Summary
इस रिपोर्ट में हम भ्रूण माउस कि संकेत विकासशील गुर्दे के स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं विनियमन रास्ते का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है गुर्दे से पूर्वपुस्र्ष सेल आला के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन. इन संवर्धित कोशिकाओं को अत्यधिक छोटे अणु और पुनः संयोजक प्रोटीन उपचार के लिए पहुंच रहे हैं, और महत्वपूर्ण बात यह भी वायरल पारगमन है, जो उम्मीदवार रास्ते के कुशल हेरफेर की अनुमति देता है.
Protocol
1. गुर्दा पाचन के लिए अभिकर्मकों की तैयारी
- 0.25% Collagenase के 1.5 मिलीलीटर (w / v) और 1% pancreatin पचाने में समाधान (w / v) 8 E17.5 गुर्दे से nephrogenic क्षेत्र कोशिकाओं (NZCs) की निकासी के लिए आवश्यक हो जाएगा. क्योंकि pancreatin लगभग 2 घंटे लगते हैं के लिए कमरे के तापमान पर भंग, प्रयोग करने के लिए पहले किया जाना चाहिए की उम्मीद भ्रूण गुर्दे की सबसे बड़ी संख्या के लिए पर्याप्त समाधान को पचाने. पहले Collagenase के 25 मिलीग्राम एक 10 मिलीलीटर Dulbecco फास्फेट एक स्पष्ट 15 मिलीलीटर, बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूब में खारा (DPBS) buffered. जोड़कर समाधान को पचाने के लिए तैयार यह महत्वपूर्ण है कि DPBS कैल्शियम मैग्नीशियम या नहीं के रूप में इस एंजाइमी पचाने में के साथ हस्तक्षेप करेगा करता है. मिश्रण 10 मिनट के लिए nutator पर समाधान को भंग Collagenase ए कम से कम 2 घंटे के लिए भंग Collagenase एक और एक nutator पर समाधान मिश्रण pancreatin के 100 मिलीग्राम जोड़ें. वैकल्पिक रूप से, एक nutator पर Collagenase एक / pancreatin पचाने में समाधान मिलाया जा सकता है रात 4 बजे ° यह सी. अनुशंसित है कि आप एक Collagenase और pancreatin वातावरण में आसानी से वजन के दौरान नाक passages को फैलाने और जलन हो सकती है के रूप में एक मुखौटा पहनते हैं.
- एक 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) हांक buffered खारा समाधान (HBSS) में समाधान (v / v) तैयार है. मिश्रण उलटें. 8 गुर्दे की प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मिली आवश्यक हो जाएगा.
- 1% (v / v) glutamine और 1% (PenStrep) पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (v / v) के साथ keratinocyte सीरम मुक्त मध्यम सप्लीमेंट द्वारा संस्कृति के माध्यम से तैयार करें.
- बाँझ फ्लैट नीचे कोट वृद्धि की सतह के प्रति 2 सेमी 5 मिलीग्राम की एकाग्रता में मानव fibronectin समाधान के साथ polystyrene टिशू कल्चर प्लेट (96, 48, 24, या 6 में अच्छी तरह से) . Fibronectin पाउडर के 5 मिलीग्राम बाँझ एच 2 ओ 5 मिलीलीटर में resuspended है यह कैल्शियम मैग्नीशियम या बिना बाँझ DPBS में 1:25 पतला है और 250 मिलीलीटर के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा है. प्लेट्स हैं तो 1 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस वैकल्पिक रूप से 1 घंटे से पीछा के लिए कर रहे हैं fibronectin समाधान के साथ कमरे के तापमान पर incubated, प्लेटें 4 में रात भर incubated कर सकते हैं डिग्री सेल्सियस समाधान तो एक लामिना का प्रवाह हुड में से aspirated है / मध्यम के अलावा पहले कोशिकाओं.
2. गुर्दे और हटाना कैप्सूल (कमरे के तापमान पर किया विदारक)
- E17.5 में, अपने संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रिया का उपयोग कर माँ बलिदान, गर्भाशय निकालना, और यह कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ DPBS शामिल एक पेट्री डिश में जगह. एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, watchmakers संदंश उपयोग के गर्भाशय से प्रत्येक भ्रूण को हटाने और प्रत्येक भ्रूण सिर काटना. एक बार पूरे कूड़े गर्भाशय के बाहर है, एक साफ पेट्री कैल्शियम और मैग्नीशियम के लिए पूरी तरह से ज्यादा है और संभव के रूप में ऊतक मलबे रक्त के रूप में छोड़ने के पीछे भ्रूण को कवर के साथ पर्याप्त DPBS युक्त डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण.
