Summary
本報告書では、発展途上腎臓の幹細胞/前駆細胞を調節するシグナル伝達経路を研究するために使用できるマウス胎児の腎臓から前駆細胞のニッチの分離と培養のための方法を説明します。これらの培養細胞は、候補の経路の効率的な操作を可能にする、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことは、ウイルス形質導入に非常にアクセス可能です。
Abstract
腎臓の胚発生は広範囲に器官形成における上皮 - 間葉相互作用のモデルとして、先天性腎臓病の起源の理解を得るために両方が検討されている。さらに最近では、腎性運命に向かってナイーブな胚性幹細胞をステアリングの可能性は、再生医療の新たな分野で検討されている。マウスの遺伝学的研究は、腎臓の開発に必要ないくつかの経路を同定し、そして臓器における遺伝子転写のグローバルカタログは最近生成されてhttp://www.gudmap.org/~~V 、本質的な発達機能の多数の候補のレギュレータを提供しています。げっ歯類の腎臓の器官形成は、器官培養で検討することができる、と多くの報告は、どちらかの候補タンパク質を適用したり、siRNAまたはモルフォを使用して候補遺伝子の発現をノックダウンの成果を分析するためにこのアプローチを使用している。培養臓器が巨大分子及びウイルス粒子の拡散を制限するコンパクトな細胞外マトリックスを含んでいるのでしかし、発展途上腎臓における幹細胞/前駆細胞の分化に対する更新を制御するシグナル伝達の研究に器官培養の適用性が制限されています。腎臓に幹細胞/前駆細胞のニッチに影響を与えるイベントを細胞シグナル伝達を研究するために我々は、分化の上皮誘導因子から独立して開発する腎臓のex vivoでの腎性ゾーンまたは前駆細胞のニッチを確立する主要な細胞システムを開発した。制限酵素消化を用いて、腎性ゾーンの細胞はE17.5で腎臓の開発と選択的に解放することができます。ろ過に続いて、これらの細胞は最適化された条件を使用して不規則な単層として培養することができる。マーカー遺伝子の解析は、これらの培養物は、in vivoでの腎性ゾーンの特性の細胞型の分布を含んでいること、そして彼らは培養期間中に適切なマーカー遺伝子の発現を維持することを示している。これらの細胞は、小分子および組換えタンパク質の治療に、そして重要なことにも大いに候補幹細胞/前駆細胞の調節効果の研究を容易にウイルスの伝達、に非常にアクセス可能です。このような増殖と細胞死だけでなく、in vivoでのネフロンの幹細胞/前駆細胞の特徴的分子マーカーの発現の変化などの基本的な細胞生物学的パラメータは正常に実験的な成果として使用することができます。この小説の主細胞技術を用いて、我々の研究室で進行中の作業は、ネフロンの幹細胞/前駆細胞の自己再生対分化の調節を支配する基本的なメカニズムを解明することを目指しています。
Protocol
1。腎臓の消化のために試薬の準備
- 0.25％コラゲナーゼ1.5mlを（w / v）の、1％パンクレアチンダイジェスト（w / v）の溶液を8 E17.5腎臓から腎性ゾーンの細胞（NZCs）の抽出に必要となります。パンクレアチンは、室温で溶解するために約2時間がかかるため、十分な事前実験になされるべきであると予想胚腎臓の最大の数のためのソリューションを消化。第一10ミリリットルダルベッコのリン酸にコラゲナーゼ25mgの追加することで、ダイジェストの溶液を調製する明確な15ミリリットル、滅菌遠心管に（DPBS）緩衝生理食塩水。これは酵素消化を妨害するため、DPBSは、カルシウムやマグネシウムが含まれていないことが重要です。コラゲナーゼA.が溶解するコラゲナーゼに少なくとも2時間nutatorに関するソリューションとミックスをパンクレアチン100 mgを追加溶解するために10分間nutator上でソリューションを混ぜる。また、コラゲナーゼ/パンクレアチン消化液を4℃で一晩nutator上に混在することができますそれはコラゲナーゼはとパンクレアチン、計量と鼻腔を刺激する際に大気中に容易に分散させるように、マスクを着用することをお勧めします。
- ハンクス緩衝生理食塩溶液（HBSS）で5％ウシ胎児血清（FBS）（v / v）の溶液を調製します。ミックスに反転。 8腎臓の各チューブに1 mlは必要になります。
- 1％グルタミン（v / v）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PenStrep）（v / v）でケラチノサイト無血清培地を補充することによって培養液を準備します。
