Summary
Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour l'isolement et la culture de la niche de cellules progénitrices du rein d'embryon de souris qui peuvent être utilisées pour étudier les voies de signalisation réglementant cellules souches / progénitrices du rein en développement. Ces cellules cultivées sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui permet une manipulation efficace des voies candidat.
Abstract
Le développement embryonnaire du rein a été largement étudié à la fois comme un modèle pour l'interaction épithélio-mésenchymateuse dans l'organogénèse et d'acquérir la compréhension des origines de la maladie rénale congénitale. Plus récemment, la possibilité de piloter naïve cellules souches embryonnaires vers des destins néphrogénique a été explorée dans le domaine émergent de la médecine régénérative. Des études génétiques chez la souris ont identifié plusieurs voies nécessaires pour le développement du rein, et un catalogue global de la transcription du gène dans l'organe a été récemment générées http://www.gudmap.org/ , offrant de nombreux régulateurs candidat des fonctions essentielles de développement. L'organogenèse du rein chez les rongeurs peuvent être étudiés en culture d'organe, et de nombreux rapports ont utilisé cette approche pour analyser les résultats des deux protéines appliquant candidat ou faire tomber l'expression de gènes candidats en utilisant siRNA ou morpholinos. Cependant, l'applicabilité de la culture d'organes pour l'étude de la signalisation qui régule la tige / différenciation de cellules progénitrices de renouvellement par rapport au niveau du rein en développement est limité en tant qu'organes de culture contenant une diffusion matrice compacte limitant extracellulaire des macromolécules et des particules virales. Pour étudier la signalisation cellulaire des événements qui influencent la tige / niche de cellules progénitrices dans les reins, nous avons développé un système de cellules primaires qui établit la zone néphrogénique ou une niche de cellules progénitrices de l'ex vivo du rein en développement dans l'isolement de l'inducteur de la différenciation épithéliale. En utilisant la digestion enzymatique limitée, les cellules de zone néphrogénique peut être sélectivement libérée de développer reins à E17.5. Après filtration, ces cellules peuvent être cultivées comme une monocouche irrégulière en utilisant des conditions optimisées. L'analyse du gène marqueur démontre que ces cultures contiennent une distribution des types cellulaires caractéristiques de la zone néphrogénique in vivo, et qu'ils maintiennent l'expression du gène marqueur approprié pendant la période de culture. Ces cellules sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui facilite grandement l'étude de la candidate souches / progéniteurs effets régulateur de la cellule. Paramètres biologiques de base cellulaires comme la prolifération et mort cellulaire ainsi que des changements dans l'expression des marqueurs moléculaires caractéristiques de néphrons cellules souches / progénitrices in vivo peuvent être utilisés avec succès comme les résultats expérimentaux. Les travaux en cours dans notre laboratoire en utilisant cette technique de cellules primaires roman vise à découvrir les mécanismes de base régissant la réglementation de l'auto-renouvellement versus différenciation dans les néphrons cellules souches / progénitrices.
Protocol
1. La préparation de réactifs pour la digestion rein
- 1,5 ml de collagénase 0,25% A (p / v) et 1% Pancréatine digérer (w / v) sera nécessaire pour l'extraction des cellules de zone néphrogénique (NZCS) à partir de 8 E17.5 reins. Parce Pancréatine dure environ 2 heures pour dissoudre à la température ambiante, assez condensé solution pour le plus grand nombre de reins embryonnaires attendus doivent être réalisés avant l'expérience. Préparer digérer solution en ajoutant d'abord 25 mg de collagénase A à 10 ml de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) dans un clair 15 ml, tube à centrifuger stérile. Il est essentiel que le DPBS ne contient pas de calcium ou de magnésium car cela va interférer avec la digestion enzymatique. Mélanger une solution sur un nutator pendant 10 minutes afin de dissoudre la collagénase A. Ajouter 100 mg de pancréatine à la collagénase dissous une solution et mélanger sur un nutator pendant au moins 2 heures. Alternativement, la collagénase A / Pancréatine digérer solution peut être mélangée sur un nutator nuit à 4 ° C. Il est recommandé de porter un masque, comme la collagénase A et pancréatine se dispersent facilement dans l'atmosphère lors de la pesée et peut irriter les voies nasales.
