Summary
В этом докладе мы описываем метод изоляции и культуры нишу клеток-предшественников из эмбриональных почек мыши, которые могут быть использованы для изучения сигнальных путей, регулирующих стволовых / прогениторных клеток из развивающихся почек. Эти культурные клетки очень доступным для небольшой молекулы и рекомбинантного белка лечения и, что важно также, чтобы вирусная трансдукция, которая позволяет эффективно манипуляции кандидатом путей.
Protocol
1. Подготовка реагентов для почек Пищеварение
- 1,5 мл 0,25% коллагеназы (м / о) и 1% Панкреатин переварить (м / о) решение будет необходима для извлечения нефрогенным клетки зоны (NZCs) с 8 E17.5 почек. Потому что Панкреатин занимает около 2 часов для растворения при комнатной температуре, достаточно переварить решение для наибольшего числа эмбриональных почек ожидать должно быть сделано до эксперимента. Подготовка переварить решение, добавьте сначала 25 мг коллагеназы на фосфат 10 мл Дульбеко буферного раствора (DPBS) в 15 мл ясно, стерильную пробирку центрифуги. Очень важно, чтобы DPBS НЕ содержит кальция или магния, поскольку это будет мешать ферментативных переварить. Смешайте раствор на nutator в течение 10 минут, чтобы растворить Коллагеназа А. Добавить 100 мг Панкреатин растворенные в воде Коллагеназа решения и смеси на nutator не менее 2 часов. Кроме того, коллагеназы / Панкреатин переварить решения могут быть смешаны на nutator течение ночи при 4 ° C. Рекомендуется, чтобы вы носите маску, как коллагеназы и Панкреатин разгона легко в атмосферу во время взвешивания и могут раздражать носовые ходы.
- Подготовка 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (объем / объем) раствор в солевой буфер решение Хэнка (HBSS). Обратить перемешать. 1 мл для каждой трубки 8 почек будет необходимо.
- Подготовка питательной среды путем дополнения кератиноцитов бессывороточной среде с 1% глютамин (об. / об) и 1% пенициллина-стрептомицина (PenStrep) (объем / объем).
- Пальто стерильной плоским дном полистирола культуре ткани пластин (96, 48, 24 или 6 а) с человека решение фибронектина при концентрации 5 мг на см 2 поверхности роста. 5 мг фибронектина порошок ресуспендируют в 5 мл стерильной H 2 O. Это разбавляют 1:25 в стерильных DPBS без кальция или магния и 250 мл добавляется в каждую лунку 24-луночный планшет. Плиты затем инкубировали с фибронектина растворе при комнатной температуре в течение 1 часа, затем 1 час при температуре 4 ° C. Кроме того, плиты могут быть инкубировали в течение ночи при температуре 4 ° С. Затем раствор атмосферный в ламинарном боксе до добавления среды / клеток.
2. Пройдя через почки и удаление капсул (урон при комнатной температуре)
- На E17.5, жертвенность матери с помощью процедуры, утвержденные вашей Институциональные уходу и использованию животных комитета, удалить матку, и поместить его в чашке Петри содержащие DPBS с кальцием и магнием. Под микроскопом рассекает, используйте часовщиков щипцы для удаления каждый эмбрион из матки и обезглавить каждого эмбриона. Как только весь помет находится вне матки, трансфер эмбрионов на чистую чашку Петри, содержащий достаточно DPBS с кальцием и магнием, чтобы полностью покрывать эмбрионов оставив позади так много крови и тканей мусора насколько это возможно.
- Использование щипцов, чтобы окружная разрез в брюшной стенке эмбриона на уровне пупка. Затем поместите эмбриона на спине, контактный его вниз на плечи на одном комплекте щипцы, и удалить внутренние органы от легких до мочевого пузыря, используя другой набор щипцов. С практикой это можно сделать одним движением. Почки должны быть прикреплены к задней массы органов. Если почки не остаются прикрепленными к потрошился органов, их можно осторожно вынуть из спинной стенке тела. Почки, которые были повреждены во время этого процесса вскрытия должны быть отброшены, поскольку они будут загрязнять окончательного культуры с неподходящими типами клеток.
