد سواء باعتبارها نموذجا للتفاعل الظهارية - الوسيطة في organogenesis واكتساب فهم أصول أمراض الكلى الخلقية. في الآونة الأخيرة ، وقد تم دراسة إمكانية توجيه الخلايا الجذعية الجنينية من السذاجة تجاه مصائر كلوي الناشئة في مجال الطب التجديدي. وقد حددت الدراسات الجينية في الماوس عدة مسارات اللازمة للتنمية في الكلى ، وفهرس عالمي للنسخ الجيني في الجهاز وقد تم مؤخرا إنشاء http://www.gudmap.org/ ، وتوفير العديد من المنظمين مرشح للوظائف التنموية الأساسية. يمكن دراستها Organogenesis في الكلى القوارض في الثقافة الجهاز ، والعديد من التقارير قد استخدمت هذا الأسلوب لتحليل نتائج تطبيق إما بروتينات مرشح أو اسقاط التعبير عن الجينات باستخدام مرشح أو morpholinos سيرنا. ومع ذلك ، يقتصر تطبيق ثقافة الجهاز لدراسة الإشارات التي تنظم الجذعية / تمايز الخلايا السلف مقابل التجديد في الكلى كما تحتوي على أجهزة مثقف ميثاقا نشر المصفوفة خارج الخلية التي تحد من الجزيئات والجسيمات الفيروس. لدراسة الخلية إشارات الأحداث التي تؤثر على الساق / السلف الخلية المتخصصة في الكلى وضعنا نظام الخلية الأساسية التي تحدد منطقة كلوي أو السلف المتخصصة خلية من خلايا الجسم الحي الكلى السابقين النامية بمعزل عن محفز الظهارية للتمايز. باستخدام الهضم الأنزيمي محدودة ، يمكن الخلايا الكلوية منطقة تتحرر بشكل انتقائي من البلدان النامية في الكلى E17.5. بعد الترشيح ، يمكن هذه الخلايا مثقف بوصفه أحادي الطبقة غير النظامية به الظروف الأمثل. علامة تحليل الجينات يدل على أن هذه الثقافات تحتوي على توزيع أنواع الخلايا المميزة للمنطقة كلوي في الجسم الحي ، وأنها تحافظ على التعبير الجيني علامة المناسبة خلال الفترة الثقافة. هذه الخلايا هي سهلة الوصول إلى جزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسية ، مما يسهل كثيرا من دراسة الجذعية / آثار السلف مرشح منظم الخلية. يمكن المعلمات الخلية الأساسية البيولوجية مثل الانتشار النووي وموت الخلية ، وكذلك التغيرات في التعبير عن علامات مميزة الجزيئية للخلايا الجذعية / السلف نفرون في الجسم الحي واستخدمت بنجاح النتائج التجريبية. العمل الجاري في مختبرنا باستخدام هذه الرواية تقنية الخلية الأولية تهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية التي تحكم تنظيم التجديد الذاتي مقابل التمايز في الخلايا الجذعية / نفرون السلف.
Protocol
1. إعداد الكواشف لهضم الكلى
- سوف 1.5 مل من كولاجيناز 0.25 ٪ ستكون هناك حاجة إلى (ث / ت) و 1 حل بنكرياتين هضم (ث / V) ٪ لاستخراج الخلايا الكلوية منطقة (NZCs) في الفترة من 8 E17.5 الكلى. بنكرياتين لأن يأخذ حوالي 2 ساعة ليحل في درجة حرارة الغرفة ، وهضم ما يكفي من حل لأكبر عدد من الكليتين الجنينية المتوقعة ينبغي أن تكون المقدمة قبل التجربة. إعداد خلاصة الحل بإضافة أول 25 ملغ من كولاجيناز ألف إلى 10 مل Dulbecco الفوسفات في التخزين المؤقت المالحة (DPBS) بشكل واضح 15 مل ، أنبوب الطرد المركزي العقيمة. فمن الأهمية بمكان أن DPBS لا تحتوي على الكالسيوم أو المغنيسيوم لأن هذا سوف تتداخل مع هضم الأنزيمية. مزيج حل على nutator لمدة 10 دقائق لإذابة كولاجيناز A. إضافة 100 ملغ من بنكرياتين كولاجيناز إلى حل أي حل وعلى مزيج nutator ما لا يقل عن 2 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مختلطة كولاجيناز A / حل هضم بنكرياتين على nutator بين عشية وضحاها في 4 ° C. ويوصى بأن عليك ارتداء قناع ، كما كولاجيناز ألف وبنكرياتين تفريق بسهولة في الجو خلال وزنها ويمكن أن تهيج الممرات الأنفية.