- Préparer un 5% de sérum bovin fœtal (FBS) (v / v) dans de Hank solution saline tamponnée (HBSS). Renverser pour mélanger. 1 ml pour chaque tube de 8 reins seront nécessaires.
- Préparer un milieu de culture des kératinocytes en complétant milieu sans sérum avec de la glutamine à 1% (v / v) et 1% de pénicilline-streptomycine (Penstrep) (v / v).
- Manteau stériles à fond plat des plaques de polystyrène de culture de tissu (96, 48, 24 ou 6 puits) avec une solution de fibronectine humaine à une concentration de 5 mg par cm 2 de surface de croissance. 5 mg de poudre de fibronectine est remis en suspension dans 5 ml de H 2 O. stériles Ceci est diluée dans du DPBS 01:25 stériles sans calcium ni magnésium et 250 ml est ajouté à chaque puits d'une plaque à 24 puits. Les plaques sont ensuite incubés avec une solution de fibronectine à la température ambiante pendant 1 heure, puis 1 heure à 4 ° C. Sinon, les plaques peuvent être incubés une nuit à 4 ° C. La solution est ensuite aspirée dans une hotte à flux laminaire avant l'addition de milieu / cellules.
2. Reins dissection & Capsules Suppression (effectué à température ambiante)
- À E17.5, le sacrifice de la mère à l'aide d'une procédure approuvée par vos soins des animaux et du Comité institutionnel utilisation, enlever l'utérus, et le placer dans une boîte de Pétri contenant du DPBS avec le calcium et le magnésium. Sous un microscope à dissection, l'utilisation des horlogers pince pour retirer chaque embryon de l'utérus et décapitent chaque embryon. Une fois la litière est entièrement hors de l'utérus, le transfert des embryons à un plat propre de Pétri contenant du DPBS suffisamment de calcium et de magnésium pour couvrir entièrement les embryons laissant derrière autant de sang et de débris de tissu que possible.
- En utilisant des pinces, faire une incision circulaire dans la paroi abdominale de l'embryon au niveau de l'ombilic. Ensuite, placez l'embryon sur son dos, il épingler au niveau des épaules avec un jeu de pinces, et enlever les organes internes des poumons vers le bas de la vessie à l'aide l'autre jeu de pinces. Avec la pratique cela peut être fait en un seul mouvement. Les reins doivent être attachés à l'arrière de la masse des organes. Si les reins ne restent pas attachés à des organes éviscérés, ils peuvent être soigneusement retiré de la paroi dorsale du corps. Reins qui ont été endommagés au cours de ce processus de dissection doivent être jetés car ils contaminer la culture finale avec les types de cellules inappropriée.
- Doucement taquiner loin les reins du reste des organes, en prenant soin de maintenir les reins reliés les uns aux autres. Tenez le tissu entre les reins avec un jeu de pinces et de saisir la glande surrénale attaché à l'un des reins avec la pince d'autres. La glande surrénale doit être attaché à la capsule du rein. Décoller doucement la glande surrénale et de la capsule loin autour de l'extérieur du rein, similaire à éplucher une banane. Prenez soin de ne pas diviser le rein de moitié pendant l'épluchage, et être sûr de ne pas endommager le tissu rénal sous la capsule. Retirez délicatement la capsule restante ainsi que l'uretère si elle est encore attaché. Répéter avec le rein restant.
- Utiliser une pipette de transfert coupées de placer les reins dans un tube en polystyrène de 5 ml de HBSS. Répétez les étapes 02.02 à 02.04, pour chaque embryon. Les reins peuvent être regroupées 8 par tube. Avec l'élimination pratique, la dissection et la capsule se prendre 2-3 minutes par embryon.