- संदंश का प्रयोग, नाभि के स्तर पर भ्रूण की पेट की दीवार में एक परिधीय चीरा बनाते हैं. फिर अपनी पीठ पर भ्रूण जगह है, यह संदंश का एक सेट के साथ कंधे पर पिन नीचे, और संदंश के दूसरे सेट का उपयोग कर मूत्राशय के नीचे फेफड़ों से आंतरिक अंगों को निकालने के. इस अभ्यास के साथ एक प्रस्ताव में किया जा सकता है. गुर्दे अंगों के द्रव्यमान के पीछे करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए. यदि गुर्दे eviscerated अंगों रहने संलग्न नहीं करते हैं, वे ध्यान पृष्ठीय शरीर दीवार से हटाया जा सकता है. गुर्दे कि इस विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त किया गया है के रूप में वे अनुचित प्रकार की कोशिकाओं के साथ अंतिम संस्कृति को दूषित करने के लिए त्याग किया जाना चाहिए.
- धीरे दूर अंगों के बाकी हिस्सों से गुर्दे तंग, देखभाल लेने के लिए एक दूसरे से जुड़े गुर्दे रखना. संदंश का एक सेट के साथ गुर्दे के बीच ऊतकों को पकड़ो और एक अन्य संदंश के साथ गुर्दे की से जुड़ी अधिवृक्क ग्रंथि हड़पने. अधिवृक्क ग्रंथि गुर्दे कैप्सूल करने के लिए संलग्न किया जाना चाहिए. धीरे अधिवृक्क ग्रंथि और गुर्दे के बाहर, एक केला छीलने के समान के आसपास से दूर कैप्सूल छील. ख्याल रखना आधे में गुर्दे विभाजित नहीं जबकि छीलने, और कैप्सूल नीचे गुर्दे ऊतक नुकसान नहीं करने के लिए सुनिश्चित हो. ध्यान से किसी भी शेष के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अगर यह अभी भी जुड़ी है मूत्रवाहिनी कैप्सूल हटा दें. शेष गुर्दे के साथ दोहराएँ.
- एक कट हस्तांतरण pipet का प्रयोग एक 5 मिलीलीटर HBSS polystyrene ट्यूब में गुर्दे की जगह. दोहराएँ प्रत्येक भ्रूण के लिए 2.2-2.4 कदम. गुर्दे 8 ट्यूब प्रति जमा किया जा सकता है. अभ्यास विच्छेदन, कैप्सूल और हटाने के साथ भ्रूण प्रति 2-3 मिनट लग जाएगा.
3. गुर्दे के enzymatic पाचन (जब तक अन्यथा इंगित कमरे के तापमान पर सभी कदम)
- जबकि ध्यान से गुर्दे के साथ संपर्क से बचने 5 मिलीलीटर pipettor साथ गुर्दे युक्त ट्यूब से HBSS समाधान निकालें. तत्काल Collagenase ए / pancreatin पचाने में 5 मिलीलीटर ट्यूब अगले नमूने के लिए जाने से पहले गुर्दे से युक्त करने के लिए हल के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें. गुर्दे में से प्रत्येक ट्यूब के लिए दोहराएँ.
- प्लेस ट्यूबों / एंजाइम गुर्दे के साथ 15 मिनट के लिए एक पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक nutator पर हज़म. 2 मिनट पहलेके पूरा होने पचाने में, एक ताजा प्रत्येक पचाने में प्रदर्शन किया जा रहा है के लिए 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब DNase (1 यू / एमएल) की 3 μl जोड़ें.
- जल्दी से इनक्यूबेटर से हज़म निकालने के लिए, FBS की 75 μl जोड़ने और 3 बार मिश्रण को पलटना. 2 मिनट के लिए बेंच पर खड़े चलो.
- 5 मिलीलीटर polystyrene DNase (1 यू / एमएल) युक्त जबकि शेष 0.2 मिलीलीटर सेल निलंबन और गुर्दे के पीछे छोड़ने ट्यूब सेल निलंबन की 1.4 मिलीलीटर स्थानांतरण. समाधान के अतिरिक्त 0.2 एमएल पीछे छोड़ दिया है बाह्य मैट्रिक्स के रूप में इस तरह के दोष में शामिल होंगे.
- मिक्स सेल / 10 मिनट के लिए एक पूर्व गर्म डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर 37 में एक nutator पर निलंबन DNase.