- إعداد الجنين مصل الأبقار 5 ٪ (FBS) (V / V) في محلول هانك حل لتحلية التخزين المؤقت (HBSS). عكس إلى المزيج. وسوف 1 مل لكل أنبوب من 8 الكلى يكون ضروريا.
- تحضير مستنبت من خلال استكمال خلية كيراتينية المتوسطة مجانا المصل مع الجلوتامين 1 ٪ (V / V) و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين (PenStrep) (V / V).
- معطف العقيمة البوليسترين لوحات مسطحة القاع زراعة الأنسجة (96 ، 48 ، 24 أو 6 أيضا) مع الحل فبرونيكتين الإنسان بتركيز 5 ملغ لكل سم 2 من سطح النمو. هو معلق 5 ملغ من مسحوق فبرونيكتين في 5 مل من العقيمة O. 2 H هذا هو المخفف في 1:25 DPBS عقيمة بدون المغنيسيوم والكالسيوم أو 250 مل يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. والمحتضنة لوحات ثم بمحلول فبرونيكتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة يليها 1 ساعة بمعدل 4 درجة مئوية بدلا من ذلك ، يمكن المحتضنة لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ثم يستنشق هو الحل في التدفق الصفحي هود قبل إضافة متوسطة / الخلايا.
2. تشريح الكلى وإزالة كبسولات (حرر في درجة حرارة الغرفة)
- في E17.5 والتضحية الأم باستخدام إجراء التي وافقت عليها رعاية الحيوان المؤسسية الخاص ولجنة استخدام وإزالة الرحم ، ووضعه في طبق بتري تحتوي DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تشريح تحت المجهر ، واستخدام الملقط الساعات "لإزالة كل الجنين من الرحم وقطع رأس كل جنين. مرة واحدة في القمامة بالكامل خارج الرحم ونقل الأجنة إلى طبق بتري تحتوي DPBS نظيفة بما فيه الكفاية مع الكالسيوم والمغنيسيوم لتغطي كامل الأجنة تاركة وراءها الكثير من الدماء والأنسجة والحطام ممكن.
- باستخدام الملقط ، وجعل شق كفافي في جدار البطن للجنين على مستوى السرة. ثم ضع الجنين على ظهرها ، دبوس عليه في الكتفين مع مجموعة واحدة من الملقط ، وإزالة الأحشاء الداخلية من الرئتين الى المثانة باستخدام مجموعة أخرى من الملقط. يمكن مع الممارسة أن يتم ذلك في اقتراح واحد. يجب أن يرفق الكلى إلى الجزء الخلفي من كتلة الأجهزة. إذا لا تزال تعلق الكلى لأجهزة ينتزع منه ، ويمكن إزالتها بعناية من جدار الجسم الظهرية. يجب التخلص من الكلى التي تضررت خلال هذه العملية تشريح لأنها سوف يلوث ثقافة النهائي مع أنواع الخلايا غير لائقة.
- ندف بلطف بعيدا الكلى من بقية الأجهزة ، مع الحرص على الحفاظ على الكلى متصلة مع بعضها البعض. عقد بين أنسجة الكلى مع مجموعة واحدة من الملقط وانتزاع الغدة الكظرية المرفقة إلى واحدة من الكليتين مع ملقط الأخرى. يجب أن يرفق الغدة الكظرية للكبسولة الكلى. بلطف قشر الغدة الكظرية ، وبعيدا عن كبسولة حول خارج الكلية ، على غرار تقشير الموز. الحرص على عدم تقسيم الكلى في النصف بينما تقشير ، وتأكد من عدم تلف نسيج الكلى تحت الكبسولة. إزالة بعناية أي كبسولة المتبقية وكذلك الحالب إذا لا تزال تعلق عليه. مع تكرار الكلى المتبقية.
- استخدام الماصة نقل قطع لوضع الكلى في أنبوب البوليسترين 5 مل من HBSS. كرر الخطوات من 2،2-2،4 لكل الجنين. ويمكن تجميع الكلى بنسبة 8 في الأنبوب. ومع إزالة الممارسة ، تشريح وكبسولة تأخذ 2-3 دقائق لكل الجنين.