3. Digestion enzymatique des reins (toutes les étapes à température ambiante sauf indication contraire)
- Retirer solution HBSS de 5 ml contenant les tubes des reins avec une pipette tout en évitant soigneusement le contact avec les reins. Immédiatement ajouter 1,5 ml de collagénase A / Pancréatine digérer solution au tube de 5 ml contenant reins avant de passer à l'échantillon suivant. Répétez l'opération pour chaque tube de reins.
- Placer les tubes avec l'enzyme / reins digère sur un nutator dans un pré-chauffé 37 incubateur ° C pendant 15 minutes. 2 minutes avantachèvement de la digestion, ajouter 3 ul de DNase (1 U / ml) à un tube de polystyrène frais 5 ml pour chaque méthode de digestion en cours d'exécution.
- Enlever rapidement les digère de l'incubateur, ajouter 75 ul de FBS et inverser 3 fois pour mélanger. Laisser reposer sur le banc pour 2 minutes.
- Transfert de 1,4 ml de la suspension cellulaire sur le tube de polystyrène de 5 ml contenant la DNase (1 U / ml) tout en laissant le reste 0,2 ml de suspension cellulaire et les reins en arrière. Le supplément de 0,2 mL de la solution sera laissé derrière contenir des impuretés telles que la matrice extracellulaire.
- Suspension cellulaire Mix / DNase sur un nutator dans un 37 pré-chauffé ° C incubateur pendant 10 minutes.
- Enlever rapidement les suspensions cellulaires de l'incubateur et le transfert de chaque à un tube Eppendorf de 1,5 ml. Spin suspensions cellulaires dans microcentrifugeuse à 325 g pendant 5 minutes.
- Retirer le surnageant de culot cellulaire et remettre le culot dans 1 ml de 5% de FBS / HBSS, aspiration et refoulement 5 à 6 fois. Cap chaque tube avant de passer à l'échantillon suivant.
- Spin suspensions cellulaires dans une microcentrifugeuse à 325 g pendant 5 minutes.
- Retirer le surnageant et ajouter 0,5 ml de kératinocytes milieu sans sérum (KSFM) avec des additifs pour chaque tube et le tube de la PAC avant de passer à l'échantillon suivant. Après support a été ajouté à tous les tubes, doucement resuspendre chaque culot cellulaire par aspiration et une baisse de 5 à 6 fois avec une micropipette 1ml. Combiner tous les suspensions de cellules dans un tube de polystyrène frais 5 ml.
- Pré-humides deux cellules de 40 microns-crépine bouchons placés sur un tube de 5 ml en polystyrène inférieure ronde avec KSFM par échantillon. Passe suspensions cellulaires à travers un bouchon tamis cellulaire en transférant avec une micropipette 1 ml. Évitez de toucher le filtre avec la pointe de la pipette. Recueillir accréditives et répétez la filtration à travers le bouchon crépine secondes. Retirez le bouchon filtre cellulaire et la remplacer par une nouvelle PAC à partir d'un tube de polystyrène normal 5 ml.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre ou autre cellule dispositif de comptage et de cellules de transfert à des puits d'une plaque de culture revêtues de fibronectine à une densité de 100.000-200.000 cellules par cm 2, diluer au besoin avec des KSFM avec des additifs. Généralement, nous récupérons environ 4.5x10 6 cellules par 10 litières embryon.
- Incuber les cellules dans un 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2.
- Laisser les cellules de récupérer et de joindre pour 2-4 heures en moyenne avant la stimulation avec des réactifs supplémentaires. Stimuler les cellules avec un composé d'intérêt de 1 à 48 heures. Purifier l'ARN pour l'analyse PCR en utilisant le kit Qiagen RNeasy Micro suivant les instructions du fabricant ou suivez les instructions ci-dessous pour fluorescence immunocoloration des cellules.
4. La préparation de réactifs pour la fixation des cellules et Immunocoloration
- Préparer 4% PFA: Dissoudre 4% de paraformaldéhyde dans du PBS (v / v) à 55 ° C avec agitation régulière. Laisser refroidir à température ambiante avant utilisation. Cette solution est toxique et doit être jeté dans des conteneurs des déchets désignés.