- जल्दी इनक्यूबेटर से सेल निलंबन हटाने और एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब प्रत्येक हस्तांतरण. Microfuge में 5 मिनट के लिए 325 ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन.
- सेल गोली और resuspend गोली से सतह पर तैरनेवाला 5% FBS / HBSS 1 मिलीलीटर में, निकालें pipetting और नीचे 5 से 6 बार. अगले नमूने के लिए जाने से पहले प्रत्येक ट्यूब कैप.
- 5 मिनट के लिए 325 ग्राम में एक microcentrifuge में सेल निलंबन स्पिन.
- निकालें सतह पर तैरनेवाला और अगले नमूने के लिए जाने से पहले प्रत्येक ट्यूब करने के लिए additives और टोपी ट्यूब के साथ keratinocyte सीरम मुक्त माध्यम (KSFM) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने. बाद मध्यम सभी ट्यूबों के लिए जोड़ा गया है, धीरे से ऊपर और नीचे pipetting 1ml micropipette के साथ 5 से 6 गुना से प्रत्येक कोशिका गोली resuspend. एक ताजा 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में सभी सेल निलंबन का मिश्रण.
- पूर्व गीला दो 40 माइक्रोन सेल झरनी टोपियां नमूना प्रति KSFM के साथ एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर नीचे ट्यूब पर रखा. एक 1 मिलीलीटर micropipette के साथ स्थानांतरित द्वारा एक सेल झरनी टोपी के माध्यम से सेल निलंबन दर्रा. विंदुक टिप के साथ फिल्टर को छूने से बचें. प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए और दूसरी झरनी टोपी के माध्यम से छानने का काम दोहराने. सेल झरनी टोपी निकालें और एक सामान्य 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब से एक नई टोपी के साथ की जगह.
- एक hemocytometer या अन्य fibronectin प्रति 2 सेमी 100,000-200,000 कोशिकाओं के घनत्व में लेपित संस्कृति थाली के कुओं को सेल की गिनती डिवाइस और हस्तांतरण की कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं की गणना, additives के साथ KSFM के रूप में के साथ आवश्यक गिराए. आम तौर पर, हम 10 भ्रूण कूड़े के प्रति 4.5x10 लगभग 6 कोशिकाओं निकालते हैं.
- 37 एक में कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 के साथ humidified इनक्यूबेटर.
- कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और मध्यम में 2-4 घंटे के लिए अतिरिक्त अभिकर्मकों के साथ उत्तेजना के लिए पहले संलग्न की अनुमति दें. 1 से 48 घंटे के लिए परिसर के साथ ब्याज की कोशिकाओं को उत्तेजित. पीसीआर विश्लेषण के लिए शाही सेना निर्माता के निर्देशों का पालन Qiagen RNeasy माइक्रो किट का उपयोग कर शुद्ध या नीचे दिए गए निर्देशों का पालन fluorescently कोशिकाओं immunostain.
4. प्रकोष्ठों के निर्धारण के लिए तैयारी अभिकर्मकों और Immunostaining
- 4% पीएफए तैयार: 55 में पीबीएस (v / v) में 4% paraformaldehyde भंग डिग्री सेल्सियस नियमित आंदोलन के साथ है. उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए अच्छा है. यह समाधान विषैला होता है और नामित बेकार कंटेनरों में त्याग किया जाना चाहिए.
- पीबीएस X-100 ट्राइटन जोड़ने के लिए एक 0.3% (v / v) समाधान प्राप्त करने के द्वारा permeabilization समाधान तैयार करें.
- एक ही प्रजाति के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया जा बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था से एक 5% सीरम के साथ पीबीएस में अवरुद्ध समाधान तैयार करें. उदाहरण के लिए, यदि आप विरोधी खरगोश Alexa 568 Fluor एक गधे के साथ अपने लक्ष्य प्रतिजन के खिलाफ एक खरगोश एंटीबॉडी का पता लगाने जाएगा करने के लिए, एक अवरुद्ध 5% गधा सीरम युक्त समाधान तैयार. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस
- 5% अवरुद्ध समाधान के लिए एंटीबॉडी के उपयुक्त एकाग्रता जोड़कर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है.
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तुरंत पहले उपयोग करने के लिए तैयार है. निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता में fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ परमाणु counterstain DAPI और 5% अवरुद्ध समाधान के लिए phalloidin के जैसे अन्य organelle मार्कर के साथ में जोड़ें. यदि भंडारण की आवश्यकता है, अंधेरे में 4 बजे समाधान ° उपयोग करें जब तक सी रखना.