- 成長表面の1cm 2あたり5mgの濃度で、ヒトフィブロネクチン溶液によるコーティング滅菌平底ポリスチレン組織培養プレート（96、48、24またはウェル6）。フィブロネクチン粉末5mgを滅菌H 2 Oの5 mlに再懸濁されているこれは、カルシウムまたはマグネシウムなしで滅菌DPBSで午前1時25分を希釈し、250mlを24ウェルプレートの各ウェルに追加されます。プレートはその後、4℃あるいはで1時間に続いて1時間室温でフィブロネクチン溶液と共にインキュベートされ、プレートを4℃で一晩インキュベートすることができます℃の溶液は、次いで、層流フードで吸引する前に培地/のほかに細胞。
2。解剖腎臓＆削除カプセル（室温で行わ）
- E17.5で、、あなたの動物実験使用の委員会によって承認された手順を使用して、母を犠牲に子宮を除去し、カルシウムとマグネシウムとのDPBSを含むペトリ皿に入れてください。解剖顕微鏡下では、子宮からそれぞれの胚を削除し、それぞれの胚を斬るために時計製作の鉗子を使用する。全体のゴミが子宮外になると、完全に可能な限り多くの血液と組織の残骸として残して胚をカバーするために、カルシウムとマグネシウムとの十分なDPBSを含むクリーンなシャーレに胚を移す。
- 鉗子を使用して、臍のレベルでの胚の腹壁に円周切開を行います。その後、その背中に胚を置いて鉗子の一組で肩でそれを突き止める、と鉗子の他のセットを使用して膀胱に肺から内臓を取り除く。練習すればこれは1つの動きで行うことができます。腎臓は、臓器の質量の背面に接続する必要があります。腎臓がeviscerated臓器に接続されたままにしない場合、それらは慎重に背側体壁から削除することができます。それらが不適切な細胞型で、最終的な文化を汚染するので、この解剖の過程で損傷した腎臓は破棄されるべきである。
- ゆっくりとお互いに接続されている腎臓を保つように注意しながら、臓器の残りの部分から腎臓を離れていじめる。鉗子の一組と腎臓の間の組織を持ち、他の鉗子で腎臓の1つに接続副腎をつかむ。副腎は腎臓のカプセルに接続する必要があります。静かにバナナの皮をむくと似て離れて腎臓の外側から副腎やカプセル、皮。剥離しながら半分に腎臓を分割しないように注意してください、そしてカプセルの下に腎組織を損傷しないようにしてください。それがまだアタッチされている場合、慎重に、残りのカプセルだけでなく、尿管を取り外します。残りの腎臓を繰り返します。
- HBSSの5 mlのポリスチレンチューブに腎臓を配置するカット転送ピペットを使用してください。各胚のためのステップ2.2から2.4を繰り返します。腎臓は、チューブ当たり8をプールすることが。練習すれば、解剖やカプセル除去は、胚当たり2〜3分かかります。
3。腎臓の酵素消化（特に断りのない限り常温、すべてのステップ）
- 慎重に腎臓との接触を避けながら、ピペッターで腎臓を含む5 mlチューブからHBSS溶液を除去。すぐに次のサンプルに移動する前に、腎臓を含む5 mlのチューブにコラゲナーゼA /パンクレアチン消化物の溶液1.5mlを加える。腎臓の各チューブに対して繰り返します。
- 酵素/腎臓のある場所のチューブは、15分間予め温めておいた37℃のインキュベーターでnutatorにダイジェスト。 2分前にダイジェストの完了は、実行されるごとにダイジェスト用の新鮮な5mlのポリスチレンチューブにDNaseの3μlを（1 U / ml）を加える。
- 迅速に削除するインキュベーターからダイジェストを、FBSの75μlを加え、混ぜるを3回転倒。 2分間のベンチに放置。
- 背後にある残りの0.2ミリリットルの細胞懸濁液と腎臓を残したままのDNase（1 U / ml）を含む5 mlのポリスチレンチューブに細胞懸濁液1.4 mlを。残された解決策の追加の0.2mLのは、このような細胞外マトリックスなどの不純物が含まれます。
- 予め温めておいた37のnutatorのミックス細胞懸濁液/ DNaseは℃で10分間インキュベーター。
- すぐにインキュベーターから細胞懸濁液を除去し、1.5mlのエッペンドルフチューブにそれぞれ転送します。 5分間325グラムで、マイクロの細胞懸濁液をスピン。
- 5〜6回のピペッティング5％FBS / HBSS、1 mlに細胞ペレットを再懸濁しますペレットから上清を取り除く。次のサンプルに移動する前に、各チューブにフタを。
- 5分間325グラムで、微量遠心機で細胞懸濁液をスピン。
- 上清を除去し、次のサンプルに移動する前に、各チューブに添加し、キャップのチューブでケラチノサイト無血清培地（KSFM）0.5 mlを加える。培地はすべてのチューブに追加された後、軽く1ミリリットルマイクロピペットで5〜6回ピペッティングすることにより、各細胞ペレットを再懸濁します。新鮮な5mlのポリスチレンチューブ内のすべての細胞懸濁液を組み合わせる。
