Summary
在这份报告中，我们描述了一种从小鼠胚胎肾，可用于研究规范发展肾干/祖细胞的信号转导通路的祖细胞小生境的隔离和文化的方法。这些培养的细胞是高度开放的小分子和重组蛋白治疗，更重要的还的病毒转导，这使得候选人途径的有效操纵。
Abstract
胚胎发育的肾脏已被广泛研究，作为一个在器官的上皮 - 间质相互作用的模型，并获得先天性肾脏疾病的起源的认识。最近，转向幼稚走向肾命运的胚胎干细胞的可能性已在再生医学的新兴领域的探索。在小鼠的遗传研究发现肾脏发育所需的多种途径，以及最近在器官的基因转录的一个全局编录生成http://www.gudmap.org/，众多候选人监管机构提供必要的发展职能。鼠肾器官，可以在器官培养研究，许多报告都采用这种方法申请候选蛋白或撞倒使用siRNA或morpholinos的候选基因的表达分析的结果。但是，信号的研究，在发展中国家肾干/祖细胞的分化与重建的调节器官培养的适用性是有限的，作为培养器官包含一个紧凑的细胞外基质的限制大分子物质和病毒颗粒的扩散。为了研究细胞信号转导事件的影响在我们已经开发出一种主要的电池系统，建立发展中国家的肾脏上皮细胞的分化诱导剂的隔离体外肾区或祖细胞小生境的肾脏干/祖细胞的利基。利用有限的酶消化，肾区细胞可以选择性地发展E17.5肾脏中解放出来。过滤后，这些细胞可以培养使用优化条件为不规则的单层。标记基因的分析表明，这些文化含有一种类型的细胞在体内的肾区的特点的分布，并保持适当的标记基因表达的文化期间。这些细胞是高度开放的小分子和重组蛋白治疗，更重要的还的病毒转导，极大地方便了候选干/祖细胞调节作用的研究。基本细胞增殖和细胞死亡以及肾干/祖细胞在体内的特征分子标记表达的变化，如生物参数，可成功地用作实验的结果。在我们实验室正在进行的工作，使用这本小说的原电池技术的目的是发现肾干/祖细胞的自我更新与分化调控的基本机制。
Protocol
1。肾脏消化试剂的准备工作
- 1.5毫升0.25％胶原酶（W / V）和1％的胰酶消化（W / V）解决方案将需要提取肾区细胞（NZCs）从8 E17.5肾脏。由于胰酶约需2小时，溶解在室温下，足以消化预期之前应进行的实验胚胎肾人数最多的解决方案。准备消化解决方案，由先加入胶原酶25毫克到10毫升贝科的磷酸盐缓冲液（DPBS）中明确的15毫升，无菌离心管。这是至关重要的DPBS不含有钙或镁，因为这会干扰酶的消化。解散胶原酶A.添加100毫克的胰酶溶解胶原酶至少2个小时一个解决方案和组合上nutator上混合10分钟nutator的解决方案。此外，胶原酶一个/胰酶消化解决方案可以在nutator混合一夜之间在4 ° C的建议你戴上口罩，胶原酶A和胰酶分散容易进入大气层时称重，并能刺激鼻腔。
- 准备5％小牛血清（FBS）在汉克的缓冲盐溶液（HBSS）（V / V）解决方案。反相混合。 1毫升每管8肾脏将是必要的的。
- 准备补充角质细胞无血清培养，1％谷氨酰胺（V / V）和1％的青霉素，链霉素（PenStrep）（V / V）培养液中。
- 外套无菌平底聚苯乙烯组织培养板（96，48，24或6孔），人纤维连接蛋白溶液的浓度在5毫克每平方厘米表面生长2。纤维连接蛋白粉5毫克，悬浮于5毫升无菌H 2 O这是无钙或镁稀释无菌DPBS 1:25和250毫升被添加到每孔24孔板。板，然后用纤维连接蛋白溶液在室温下孵育1小时1小时在4 ° C。此外，板材可孵育过夜，4 ° C的解决方案，然后在层流罩吸气之前，除了中/细胞。
2。解剖肾和拆除胶囊（在室温下完成）
- 在E17.5，牺牲的母亲，使用您机构的动物护理和使用委员会批准的程序，切除子宫，并放置在培养皿菜含有钙和镁的DPBS。在解剖显微镜下，使用制表匠钳，每个胚胎从子宫中删除，杀头每个胚胎。一旦整个垃圾是子宫，胚胎转移到一个干净的培养皿中含有足够的钙和镁的完全覆盖尽可能多的血液和组织碎片尽可能离开背后的胚胎DPBS。
- 使用镊子，在胚胎的腹壁脐水平圆周切口。然后将胚胎在它的后面，针肩一套镊子，并从肺部取出内脏器官，使用产钳的另一组的膀胱。随着实践中，这可以做到在一个议案。应重视肾脏器官的质量背面。如果心肾不保持连接到去内脏器官，他们可以从背侧体壁小心取出。在此清扫过程中已损坏的肾脏应丢弃不适当的细胞类型，因为它们会污染最终文化。
- 轻轻挑逗远离其余的器官肾脏，照顾保持相互连接的肾脏。保持一个镊子之间的肾脏组织和抢连接到一个与其他镊子肾脏，肾上腺。肾上腺应附于肾囊。轻轻地揭下肾上腺和胶囊，远离周围的肾脏外，类似剥一根香蕉。小心不能分成两半，肾，而脱皮，并确保不损害太空舱下方的肾组织。小心删除任何剩余的胶囊，以及如果它仍是连接的输尿管。重复剩余的肾。