- Préparer la solution de perméabilisation en ajoutant Triton X-100 à PBS pour obtenir une solution de 0,3% (v / v).
- Préparer une solution à 5% de blocage en PBS avec du sérum de la même espèce que celle utilisée pour élever l'anticorps secondaire à être utilisé. Par exemple, si vous voulez détecter un anticorps de lapin contre votre antigène cible avec un âne anti-lapin Alexa Fluor 568, préparer une solution de blocage contenant du sérum d'âne de 5%. Conserver à 4 ° C.
- Préparer la solution d'anticorps primaire par l'ajout de la concentration appropriée d'anticorps à la solution de blocage de 5%.
- Préparer une solution d'anticorps secondaire immédiatement avant l'utilisation. Ajouter anticorps fluorophore conjugué à la concentration recommandée par le fabricant en collaboration avec l'industrie nucléaire au DAPI Counterstain et d'autres marqueurs tels que organite phalloïdine à la solution de 5% de blocage. Si le stockage est nécessaire, garder solution dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer glycérol à 50% / solution de PBS (v / v) pour le stockage de cellules immunocolorés. Alternativement, Vectashield peuvent être utilisés.
5. Fixation des cellules et Immunocoloration
- Le protocole suivant est destiné à la fixation et la coloration des NZCS dans une plaque à 24 puits. Les volumes sont donnés pour un seul puits. Les réactifs doivent être délicatement la pipette pendant toutes les étapes pour éviter le détachement des cellules, et l'agitation plaque n'est pas recommandé dans les étapes d'incubation.
- Retirer délicatement moyenne avec une micropipette de 1 ml et ajoutez 0,5 ml de 4% à la PFA attachés cellules cultivées. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante non perturbée.
- Retirer PFA 4% et ajouter 0,5 ml par puits d'une solution de perméabilisation. Incuber 10 minutes à température ambiante.
- Retirer solution de perméabilisation et rincer doucement à deux reprises avec 0,5 ml de PBS par rinçage.
- Ajouter 0,5 ml de solution de blocage et incuber à température ambiante pendant 60 minutes.
- Retirer la solution de blocage et ajouter 0,225 ml de solution d'anticorps primaire.
- Incuber à température ambiante pendant 2 heures ou toute la nuit à 4 ° C.
- Retirer solution d'anticorps primaire et doucement rinse à deux reprises avec 0,5 ml de PBS par rinçage.
- Ajouter 0,225 ml de solution d'anticorps secondaire. Incuber la plaque dans l'obscurité à température ambiante pendant 60 minutes.
- Retirer solution d'anticorps secondaire et rincer doucement à deux reprises avec 0,5 ml de PBS par rinçage.
- Ajouter 0,3 ml de glycérol à 50% / PBS solution (v / v) ou Vectashield suffisante pour couvrir le fond du puits de surface.
- Cellules d'image avec microscope à épifluorescence ou stocker enveloppés dans une feuille à 4 ° C.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1. NZCS ont été purifiés à partir de E17.5 embryons, plaquées à 200 000 cellules par cm 2 et incubées à 37 ° C pour un total de 24 heures. Les cellules ont été imagés par contraste de phase avec un microscope Leica DM IRB inversé avant coloration par immunofluorescence. (A) 20X vue contraste de phase de NZCS après 24 heures dans la culture. (B) Les cellules ont été fixées et colorées avec un anticorps de lapin anti-PAX2 anticorps spécifique pour les cellules progénitrices néphron (rouge) et un secondaire Alexa Fluor 568 ânes conjugué anti-lapin. Remarque noyaux bleus de contraste avec le DAPI. (C) vue 40x à contraste de phase d'un cluster de progéniteurs néphron (centrée) après 24 heures de culture. (D) l'image de la 40X NZCS isolée de LacZ + embryons de la souche Foxd1 LacZ, qui exprime β-galactosidase sous le contrôle du promoteur Foxd1. Foxd1 est exprimé dans la population de cellules stromales dans la zone néphrogénique du rein en développement. Les cellules ont été colorés avec la phalloïdine F-actine marqueur (Oregon Green primaires conjugués), le nucléaire au DAPI tache (bleu) et de lapin anti-β-galactosidase (secondaire - Alexa Fluor âne anti-lapin 568) pour la détection de cellules stromales Foxd1 + ( rouge).