- Immunostained कोशिकाओं के भंडारण के लिए 50% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान (v / v) तैयार करें. वैकल्पिक रूप से, Vectashield इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. प्रकोष्ठों के फिक्सेशन और Immunostaining
- निम्नलिखित प्रोटोकॉल के निर्धारण और एक 24 अच्छी तरह से थाली में NZCs धुंधला के लिए डिज़ाइन किया गया है. दी खंड के रूप में एक अच्छी तरह से एक के लिए कर रहे हैं. अभिकर्मकों धीरे सभी कक्षों की टुकड़ी से बचने चरणों के दौरान pipetted होना चाहिए, और थाली आंदोलन ऊष्मायन चरणों में अनुशंसित नहीं है.
- धीरे से एक 1 मिलीलीटर micropipette के साथ मध्यम हटाने और संलग्न संवर्धित कोशिकाओं को 4% पीएफए के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें. कमरे के तापमान पर 15 undisturbed मिनट के लिए सेते हैं.
- 4% पीएफए 0.5 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से permeabilization समाधान निकालें और जोड़ें. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
- Permeabilization समाधान निकालें और धीरे से कुल्ला प्रति पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला.
- अवरुद्ध समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें और 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- अवरुद्ध समाधान निकालें और 0.225 मिलीलीटर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें.
- 4 में 2 घंटे या रात भर के लिए कमरे के तापमान पर सेते डिग्री सेल्सियस
- प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और धीरे रीएनएसई दो बार कुल्ला प्रति पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ.
- 0.225 मिलीलीटर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें. 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में थाली सेते हैं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और धीरे से कुल्ला प्रति पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ दो बार कुल्ला.
- 50% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान (v / v) या अच्छी तरह सतह के नीचे कवर करने के लिए पर्याप्त Vectashield के 0.3 मिलीलीटर जोड़ें.
- Epifluorescence खुर्दबीन या स्टोर के साथ छवि की कोशिकाओं 4 पर पन्नी में लपेटा डिग्री सेल्सियस
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 NZCs E17.5 भ्रूण से शुद्ध थे, 2 सेमी प्रति 200,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया हुआ और 24 घंटे की कुल के लिए 37 ° C पर incubated . कक्ष एक Leica डीएम आईआरबी उल्टे immunofluorescent धुंधला से पहले माइक्रोस्कोप के साथ चरण विपरीत द्वारा imaged किया गया. (ए) संस्कृति में 24 घंटे के बाद 20X चरण NZCs के विपरीत दृश्य. (बी) कक्ष तय थे और विरोधी PAX2 खरगोश नेफ्रॉन पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी (लाल) और एक माध्यमिक Alexa Fluor 568 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश का उपयोग दाग. नोट: नीले नाभिक DAPI साथ counterstained. नेफ्रॉन progenitors के एक क्लस्टर के (सी) 40x चरण विपरीत संस्कृति में 24 घंटे के बाद (केंद्रित) दृश्य. (डी) LacZ + Foxd1 LacZ तनाव, जो Foxd1 प्रमोटर के नियंत्रण के अधीन β galactosidase व्यक्त की भ्रूण Foxd1 से अलग NZCs के 40x छवि विकासशील गुर्दे के nephrogenic क्षेत्र के भीतर stromal सेल की आबादी में व्यक्त किया है . कक्ष दाग थे एफ actin मार्कर phalloidin (ओरेगन हरी प्राथमिक संयुग्म), परमाणु दाग DAPI (ब्लू) और खरगोश विरोधी β-galactosidase के साथ - Foxd1 का पता लगाने के लिए (माध्यमिक Alexa Fluor गधा 568 विरोधी खरगोश) + stromal कोशिकाओं ( लाल).