- 使用切转移吸管的HBSS中放入5毫升的聚苯乙烯管的肾脏。每个胚胎重复步骤2.2-2.4。肾脏可汇集每管8。随着实践，剥离和胶囊清除将需要2-3分钟，每胚胎。
3。肾脏的酶消化（除非另有说明，所有的步骤在室温）
- 从5毫升管含有一个移液器肾脏取出，一边小心翼翼地避免接触与肾脏的HBSS解决方案。立即加入1.5毫升/胰酶消化解决方案，以5毫升的试管中，然后移动到下一个样品的肾脏胶原酶。每管肾脏重复。
- 消化酶/肾的地方管上的一个预热37℃培养箱中15分钟nutator。 2分钟前完成了消化，加3μLDNA酶（1 U / ml）的一个新鲜的5毫升正在执行的每一个消化的聚苯乙烯管。
- 从孵化器中迅速取出消化，加75μL胎牛血清和颠倒3次混合。让我们站在替补2分钟。
- 1.4毫升细胞悬液转移到5毫升含有脱氧核糖核酸酶（1 U / ml）的同时留下剩余的0.2毫升细胞悬液和肾脏背后的聚苯乙烯管。额外0.2毫升的溶液，留下的将含有杂质，如细胞外基质。
- 混合细胞悬液/ DNA酶在一个预先加热的37℃培养箱10分钟nutator。
- 从孵化器迅速取出细胞悬浮液，每次1.5 mL Eppendorf管转移。细胞悬浮液在离心旋转5分钟，在325克。
- 去除上清液，细胞沉淀重新悬浮颗粒在1毫升5％FBS / HBSS中，吹打向上和向下的5至6倍。第移动到下一个样品前，每管。
- 自旋细胞悬液，离心5分钟，在325克。
- 去除上清液和添加剂每管帽筒，然后移动到下一个样品添加0.5毫升角质细胞无血清培养（KSFM）。中期后已被添加到所有的管子，轻轻向上和向下一个1毫升微量移液器5至6倍的每个细胞沉淀重悬。合并在一个新的5毫升聚苯乙烯管细胞悬液。
- 预湿40微米的细胞过滤器放置在一个5毫升的聚苯乙烯轮底部的管与每样品KSFM上限。穿过一个细胞滤网盖的细胞悬浮液，用1毫升的微量转移。避免接触过滤器枪头。流过收集和过滤重复第二滤网盖。取出细胞过滤器盖，并更换新第一个从正常的5毫升聚苯乙烯管。
- 与血球或其他细胞计数装置和转移细胞密度每平方厘米 10-20万细胞在一个纤维连接蛋白包被的培养板井的计数细胞，稀释与添加剂KSFM 。一般来说，我们检索约4.5x10 6细胞每10胚胎乱抛垃圾。
- 孵育细胞在37 ° C用5％的CO 2饱和湿度的孵化器。
- 让细胞恢复和重视在中2-4小时前，刺激额外的试剂。 1至48小时的化合物刺激细胞。 PCR分析RNA净化使用Qiagen公司的RNeasy微型工具制造商的指示，或按照以下说明，荧光免疫染色的细胞。
4。准备固定细胞的试剂和免疫染色
- 准备4％的煤灰：4％多聚甲醛的PBS（V / V）溶解在55℃，经常搅拌。冷却到室温后方可使用。这个解决方案是有毒的，应在指定的废物容器丢弃。
- 准备加入的Triton X - 100的PBS，获得0.3％（V / V）的解决方案通透的解决方案。
- 被用来提高二次抗体用于从同一品种，准备在PBS血清封闭液5％。例如，如果你对你的驴抗兔的Alexa Fluor 568靶抗原检测一个兔抗体，准备一个含有5％驴血清封闭液。保存在4 ° C。
- 准备加入适当的抗体浓度为5％阻塞解决方案的主要抗体溶液。
- 事先准备二次抗体溶液立即使用。加入荧光基团的共轭抗体制造商的推荐使用浓度与染液的DAPI核和其他细胞器，如5％封闭液的鬼笔环肽标记。如果需要存储在黑暗中，保持溶液在4 ° C，直到使用。
- 准备存储免疫染色细胞的50％甘油/ PBS溶液（V / V）。另外，可用于Vectashield。
5。固定细胞和免疫染色
- 以下协议的目的是为固定和染色24孔板NZCs。卷单井。试剂应轻轻吸管在所有步骤，以避免细胞脱离，板搅拌不建议在孵化步骤。
- 轻轻地取出1毫升微量中期和附加的培养细胞中加入0.5毫升4％的煤灰。孵育15分钟在室温下不受干扰。
- 删除4％PFA和添加0.5毫升，每孔通透的解决方案。孵育10分钟，在室温。
- 删除通透的解决方案，并轻轻漂洗，用0.5毫升PBS，每冲洗两次。
- 加入封闭液0.5毫升，在室温下孵育60分钟。
- 去除阻塞的解决方案，并添加0.225毫升的主要抗体溶液。
- 在室温下孵育2小时或过夜，4 ° C。
- 删除的主要抗体的解决方案，并轻轻地里NSE两次用0.5毫升PBS，每冲洗。