3. الأنزيمية الهضم الكلى (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يرد خلاف ذلك)
- إزالة حل HBSS من 5 مل تحتوي على أنابيب الكلى مع pipettor بعناية مع تجنب الاتصال مع الكليتين. إضافة 1.5 مل من الفور كولاجيناز A / حل هضم بنكرياتين إلى أنبوب 5 مل تحتوي على الكلى قبل ان ينتقل الى العينة المقبل. كرر لكل أنبوب من الكليتين.
- أنابيب مكان مع انزيم / الكلى على هضم nutator في مرحلة ما قبل حرارة 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 15 دقيقة. 2 دقائق قبلالانتهاء من هضم ، إضافة 3 ميكرولتر من الدناز (1 يو / مل) إلى واحد الطازجة 5 مل أنبوب البوليسترين لكل هضم يتم تنفيذها.
- إزالة بسرعة هضم من الحاضنة ، إضافة 75 ميكرولتر من FBS وعكس 3 مرات لخلط. دعونا نقف على مقاعد البدلاء لمدة 2 دقيقة.
- نقل 1.4 مل من التعليق الخلية في أنبوب البوليسترين 5 مل تحتوي على الدناز (1 يو / مل) بينما يترك الخلايا المتبقية 0.2 مل تعليق والكلى وراءهم. غادر اضافية 0.2 مل من وراء حل وسوف تحتوي على شوائب مثل المصفوفة خارج الخلية.
- مزيج تعليق خلية / الدناز على nutator في مرحلة ما قبل 37 درجة مئوية درجة حرارة الحاضنة لمدة 10 دقيقة.
- إزالة تعليق بسرعة من خلية الحاضنة ونقلها إلى كل أنبوب 1.5 مل إيبندورف. تدور تعليق خلية في microfuge في 325 جرام لمدة 5 دقائق.
- طاف من إزالة الخلايا وبيليه بيليه resuspend في 1 مل من 5 ٪ FBS / HBSS ، pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 6 مرات. سقف كل أنبوب قبل الانتقال إلى نموذج المقبل.
- تدور تعليق خلية في microcentrifuge في 325 جرام لمدة 5 دقائق.
- طاف إزالة وإضافة 0.5 مل من مصل المتوسطة خلية كيراتينية مجانا (KSFM) مع الإضافات إلى كل أنبوب وأنبوب قبعة قبل الانتقال إلى نموذج المقبل. بعد تمت إضافة المتوسطة لجميع الأنابيب ، resuspend بلطف بيليه كل خلية pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 6 مرات مع micropipette 1ml. الجمع بين كل خلية في تعليق الطازجة 5 مل أنبوب البوليسترين.
- قبل 40 ميكرون الرطب two الخلية مصفاة القبعات وضعت على البوليسترين 5 مل أنبوب أسفل مستديرة مع KSFM لكل عينة. تمرير تعليق خلية خلية واحدة من خلال رسملة مصفاة من خلال نقل مع micropipette 1 مل. تجنب لمس تصفية مع طرف ماصة. التدفق من خلال جمع وتكرار الترشيح من خلال رسملة مصفاة ثانية. إزالة الغطاء مصفاة الخلية واستبدالها مع غطاء جديد من الطبيعي 5 مل أنبوب البوليسترين.
- عدد الخلايا مع الخلايا الاخرى عدادة الكريات أو عد خلايا الجهاز ونقلها إلى آبار لوحة الثقافة المغلفة فبرونيكتين في كثافة 100،000-200،000 الخلايا لكل سم 2 ، كما هو مطلوب مع تمييع KSFM مع الإضافات. عموما ، فإننا استرداد حوالي 4.5x10 6 خلايا الجنين في القمامة 10.
- احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع مرطب 5 ٪ CO 2.
- يسمح للخلايا لاسترداد وإرفاق لمدة 2-4 ساعات في المتوسط قبل التحفيز مع الكواشف إضافية. تحفيز الخلايا مع مجمع الفائدة : 1 إلى 48 ساعة. تنقية الحمض النووي الريبي لتحليل PCR باستخدام RNeasy Qiagen مايكرو مجموعة باتباع إرشادات الشركة المصنعة أو اتبع التعليمات التالية لimmunostain fluorescently الخلايا.
4. إعداد الكواشف لتثبيت للخلايا وImmunostaining
- إعداد PFA 4 ٪ : ذوب بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني (V / V) عند درجة حرارة 55 مئوية مع الانفعالات العادية. تبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. هذا الحل هو السامة ويجب التخلص من النفايات في حاويات المعينة.