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में हम एक विधि को अलग और संस्कृति भ्रूण गुर्दे की nephrogenic क्षेत्र से कोशिकाओं का वर्णन. यह शुरू में nephrogenic क्षेत्र (रिक्त एट अल., 2009) की कोशिकाओं पर BMP7 उपचार के प्रभाव के अध्ययन के हिस्से के रूप में प्रकाशित एक विधि का विकास है. प्रारंभिक अध्ययन में, प्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए सेल NZC आबादी के भीतर प्रतिनिधित्व प्रकार विशेषताएँ आयोजित की गई. संक्षेप में, आनुवंशिक संवाददाताओं से cortical stroma (Foxd1 + lacZ /) (. Hatini एट अल, 1996) के लिए NZCs की शुद्धि, डक्ट एकत्रित (Hoxb7 + रचनात्मक /; R26 rEYFP) यू (श्रीनिवास एट अल, 2001, एट अल . ) 2002, और टोपी (Bmp7 + lacZ /) mesenchyme (Godin एट अल, 1998) से पता चला है कि लगभग 35 प्रतिशत काटा NZCs cortical stroma हैं, 52% टोपी mesenchyme कर रहे हैं और कि डक्ट संदूषण इकट्ठा कम से कम 0.04% का प्रतिनिधित्व करता है. तनाव rEYFP R26 (Oxburgh एट अल, 2004;. श्रीनिवास एट अल, 2001) Bmp7 + / रचनात्मक का उपयोग प्रयोगों अंकन वंश से पता चला है कि NZCs का लगभग 10% टोपी mesenchyme वंश की कोशिकाओं है कि भेदभाव और खो दिया है Bmp7 अभिव्यक्ति हो सकता है . 7AAD साथ व्यवहार्यता अध्ययन एक जीवित रहने की दर लगभग 95% की पृथक NZCs में दिखाया. हमने हाल ही में NZCs भीतर प्रवाह cytometric छँटाई के माध्यम से सेल उप - जनसंख्या को अलग करने में सफलता का अनुभव है. हालांकि, झिल्ली जुड़े nephrogenic क्षेत्र के उप - जनसंख्या में से प्रत्येक के लिए विशिष्ट मार्करों की कमी इन विश्लेषण सीमित है, और वर्तमान में केवल मार्कर फ्लोरोसेंट जीन ले चूहों से ली गई कोशिकाओं संभव है.
इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता की गति पर बहुत विदारक कदम में निर्भर करता है. दोनों सेल अस्तित्व और वृद्धि कारक उत्तेजना वृद्धि जब गुर्दे enzymatic पाचन से पहले कम समय की अवधि के लिए HBSS में रहते हैं के लिए जवाबदेही. एक कम तैयारी के समय इस प्रकार उच्च सेल व्यवहार्यता और एक और अधिक मजबूत प्रतिक्रिया में दोनों परिणाम है. इसके अलावा, ध्यान जब सेल निलंबन कताई के रूप में सेल गोली आसानी से महत्वपूर्ण सेल नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप परेशान है के बाद सतह पर तैरनेवाला हटाने लिया जाना चाहिए.
क्लिफर्ड Grobstein के प्रारंभिक काम भ्रूण अंग संस्कृति (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b) का वर्णन के बाद से, गुर्दे organogenesis और विकास में उपकला और mesenchymal कोशिकाओं के बीच बातचीत के लिए एक मॉडल प्रणाली किया गया है. हाल ही microanatomic जीन की अभिव्यक्ति अध्ययन इन सेलुलर डिब्बों के प्रत्येक (Brunskill एट अल., 2008) के भीतर सेल प्रकार के एक अप्रत्याशित जटिलता से पता चला है, और NZC संस्कृति के रूप में पूरक तरीकों nephrogenesis के दौरान इन कोशिकाओं के बीच आपसी संबंध को समझने के लिए आवश्यक हैं. हमारे प्राथमिक सेल जांच के परम लक्ष्य में nephrogenic क्षेत्र कोशिकाओं को अनिश्चित काल के nephrogenesis और वयस्क में engraftment के अध्ययन के लिए दोनों किया जा सकता है इन विट्रो में विस्तार शर्तों को परिभाषित करने के लिए है. NZC संस्कृति प्रणाली इस लक्ष्य की ओर एक महत्वपूर्ण कदम है, और चल रहे अध्ययन हमारी प्रयोगशाला के उद्देश्य में इन कोशिकाओं में वृद्धि पर नियंत्रण के तंत्र को परिभाषित है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम DK078161 R01 NIDDK (LO), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एबी), स्वीडन और Kungliga Fysiografiska Sällskapet, लंड, स्वीडन (यूबी) के Wenner GREN मूलाधार से postdoctoral फैलोशिप से समर्थित किया गया था. अतिरिक्त समर्थन ऊतकविकृतिविज्ञानी, जैव सूचना विज्ञान और FACS के लिए मेन मेडिकल सेंटर अनुसंधान संस्थान कोर सुविधाएं (2P20RR18789-06 द्वारा समर्थित) और MMCRI पशु सुविधा द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
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- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
- Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. Regulation of BMP7 expression during kidney development. Development. 125, 3473-3482 (1998).
- Grobstein, C. Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse. Science. 118, 52-55 (1953).
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- Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2. Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).
- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