- サンプルあたりKSFMで5 mlのポリスチレン丸底チューブに置かれたプリウェット2つの40ミクロンセルストレーナーキャップ。 1 mlのマイクロピペットで転送することにより、一つのセルストレーナーキャップを介して細胞懸濁液を渡します。ピペットの先端でフィルターに触れないようにしてください。フロースルーを収集すると第二ストレーナーキャップを通してろ過を繰り返す。セルストレーナーのキャップを取り外し、通常の5 mlのポリスチレンチューブから新しいキャップと交換してください。
- 添加剤とKSFMで必要に応じて希釈し、血球計算盤または1cm 2当たり10万個の細胞の密度で、フィブロネクチンコート培養プレートのウェルに、デバイスとの転送の細胞をカウントする他の細胞と細胞を数える。一般的に、我々は10胚の腹当たり約4.5x10 6個の細胞を取り出す。
- 5％CO 2で37℃の加湿インキュベーターで細胞をインキュベート。
- 細胞が回復し、追加の試薬で刺激前に培地中で2〜4時間のために添付することができます。 1〜48時間のために関心のある化合物で細胞を刺激する。製造元の指示に従ってキアゲンしたRNeasyマイクロキットを用いてPCR分析のためのRNAを精製または蛍光細胞を免疫染色するには、以下の手順に従ってください。
4。細胞を固定するための試薬を準備し、免疫染色
- 4％PFAを準備：55でPBS（v / v）を4％パラホルムアルデヒドを溶解し、° Cの正規撹拌しながら。使用前に室温に冷却してください。このソリューションは、毒性があり、指定された廃棄物容器に破棄する必要があります。
- 0.3％（v / v）の溶液を得たPBSにトリトンX - 100を追加することにより透過液を準備します。
- 使用する二次抗体を発生させるために使用されたものと同じ種からの血清を含むPBSで5％ブロッキング溶液を準備します。あなたがロバ抗ウサギのAlexa Fluor 568であなたの標的抗原に対するウサギの抗体を検出する場合たとえば、5％ロバ血清を含むブロッキング溶液を準備。 4℃で保存します。
- ブロッキング溶液は5％に抗体の適切な濃度を追加することによって、一次抗体溶液を準備します。
- 使用直前に二次抗体溶液を準備します。核対比DAPIとこのようなブロッキング溶液：5％〜ファロイジンなど、他のオルガネラマーカーと一緒にメーカーの推奨濃度で蛍光物質標識抗体を追加。ストレージが必要な場合は、4℃、暗所で解決策を保つ° Cを使用するまで。
- 免疫染色の細胞の保存のため50％グリセロール/ PBS溶液（v / v）を準備する。また、Vectashieldを使用することができます。
5。細胞の固定と免疫染色
- 以下のプロトコールは24ウェルプレートでNZCsの固定と染色のために設計されています。与えられたボリュームは、単一のよくのためのものです。試薬は、穏やかに細胞の剥離を避けるために、全てのステップにおいて、ピペッティングされるべきである、とプレートの攪拌は、インキュベーションのステップで推奨されていません。
- ゆっくりと1 mlのマイクロピペットで培地を除去し、接続された培養細胞を4％PFAの0.5 mlを加える。室温で静かに15分間インキュベートする。
- 4パーセントのPFAを取り外し、0.5 mlあたりもの透過液を加える。室温で10分間インキュベートする。
- 透過溶液を除去し、穏やかにリンス当たりPBS 0.5mlを二回すすいでください。
- ブロッキング溶液0.5 mlを加え60分間室温でインキュベートする。
- ブロッキング溶液を除去し、0.225ミリリットル一次抗体溶液を加える。
- 4℃で2時間または一晩℃の室温でインキュベート
- 一次抗体溶液を除去し、優しく里リンス当たりPBS 0.5 mlでNSE回。
- 0.225ミリリットル二次抗体溶液を追加。 60分間室温で暗所でインキュベートする。
- 二次抗体溶液を除去し、穏やかにリンス当たりPBS 0.5mlを二回すすいでください。
- 50％グリセロール/ PBS溶液（V / V）またはうまく表面の底をカバーするのに十分なVectashield 0.3 mlを加え。
- 4時ホイルに包んで落射蛍光顕微鏡またはストアを持つ画像セル℃の
6。代表的な結果