- Аккуратно дразнить от почки от остальных органов, заботясь, чтобы сохранить почки связаны друг с другом. Держите ткани между почки с одним набором щипцов и захватить надпочечников прикреплен к одному из почки с другими щипцами. Надпочечников должны быть прикреплены к почечную капсулу. Аккуратно очистите надпочечников и капсулы от вокруг внешней почки, похожие на пилинг банана. Заботьтесь, чтобы не разделить почки в два раза в то время как пилинг, и быть уверенным, чтобы не повредить почки ткань под капсулой. Осторожно удалите все оставшиеся капсулы, а также мочеточник, если он по-прежнему прилагаются. Повторите с оставшейся почки.
- Используйте пипетку вырезать передачу на место почки в 5 мл полистирола трубки HBSS. Повторите шаги 2.2-2.4 для каждого эмбриона. Почки могут быть объединены 8 в трубу. При удалении практике, рассечение капсулы и займет 2-3 минут в зародыше.
3. Ферментативного пищеварения почек (все шаги При комнатной температуре, если не указано иное)
- Удалить HBSS решение от 5 мл пробирки, содержащие почки с пипетки, тщательно избегая контакта с почками. Сразу же добавить 1,5 мл коллагеназы / Панкреатин переварить решение 5 мл трубку с почками, прежде чем перейти к следующему образцу. Повторите эти действия для каждой трубки почек.
- Место труб с ферментом / почек дайджесты по nutator в подогретого 37 ° C инкубаторе в течение 15 минут. 2 минуты дозавершение переварить, добавляют 3 мкл ДНКазы (1 ед / мл) на один свежий 5 мл полистирола трубки для каждого переварить может быть исполнено.
- Быстро удалить дайджесты из инкубатора, добавить 75 мкл ФБС и инвертировать 3 раза перемешать. Дайте постоять на скамейке в течение 2 минут.
- Передача 1,4 мл клеточной суспензии в 5 мл полистирола пробирку ДНКазы (1 ед / мл), оставив остальные 0,2 мл суспензии клеток и почек позади. Дополнительные 0,2 мл раствора оставил будет содержать примеси, такие как внеклеточного матрикса.
- Смешайте суспензии клеток / ДНКазы на nutator в подогретого 37 ° С инкубатор на 10 минут.
- Быстро удалить клеточные суспензии из инкубатора и передавать друг к 1,5 мл трубки Эппендорф. Спиновые клеточные суспензии в микроцентрифужную в 325 г в течение 5 минут.
- Удалить супернатант из осадок клеток и ресуспендируют осадок в 1 мл 5% ЭТС / HBSS, пипетирования вверх и вниз от 5 до 6 раз. Cap каждую пробирку, прежде чем перейти к следующему образцу.
- Спиновые клеточные суспензии в микроцентрифужных в 325 г в течение 5 минут.
- Удалить супернатант и добавить 0,5 мл кератиноцитов бессывороточной среде (KSFM) с добавками в каждую пробирку и шапку трубку, прежде чем перейти к следующему образцу. После среда была добавлена во все пробирки, мягко ресуспендирования каждый осадок клеток с помощью пипетки вверх и вниз от 5 до 6 раз с 1 мл микропипетки. Смешайте все клеточные суспензии в свежем 5 трубка полистирола мл.
- Предварительно мокрой два 40 микрон клеточной фильтр шапки размещены на 5 мл полистирола круглым дном трубки с KSFM на образец. Pass клеточные суспензии через одну крышку фильтра ячейки путем перечисления с 1 микропипетки мл. Старайтесь не прикасаться фильтр с кончика пипетки. Сбор проточные и повторить фильтрацию через вторую крышку фильтра. Снимите крышку ячейки фильтра и заменить на новый колпачок от нормального 5 трубка полистирола мл.
- Граф клеток с гемоцитометра или другие устройства подсчета клеток и передачи клеткам скважин фибронектина покрытием пластины культуре плотность 100,000-200,000 клеток на см 2, разбавляя по мере необходимости с KSFM с добавками. Как правило, мы получаем примерно 4.5x10 6 клеток на 10 эмбриона помета.
- Инкубируйте клетки в 37 ° С увлажненным инкубаторе с 5% CO 2.