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler et cultiver les cellules de la zone néphrogénique du rein embryonnaire. Il est le développement d'une méthode initialement publié dans le cadre d'une étude sur les effets des traitements sur les cellules BMP7 de la zone néphrogénique (Blank et al., 2009). Dans l'étude initiale, une série d'expériences visant à caractériser les types de cellules représentées au sein de la population NZC ont été menées. Brièvement, la purification de NZCS des journalistes génétique pour le stroma cortical (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini et al, 1996), tube collecteur (Hoxb7 + / cre; R26 rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), et une casquette mésenchyme (BMP7 + / lacZ) (Godin et al., 1998) a révélé qu'environ 35% des NZCS récoltés sont stroma cortical, 52% sont mésenchyme bouchon et que la collecte de la contamination conduit représente moins de 0,04%. Lineage marquant expériences utilisant le BMP7 + / cre; R26 rEYFP souche (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) a montré que 10% environ de NZCS peuvent être des cellules de la lignée mésenchyme bouchon qui se sont différenciés et ont perdu l'expression BMP7 . Des études de viabilité avec 7AAD a montré un taux de survie dans NZCS isolée d'environ 95%. Nous avons récemment connu le succès dans la séparation des sous-populations de cellules au sein NZCS grâce au tri par cytométrie en flux. Toutefois, la rareté des associés à la membrane des marqueurs spécifiques à chacun des sous-populations de la zone néphrogénique a limité ces analyses, et les cellules actuellement uniquement issus de souris porteuses de gènes marqueurs fluorescents est faisable.
L'efficacité de ce protocole dépend fortement de la vitesse à l'étape de dissection. La survie des cellules et la réactivité à la fois augmenter la stimulation du facteur de croissance lorsque les reins restent dans HBSS pour de courtes périodes de temps avant que la digestion enzymatique. Un temps plus courte préparation des résultats ainsi à la fois de la viabilité cellulaire et plus d'une réponse plus robuste. Par ailleurs, des précautions doivent être prises lors du retrait du surnageant après la filature de la suspension de cellules que le culot cellulaire est facilement perturbée entraînant une perte cellulaire significative.
Depuis les travaux initiaux de Clifford Grobstein décrivant la culture d'organes embryonnaires (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b), le rein a été un système modèle pour l'organogenèse et l'interaction entre les cellules épithéliales et mésenchymateuses dans le développement. Microanatomic récentes études d'expression génique ont révélé une complexité imprévue des types de cellules au sein de chacun de ces compartiments cellulaires (Brunskill et al., 2008), et des méthodes complémentaires telles que la culture NZC sont nécessaires pour comprendre l'interrelation entre ces cellules au cours néphrogenèse. Le but ultime de nos enquêtes de cellules primaires est de définir les conditions dans lesquelles les cellules de zone néphrogénique peut être indéfiniment élargi in vitro, tant pour les études des greffes et des néphrogenèse chez l'adulte. Le système de culture NZC est une étape importante vers cet objectif, et les études en cours dans notre laboratoire visent à définir les mécanismes de contrôle de la croissance dans ces cellules.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par R01 DK078161 du NIDDK (LO), bourses de recherche postdoctorale de l'American Heart Association (AB), les Fondations Wenner-Gren de la Suède et Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suède (UB). Un soutien additionnel a été fourni par le Maine Medical Center Research installations essentielles Institut pour l'histopathologie, la bioinformatique et FACS (soutenu par 2P20RR18789-06) et l'animalerie MMCRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
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- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution. Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).
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- Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population. Development. 131, 4593-4605 (2004).
- Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).
- Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney. Development. 129, 5301-5312 (2002).