- يعد حل permeabilization بإضافة تريتون X - 100 لبرنامج تلفزيوني للحصول على حل 0.3 ٪ (V / V).
- إعداد محلول 5 ٪ حظر في برنامج تلفزيوني مع المصل من الأنواع نفسها التي كانت تستخدم لرفع مستوى الأجسام المضادة الثانوية لاستخدامها. على سبيل المثال ، إذا كنت سوف الكشف عن الأجسام المضادة ضد المستضد الأرانب التي تستهدفها مع حمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 568 ، يعد حل حظر تحتوي على 5 ٪ المصل حمار. المحل في 4 درجات مئوية.
- يعد الحل الأساسي الضد بإضافة تركيز مناسب من الأضداد إلى 5 ٪ حل حظر.
- إعداد الثانوية حل الضد مباشرة قبل الاستعمال. إضافة الضد fluorophore مترافق في تركيز الشركة المصنعة أوصت مع دابي ملون مباين النووية وغيرها من علامات عضية مثل phalloidin إلى محلول 5 ٪ حظر. إذا كان المطلوب التخزين ، والحفاظ على الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى استخدام.
- تحضير الجلسرين 50 ٪ / حل PBS (V / V) لتخزين الخلايا immunostained. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Vectashield.
5. تثبيت للخلايا وImmunostaining
- ويهدف البروتوكول التالية لتثبيت وتلون NZCs في 24 لوحة جيدا. نظرا لأحجام وبئر واحدة. وينبغي الكواشف pipetted بلطف خلال جميع الخطوات لتجنب مفرزة من الخلايا ، وغير مستحسن لوحة التحريض في الخطوات الحضانة.
- إزالة بلطف المتوسطة مع micropipette 1 مل وإضافة 0.5 مل من 4 ٪ إلى PFA الخلايا المستزرعة المرفقة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون عائق.
- إزالة 4 ٪ PFA وإضافة 0.5 مل من محلول لكل بئر permeabilization. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل permeabilization والشطف بلطف مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف.
- إضافة 0.5 مل من عرقلة الحل ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
- الحل إزالة الحجب وإضافة 0.225 مل حل الضد الابتدائي.
- يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة والحل الأساسي ري بلطفNSE مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف.
- إضافة 0.225 مل حل الضد الثانوية. احتضان لوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية حل والشطف بلطف مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف.
- إضافة 0.3 مل من 50 ٪ الجلسرين / PBS الحل (V / V) أو Vectashield بما يكفي لتغطية الجزء السفلي من السطح جيدا.
- خلايا ملفوفة مع صورة المجهر epifluorescence أو تخزينها في احباط في 4 درجات مئوية.
6. ممثل النتائج
الشكل 1. وتنقيته من NZCs E17.5 الأجنة ، مطلي في الخلايا لكل 200000 سم 2 والمحتضنة في 37 درجة مئوية ليصبح المجموع 24 ساعة. وعلى النقيض من تصوير الخلايا المرحلة مع الاتحاد الدولي للرجبي لايكا المجهر المقلوب DM قبل تلوين مناعي. (أ) على النقيض من المرحلة 20X عرض NZCs بعد 24 ساعة في الثقافة. (ب) كانت ثابتة والملون باستخدام خلايا الأرنب مكافحة PAX2 الأجسام المضادة لخلايا محددة السلف نفرون (الحمراء) ، وثانوية اليكسا فلور 568 مترافق حمار المضادة أرنب. لاحظ نوى الزرقاء counterstained مع دابي. (C) على النقيض من المرحلة 40X عرض مجموعة من الأسلاف نفرون (متوسط) بعد 24 ساعة في الثقافة. (D) وأعرب عن صورة 40X من NZCs المعزولة من أجنة LacZ + من سلالة LacZ Foxd1 ، الذي يعبر عن β - غالاكتوزيداز تحت سيطرة المروج Foxd1. Foxd1 السكان في انسجة الخلايا داخل المنطقة كلوي في الكلى النامية. تم صبغ الخلايا التي تحتوي على علامة phalloidin F - الأكتين (أوريغون الخضراء الابتدائية المتقارن) ، وصمة عار دابي النووية (الأزرق) والمضادة للأرنب β - غالاكتوزيداز (الثانوي -- اليكسا فلور حمار المضادة للأرنب 568) للكشف عن خلايا انسجة Foxd1 + ( الحمراء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول وصفنا أسلوبا لعزل الخلايا والثقافة من منطقة كلوي في الكلى الجنينية. هو تطوير وسيلة نشر في البداية كجزء من دراسة لآثار العلاج على خلايا BMP7 المنطقة كلوي (فارغ وآخرون ، 2009). في الدراسة الأولية ، وأجريت سلسلة من التجارب لتحديد خصائص أنواع الخلايا ممثلة في عدد السكان NZC. لفترة وجيزة ، وتنقية للصحفيين من NZCs الوراثية لسدى القشرية (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini وآخرون ، 1996) ، وجمع قناة (Hoxb7 + / لجنة المساواة العرقية ؛ rEYFP R26) (سرينيفاس وآخرون ، 2001 ؛. يو وآخرون. ، 2002) ، وقبعة اللحمة المتوسطة (Bmp7 + / lacZ) (غودين وآخرون ، 1998) وكشفت أن ما يقرب من 35 ٪ من NZCs تحصد هي سدى القشرية ، و 52 ٪ هي الحد الأقصى واللحمة المتوسطة أن جمع تلوث القناة تمثل أقل من 0.04 ٪. نسب بمناسبة التجارب باستخدام Bmp7 + / لجنة المساواة العرقية ؛ R26 rEYFP سلالة (Oxburgh وآخرون ، 2004 ؛. سرينيفاس وآخرون ، 2001) أظهرت أن حوالي 10 ٪ من NZCs قد تكون خلايا اللحمة المتوسطة سقف نسب متباينة ، والتي فقدت Bmp7 التعبير . وأظهرت دراسات الجدوى مع 7AAD معدل البقاء على قيد الحياة في عزلة NZCs حوالي 95 ٪. شهدنا في الآونة الأخيرة نجاحا في فصل المجموعات السكانية الفرعية داخل الخلية عن طريق الفرز NZCs تدفق cytometric. ومع ذلك ، قد حدت من ندرة غشاء المرتبطة علامات محددة على كل من الشرائح السكانية للمنطقة كلوي هذه التحليلات ، وحاليا فقط الخلايا المشتقة من الفئران التي تحمل الجينات علامة فلوري هو ممكن عمليا.
فعالية هذا البروتوكول يعتمد بدرجة كبيرة على السرعة في الخطوة تشريح. كلا بقاء الخلية والاستجابة لعامل النمو زيادة التحفيز عندما الكلى تبقى في HBSS لفترات أقصر من الوقت قبل الهضم الأنزيمي. وأقصر وقت إعداد النتائج وبالتالي سواء في البقاء أعلى الخلية واستجابة أكثر قوة. وعلاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر عند إزالة طاف بعد الغزل تعليق الخلية كما تشعر بالانزعاج بسهولة بيليه الخلية مما يؤدي إلى فقدان الخلية كبيرة.
لأن العمل الأولي لGrobstein كليفورد اصفا الجنينية الثقافة الجهاز (Grobstein ، 1953a ؛ Grobstein ، 1953b) ، فقد تم الكلى نظام نموذجي لorganogenesis والتفاعل بين الخلايا الظهارية والوسيطة في مجال التنمية. وقد كشفت مؤخرا التعبير الجيني microanatomic الايروبيكس التعقيد غير متوقعة من أنواع الخلايا في كل من هذه الأجزاء الخلوية (Brunskill وآخرون ، 2008) ، ويطلب من وسائل تكميلية مثل الثقافة NZC لفهم الترابط بين هذه الخلايا خلال nephrogenesis. الهدف النهائي المتمثل في تحقيقاتنا الخلية الأولية هي تحديد الظروف التي يمكن أن الخلايا الكلوية توسيع منطقة إلى أجل غير مسمى سواء في المختبر لإجراء دراسات وnephrogenesis engraftment في البالغين. منظومة الثقافة NZC خطوة هامة نحو تحقيق هذا الهدف ، والدراسات الجارية في مختبرنا تهدف إلى تحديد آليات للسيطرة على النمو في هذه الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من R01 DK078161 NIDDK (LO) ، زمالات ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الاميركية (AB) ، وأسس Wenner - جرين السويد وKungliga Fysiografiska Sällskapet ، لوند ، السويد (UB). وقدم دعم إضافي من قبل مركز أبحاث مين المعدات الطبية الأساسية معهد التشريح ، وعلم تكنولوجيا المعلومات الحيوي FACS (بدعم من 06 - 2P20RR18789) ومرفق MMCRI الحيوان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