- Разрешить клеткам восстановиться и приложите на 2-4 часов в среде до стимуляции дополнительных реагентов. Стимулировать клеток с соединением, представляющих интерес для 1 до 48 часов. Purify РНК для анализа ПЦР с использованием Qiagen RNeasy Micro Kit, следуя инструкциям производителя или следуйте инструкциям ниже, чтобы флуоресцентно immunostain клеток.
4. Подготовка реагентов для фиксации клеток и Иммуноокрашивание
- Подготовка 4% PFA: Растворите 4% параформальдегида в ФСБ (об. / об) при 55 ° С при регулярном волнении. Охладите до комнатной температуры перед использованием. Это решение является токсичным и должен быть уничтожен в специально отведенных для мусорных контейнеров.
- Подготовка пермеабилизации решение, добавив Тритон Х-100 для PBS получить 0,3% (объем / объем) раствор.
- Подготовка 5% блокирующий раствор в ФБР с сывороткой и того же вида, который был использован для повышения вторичными антителами, которые будут использоваться. Например, если вы будете обнаруживать кролика антитела против вашего целевого антигена с ослом анти-кролик Alexa Fluor 568, подготовить блокирующий раствор, содержащий 5% осла сыворотки. Хранить при температуре 4 ° С.
- Подготовка первичных решение антител путем добавления соответствующей концентрации антител к 5% блокирующим раствором.
- Подготовка вторичного антитела решение непосредственно перед использованием. Добавить флуорофора конъюгированных антител, при рекомендуемой концентрации производителя вместе с ядерным контрастирующая DAPI и других маркеров органелл, таких как фаллоидином до 5% блокирующим раствором. Если хранение необходимости держать решение в темноте при 4 ° С до использования.
- Подготовка 50% глицерин / PBS решение (об / об) для хранения immunostained клеток. Кроме того, Vectashield могут быть использованы.
5. Фиксация клеток и Иммуноокрашивание
- Следующий протокол предназначен для фиксации и окрашивания NZCs в 24-луночный планшет. Объемы указаны только для одной скважины. Реагенты следует осторожно пипеткой в течение всех этапов, чтобы избежать отряд клеток, и пластина агитации не рекомендуется при инкубации.
- Аккуратно снимите среде с 1 мл микропипетки и добавить 0,5 мл 4% PFA к которому прилагаются культуре клеток. Инкубировать 15 минут спокойно при комнатной температуре.
- Удалить 4% PFA и добавить 0,5 мл на лунку пермеабилизации решение. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Удалить пермеабилизации раствора и осторожно промыть два раза с 0,5 мл PBS на полоскание.
- Добавить 0,5 мл блокирующий раствор и инкубировать при комнатной температуре в течение 60 минут.
- Удалите блокирующий раствор и добавляют 0,225 мл первичной решение антител.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов или на ночь при 4 ° C.
- Удалите первичный решение антител и аккуратно риNSE в два раза с 0,5 мл PBS на полоскание.
- Добавить 0,225 мл вторичного решение антител. Инкубируют пластинки в темноте при комнатной температуре в течение 60 минут.
- Удаление вторичной решение антител и аккуратно промыть в два раза с 0,5 мл PBS на полоскание.
- Добавить 0,3 мл 50% глицерин / PBS решение (об / об) или достаточно Vectashield для покрытия нижней части и поверхности.