- 添加0.225毫升二级抗体溶液。在室温下孵育60分钟，在黑暗中板。
- 拆下二次抗体溶液，轻轻漂洗，用0.5毫升PBS，每冲洗两次。
- 加入0.3毫升50％甘油/ PBS溶液（V / V）或足够的Vectashield覆盖以及表面的底部。
- epifluorescence显微镜或存储的图像细胞包裹在铝箔在4 ° C
6。代表性的成果
图1。NZCs从E17.5胚胎纯化，镀在每平方厘米 20万细胞，并在37 ° C培养24小时。细胞成像阶段的Leica DM IRB倒置显微镜，免疫荧光染色前的对比。 （一）20X阶段NZCs对比查看文化在24小时后。 （二）固定细胞染色用一只兔子反PAX2抗体具体肾祖细胞（红色）和次要的Alexa Fluor 568标记的驴抗兔。请注意蓝色细胞核用DAPI counterstained。 （三）40X阶段对比查看肾祖群（中心）文化在24小时后。 （四）40X LacZ的Foxd1 LacZ的应变，这表示Foxd1启动子的控制下的β-半乳糖苷酶的胚胎。Foxd1隔离NZCs形象表达基质细胞内的发展肾肾区人口。细胞染色的F -肌动蛋白标记的鬼笔环肽（俄勒冈州的绿色小学共轭），核染色的DAPI（蓝色）和兔抗β-半乳糖苷酶-检测Foxd1（次要的Alexa Fluor驴抗兔568）+基质细胞（红色）。
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Discussion
在这个协议中，我们描述了一种方法，从胚胎肾肾区细胞分离和培养。这是最初作为一个肾区（空白等，2009）研究细胞BMP7治疗的效果的一部分出版了方法的发展。在最初的研究中，进行了一系列的实验来表征细胞内的NZC人口代表类型。简单地说，从遗传记者NZCs皮质基质（+ / lacZ的 Foxd1）（Hatini等 ，1996）的净化，收集管（HOXB7 + / CRE; R26 的 rEYFP）（Srinivas等，2001;于等 。 ，2002），第间质细胞（+ / lacZ的 BMP7）（戈丁等人，1998年）显示，大约有35％的收获NZCs皮质基质，52％是第间质细胞，并收集管污染小于0.04％ 。天堂标记实验中使用的BMP7 + / CRE; rEYFP（Oxburgh R26的应变等，2004;。Srinivas等 ，2001）表明，约10％NZCs的可能是第间质细胞谱系的分化和丢失BMP7表达的细胞。与7AAD的可行性研究显示，约95％的孤立NZCs a生存率。最近，我们经验丰富的内，NZCs通过分离细胞亚群流式细胞仪排序的成功。但是，具体到每个肾区亚群膜相关标记的缺乏限制了这些分析，目前仅来自带有荧光标记基因的小鼠的细胞是可行的。
本议定书的疗效取决于速度大大，在解剖步骤。这两种细胞的存活和生长因子刺激增加肾脏酶消化前较短的时间内保持在HBSS中的反应。一个较短的准备时间，从而导致较高的细胞活力和更强有力的反应。此外，必须小心取出时纺纱细胞悬液后，细胞沉淀很容易干扰造成显着的细胞损失上清。
肾脏克利福德Grobstein初步描述胚胎器官培养（Grobstein，1953a，1953b; Grobstein）的工作以来，一直是器官和发展中的上皮和间质细胞之间的相互作用的模型系统。最近显微基因表达的研究揭示了一个意想不到的复杂类型的细胞内这些细胞每个车厢（Brunskill等，2008），互补的方法，如NZC文化需要了解这些细胞之间的相互关系在nephrogenesis。我们的主要细胞调查的最终目标是定义在肾区细胞可以无限期地在体外扩大nephrogenesis和成人植入的研究条件。 NZC文化系统是朝着这一目标迈出的重要一步，在我们的实验室的目的正在进行的研究来定义这些细胞的生长控制机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持R01 DK078161 NIDDK（LO），美国心脏协会（AB），瑞典和Kungliga Fysiografiska Sällskapet，隆德，瑞典（UB）温纳 - 格伦基金会博士后奖学金。缅因州医疗中心研究所的核心设施，病理组织学，生物信息学和流式细胞仪（2P20RR18789 - 06支持）和MMCRI动物基金提供了额外的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
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