図1。NZCsが1cm 2当たり20万セルで播種、E17.5胚から精製し、24時間計、37℃でインキュベートした。細胞は、免疫蛍光染色の前にライカDMのIRB倒立顕微鏡と位相差により画像化した。文化の中で24時間後にNZCsの（）20X位相コントラストビュー。 （B）細胞は、ネフロンの前駆細胞（赤）と二次のAlexa Fluor 568結合ロバ抗ウサギのための特異的ウサギ抗PAX2抗体を用いて固定し、染色した。青色の核はDAPIで対比に注意してください。文化の中で24時間後のネフロン前駆細胞のクラスターの（C）40X位相コントラストのビュー（中央）。 （D）にLacZ + Foxd1プロモーターの制御下でβ-ガラクトシダーゼを発現しFoxd1 LacZの株の胚。Foxd1から分離されたNZCsの40Xの画像は、発展途上腎臓の腎性ゾーン内の間質細胞集団に発現している。細胞は、F -アクチンマーカーファロイジン（オレゴングリーン一次複合体）、核染色DAPI（青）とウサギ抗β-ガラクトシダーゼで染色した- Foxd1の検出のための（二次のAlexa Fluorロバ抗ウサギ568）+間質細胞（赤）。
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Discussion
このプロトコルでは、胚性腎臓の腎性ゾーンから細胞を単離、培養する方法を説明します。それは最初に腎性ゾーン（ブランクら 、2009）の細胞へのBMP7治療の効果の研究の一環として公表された方法の開発である。初期の研究では、NZC人口の中で表されるセルのタイプを特徴づけるために一連の実験を行った。 （のSrinivas ら、2001; Yu らを 、簡単に言えば、皮質の間質（Foxd1 + / lacZ）に（。Hatiniら 、1996）のための遺伝的レポーターからNZCsの精製は、（R26 rEYFP Hoxb7 + / CRE）ダクト収集。 、2002）、およびキャップ間充織は（BMP7 + / lacZの ）（ゴダンら 、1998）収穫NZCsの約35％は皮質の間質であることを明らかに、52％が上限の間充織で、ダクトの汚染を収集すると、0.04％未満を表している。 R26 rEYFP株（オックスボローら、2004;。。のSrinivas ら、2001）BMP7 + / CREを用いて実験をマーキングリネージュNZCsの約10％がBMP7表現を差別化し、失われているキャップの間充織の系統の細胞であってもよいことを示した。 7AADと生存率の研究は約95％の孤立NZCsの生存率を示した。我々は最近、フローサイトメトリー選別を通してNZCs内細胞サブセットを分離することで成功を経験している。しかし、腎性ゾーンの亜集団のそれぞれに固有の膜関連マーカーの不足は、これらの分析を制限している、と蛍光マーカー遺伝子を持つマウスから派生した現在のところ唯一の細胞が可能です。
このプロトコルの有効性は、解離ステップの速度に大きく依存する。腎臓の酵素消化の前に時間の短い期間HBSSに残っている成長因子の刺激の増加に、細胞の生存と応答性の両方。短い準備時間は、したがって、より高い細胞の生存とより堅牢な応答で両方をもたらす。細胞ペレットを簡単に重要な細胞の損失につながる邪魔されている細胞懸濁液をスピンした後上清を除去するときにまた、注意が必要です。
胚の器官培養を（Grobstein、1953a; Grobstein、1953b）を記述クリフォードGrobsteinの初期の作品以来、腎臓は、器官形成と発展における上皮と間葉細胞間の相互作用のモデル系となっています。最近のmicroanatomic遺伝子発現の研究は、これらの細胞区画の各々 （ブランスキルら 、2008）内の細胞型の予期せぬ複雑さを明らかにした、とそのようなNZC文化などの補完的な方法はnephrogenesis中にこれらの細胞間の相互関係を理解する必要があります。私たちの主要な細胞の研究の究極の目標は、腎性ゾーンの細胞が無期限の両方大人のnephrogenesisと生着の研究のためにin vitroで拡張することができる条件を定義することです。 NZC培養系ではこの目標に向けた重要なステップである、と私たちの研究室の目的で継続的な研究は、これらの細胞の増殖制御のメカニズムを定義する。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIDDK（LO）、アメリカ心臓協会（AB）、スウェーデンとKungliga Fysiografiska Sällskapet、ルンド、スウェーデン（UB）のウェナーグレングレン基礎からポスドクからR01 DK078161によってサポートされていました。追加のサポートは、病理組織学、バイオインフォマティクスおよびFACS用メイン医療センター研究所の中核施設（2P20RR18789 - 06でサポートされている）とMMCRIの動物施設で提供されていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
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