- Изображение клетки с epifluorescence микроскопа или магазина, завернутые в фольгу при 4 ° C.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. NZCs очищали от E17.5 эмбрионов, помещали на 200000 клеток на см 2 и инкубировали при 37 ° С в течение всего 24 часов. Клетки изображено фазового контраста с IRB Leica DM инвертированного микроскопа до иммунофлуоресцентного окрашивания. (А) 20-кратный фазового контраста зрения NZCs после 24 часов в культуре. (Б) Клетки фиксировали и окрашивали использованием кроличьих анти-PAX2 антитела, специфичные для клеток нефрона предшественников (красный) и вторичные Alexa Fluor 568 сопряженных осла анти-Кролик. Обратите внимание, синий ядер контрастно с DAPI. (C) 40X зрения фазового контраста скопления нефрона прародителей (по центру), после 24 часов в культуре. (D) 40X образ NZCs изолированы от LacZ + эмбрионов штамма Foxd1 LacZ, которая выражает β-галактозидазы под контролем Foxd1 промоутера. Foxd1 выражается в стромальных клеточной популяции в течение нефрогенной зоне развивающихся почек. Клетки окрашивали F-актин маркер фаллоидином (Орегон зеленый первичные сопряженные), ядерные пятно DAPI (синий) и кроличьих анти-β-галактозидазы (вторичный - Alexa Fluor осла анти-кролик 568) для обнаружения Foxd1 + стромальных клеток ( красный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе описывается метод, чтобы изолировать и культуры клеток из нефрогенной зона эмбриональных почек. Это развитие метода первоначально опубликован в рамках изучения последствий BMP7 лечения на клетки нефрогенным зоны (Blank и соавт., 2009). В первоначальном исследовании, серию экспериментов, чтобы охарактеризовать типы клеток, представленных в NZC населения проводились. Короче говоря, очистка NZCs от генетических репортеров корковых стромы (Foxd1 + / LacZ) (. Hatini и др., 1996), собирательных канальцев (Hoxb7 + / CRE; R26 rEYFP) (Srinivas и др., 2001;. Ю. и соавт. , 2002), и шапку мезенхимы (BMP7 + / LacZ) (Годин и соавт., 1998) показало, что около 35% заготовленной NZCs являются корковые стромы, 52% из них крышки мезенхимы и собирательных канальцев, что загрязнение составляет менее 0,04%. Lineage маркировки экспериментов с использованием BMP7 + / CRE; R26 rEYFP деформации (Оксбург и др., 2004;.. Srinivas и др., 2001) показали, что около 10% NZCs могут быть клетки мезенхимы линию крышки, которые дифференцированы и потерял BMP7 выражение . Жизнеспособность исследования с 7AAD показали выживаемость в изолированных NZCs около 95%. Мы недавно испытали успех в выделении ячейки субпопуляций в NZCs через проточной цитометрии сортировки. Тем не менее, нехватка мембранно-связанные маркеры, характерные для каждой из субпопуляций нефрогенным зоны ограниченного этих анализов, и в настоящее время только клетки, полученные из мышей, несущих флуоресцентные гены маркер возможным.
Эффективность этого протокола в значительной степени зависит от скорости в анатомическом театре шаг. Оба выживания клетки и реагировать на стимуляцию факторов роста увеличивается, когда почки остаются в HBSS на более короткие периоды времени, прежде чем ферментативного пищеварения. Короче время на подготовку таким образом результаты как в высшие жизнеспособности клеток и более надежный ответ. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при снятии супернатант после вращения клеточной суспензии, как клеточный осадок легко нарушается в результате значительной потери клеток.
Так как начальная работа Клиффорд Grobstein описания эмбриональных органной культуры (Grobstein, 1953а; Grobstein, 1953б), почки была модельная система для органогенеза и взаимодействия эпителиальных и мезенхимальных клеток в процессе развития. Последние microanatomic исследования экспрессии генов показали непредвиденные сложности типы клеток, в каждой из этих сотовых купе (Бранскилл и соавт., 2008), и дополнительные методы, такие как NZC культуры, необходимые для понимания взаимосвязи между этими клетками во время nephrogenesis. Конечная цель нашей первичной ячейке исследования является определение условий, при которых клетки нефрогенным зона может быть расширена на неопределенное время в пробирке, как для исследования nephrogenesis и приживления у взрослых. NZC система культуры является важным шагом к достижению этой цели, а также текущих исследований в нашей лаборатории направлены на определение механизмов контроля роста в этих клетках.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01 DK078161 от NIDDK (LO), докторской стипендии Американской ассоциации сердца (АВ), Веннер-Грен Основы Швеции и Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Лунд, Швеция (UB). Дополнительная поддержка была оказана Мэн медицинский центр научно-исследовательский институт объектов ядра для Гистопатология, биоинформатика и FACS (при поддержке 2P20RR18789-06) и фонд MMCRI животных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
- Grobstein, C. Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter. Nature. 172, 869-870 (1953).
- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
